中藥益精方對(duì)精索靜脈曲張大鼠精子質(zhì)量的影響

李維仁 褚云香 賈金銘

1.北京航天總醫(yī)院泌尿外科（北京 100076）；2.應(yīng)急總醫(yī)院消化內(nèi)科（北京 100028）；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院男科（北京 100053）

精索靜脈曲張(varicocele,VC)是引起男性不育的常見(jiàn)原因，成年男性發(fā)病率為10%～25%，精液常規(guī)異常的病人中，VC 患病率為25%～40%[1-2]。VC 導(dǎo)致不育癥的病理機(jī)制雖然也有大量的研究，如睪丸溫度增高、毒素返流、自由基損害等學(xué)說(shuō)，但迄今為止，仍未能清楚解釋VC 降低生育力的確切機(jī)制[3]。西醫(yī)臨床中，VC 的治療以手術(shù)為主，但是對(duì)有些患者的精液質(zhì)量改善也不是很理想。而中醫(yī)臨床中發(fā)現(xiàn)，中藥益精方對(duì)不育患者有較好的療效[4-6]。為彌補(bǔ)西醫(yī)治療方案的不足，我們有必要探索一條新的中西醫(yī)結(jié)合的治療道路，以便更好的服務(wù)于廣大的VC不育患者。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

動(dòng)物及分組：SPF 級(jí)SD 雄性大鼠30 只(北京大學(xué)第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重(180±20)g。常規(guī)飼養(yǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物自由攝食飲水，室溫控制在20-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%。適應(yīng)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將雄性SD 大鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只，即對(duì)照組(假手術(shù)組)、VC模型組和治療組。

二、藥物及試劑

益精方是由當(dāng)歸、紅花、菟絲子、五味子、仙靈脾等12 味中草藥組成，并由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥劑科按含生藥量2.6g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)煎制成標(biāo)準(zhǔn)濃度的益精方水煎劑。精液分析儀（北京偉力）、TUNEL染色試劑盒（Roche 公司）、MDA試劑盒（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)、精子核DNA完整性檢測(cè)試劑盒(精子染色質(zhì)擴(kuò)散法)（深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司）。

三、造模及給藥方法

精索靜脈曲張大鼠動(dòng)物模型的制備[6]：SD 大鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，隨機(jī)分組，進(jìn)行手術(shù)。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開(kāi)腹分離，并于左腎靜脈與下腔靜脈之間用4-0 絲線將直徑約為0.8mm 的金屬桿與左腎靜脈一起結(jié)扎。抽出金屬桿，使左腎靜脈復(fù)通，造成左腎靜脈的部分狹窄。對(duì)照組取假手術(shù)組大鼠，即顯露左腎靜脈過(guò)程相同，但不結(jié)扎。

造模成功后，益精方治療組給予益精方中藥水煎劑按生藥1mL/(100 g體重·d)灌胃，給予每天1次，連續(xù)8 周，對(duì)照組及模型組給予對(duì)等量的水灌胃，8 周后取材，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

四、標(biāo)本采集

造模8 周后取材，先稱重動(dòng)物，用頸脫臼法處死大鼠，剪開(kāi)腹腔，暴露左側(cè)精索靜脈，再次用千分尺在髂腰靜脈水平測(cè)量左側(cè)精索靜脈的外徑，以直徑增加2倍或更多為精索靜脈曲張模型造模成功，測(cè)量后切取睪丸、附睪。附睪取精液進(jìn)行精子活力、脂質(zhì)氧化水平、精子DNA碎片率等相關(guān)檢測(cè)。睪丸組織用Bouin液固定。常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5μm，進(jìn)行HE染色。

五、檢測(cè)項(xiàng)目及方法

通過(guò)精液分析及約翰遜評(píng)分（Johnson score）評(píng)估大鼠睪丸的生精功能。通過(guò)睪丸TUNEL染色觀察生精細(xì)胞凋亡情況。通過(guò)ELLISA檢測(cè)大鼠附睪組織MDA的水平，評(píng)估脂質(zhì)氧化的水平。精子DNA 完整性檢測(cè)用染色質(zhì)擴(kuò)散法（sperm chromatin dispersion，SCD），計(jì)算精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)量資料組間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

益精方治療組與較模型組比較，精索靜脈曲張大鼠睪丸約翰遜評(píng)分（Johnson score）(9.2±0.51 vs 8.1±0.42 P ＜0.05)、精子活率(59.81±5.27 vs 53.32±4.95 P ＜0.05)、附睪MDA 含量(7.53±1.86 vs 10.40±2.58 mmol/g P ＜0.05)、精子 DNA 碎 片 率 (13.30±2.39 vs 18.36±3.29 % P ＜0.01）、睪丸生精細(xì)胞凋亡率(2.87±1.21 vs 5.2±1.74%P ＜ 0.05)差異顯著。

表1 益精方治療組對(duì)約翰遜評(píng)分、精子活率、MDA水平、DFI水平、生精細(xì)胞凋亡的影響

圖1 大鼠睪丸HE染色

圖2 大鼠睪丸TUNEL染色

討 論

VC 是男性不育癥的常見(jiàn)病因之一。目前西醫(yī)治療多采用精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)，手術(shù)只能解決精索靜脈血液返流的問(wèn)題，而對(duì)部分患者不能從根本上改善睪丸生精功能的問(wèn)題。目前西醫(yī)方法尚無(wú)特效藥物，但是中醫(yī)藥在此方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，VC不育屬筋瘤、筋疝、無(wú)子等范疇，其病因病機(jī)復(fù)雜，概括起來(lái)不外虛實(shí)二端，以腎虛為本，血瘀為標(biāo)，腎虛導(dǎo)致血瘀，血瘀加重腎虛，互為因果，相互影響，造成生殖之精化生障礙，從而導(dǎo)致不育。益精方由當(dāng)歸、紅花、丹參、仙靈脾、菟絲子等組成。仙靈脾、菟絲子補(bǔ)腎以生精，當(dāng)歸、紅花、丹參等活血化瘀，標(biāo)本兼顧，使腎氣得以充，瘀血得以去，生精功能得以恢復(fù)，達(dá)到治療不育的目的[4-6,8-9]。

研究表明，活性氧(ROS) 增多及抗氧化能力的下降導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷精子DNA[10]。其機(jī)制可能與疾病、環(huán)境和生活方式等因素所導(dǎo)致的生精細(xì)胞的凋亡、過(guò)多氧自由基的產(chǎn)生及染色質(zhì)包裝過(guò)程異常有關(guān)[11-13]。DNA 受損的精子即使有能力受精，后期胚胎發(fā)育也有可能出現(xiàn)異常。不育和后代基因異常也和父系精子DNA損傷有關(guān)[14-15]。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，益精方可以減少氧化應(yīng)激損傷，抵抗氧化應(yīng)激，可介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬抑制Leydig 細(xì)胞凋亡，從而改善少弱精子癥的精子質(zhì)量[6,16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，精索靜脈曲張伴精子DFI 升高的患者術(shù)后聯(lián)合維生素E或輔酶Q10 等抗氧化治療可以進(jìn)一步降低精子DFI，提升精子質(zhì)量[17]。我們也發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，治療組大鼠睪丸MDA含量顯著降低，這也證實(shí)了益精方可以減少睪丸的氧化損傷。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)益精方治療組大鼠睪丸的生精細(xì)胞凋亡減少，DNA碎片率減少。因此，我們推測(cè)，益精方的抗氧化、抗凋亡效應(yīng)可能起到保護(hù)VC 大鼠的睪丸的作用。

綜上，中藥益精方能提高精索靜脈曲張大鼠的精子質(zhì)量，其抗氧化效應(yīng)可能在精索靜脈曲張大鼠的睪丸保護(hù)中扮演重要的角色。