基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討菟絲子-枸杞子治療少弱精子癥的作用機制*

孟繁超 李海松 王 彬 馮雋龍1， 鄧 省 鮑丙豪 鄺 浩 王浩浩 王繼升**

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（北京 100029）；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院（北京 100700）

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念源于系統(tǒng)生物學(xué)和信息生物學(xué)?；谙到y(tǒng)生物學(xué)方法，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念最早由Li 等人[1]提出。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以提供對網(wǎng)絡(luò)理論和系統(tǒng)生物學(xué)原理的完整或部分理解，它被認(rèn)為是藥物發(fā)現(xiàn)的下一個范例[2]。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法已被用于研究“復(fù)合-蛋白質(zhì)/基因-疾病”途徑，能夠從網(wǎng)絡(luò)的角度描述生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間的復(fù)雜性，具有與中醫(yī)相似的整體哲學(xué)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以根據(jù)目標(biāo)分子、生物功能和生物活性化合物形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，滿足中藥配方的天然特性，從系統(tǒng)的角度，在分子水平闡明中藥配方的作用機理[3-5]。

本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測藥對菟絲子-枸杞子（SC-FL）的活性成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測SC-FL治療少弱精子癥的關(guān)鍵活性成分和靶點，為后續(xù)的實驗研究提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

（一）藥物制備

中藥免煎顆粒菟絲子和枸杞子均購自康仁堂公司，為同一批號。取菟絲子和枸杞子各15g,用去離子水將其充分溶解為混懸液，以備高效液相色譜檢測。

（二）實驗試劑

甲醇(Methanol)，CAS：67-56-1，純度：LC-MS 級，品牌：Merck KGaA；乙腈(Acetonitrile)，CAS：75-05-8，純度：LC-MS級，品牌：Merck KGaA；甲酸(Fomic acid)，CAS：64-18-6，純度：LC-MS級，品牌：西亞試劑。

（三）實驗儀器

超高效液相色譜儀，型號: Thermo Vanquish UHPLC，品牌：Thermo Fisher Scientific；高分辨質(zhì)譜，型號:Q-Exactive HF，品牌：Thermo Fisher Scientific；色譜柱，型號:Zorbax Eclipse C18，品牌：Agilent technologies。

（四）樣品提取

主要處理流程如下：

（1）將制備好的混懸液進(jìn)行干燥、研磨等預(yù)處理;

（2）稱取10 g藥物置于50 mL 離心管中，加入10 mL乙腈提取溶劑，混勻后置于水平振蕩器中振蕩10 min，4500 r/min 離心5 min，待凈化;

（3）取上清液1 mL 于1.5 mL 離心管中，渦旋1 min，12000 r/min 高速離心 10 min 后，使用 0.22 μm 微孔濾膜進(jìn)行過濾;

（4）將樣品置于機器進(jìn)行測試。

（五）實驗條件

（1）儀器分析平臺：LC- MS (Thermo，Ultimate 3000LC，Q Exactive HF)

（2）色 譜 柱 ：C18 色 譜 柱 (Zorbax Eclipse C18(1.8μm*2.1*100mm))

（3）色譜分離條件為：柱溫為30℃；流速0.3mL/min；

流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：純乙腈；進(jìn)樣量為2μL，自動進(jìn)樣器溫度4℃，見表1。

表1 液相色譜流動相條件

二、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)材料方法

（一）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫

（二）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.菟絲子-枸杞子靶點預(yù)測

從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )和Swiss Target Prediction（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，檢索代謝物全譜分析所得到的化合物的靶點，納入標(biāo)準(zhǔn)為Probability＞0。從人類基因數(shù)據(jù)庫（Gene-Cards，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )中獲取少弱精子癥的靶點。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)復(fù)合靶點與少弱精子癥靶點相交，并將獲得的相交靶點視為SC-FL 治療少弱精子癥的潛在靶點，以便進(jìn)一步網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析[6]。

2.預(yù)測疾病靶點

選擇GeneCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，尋找與疾病相關(guān)的基因，關(guān)鍵詞設(shè)置為“少弱精子癥(oligoasthenozoospermia)”，取相關(guān)數(shù)據(jù)庫的交集，刪除重復(fù)的基因，將活性成分相關(guān)的靶點和基因相對應(yīng)，最終得到SC-FL活性成分的作用靶點信息數(shù)據(jù)集[7]。

3.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）

使用String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/ )，分析已知和預(yù)測蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的直接（結(jié)構(gòu)）和間接（功能）相關(guān)相互作用是通過自動預(yù)測、生物體之間的知識轉(zhuǎn)移以及從其他數(shù)據(jù)庫聚合的相互作用來計算的。本研究使用String數(shù)據(jù)庫來確定可能的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）。為了提高獲得數(shù)據(jù)的可靠性，進(jìn)一步過濾PPI，最小交互得分為0.40。篩選出的PPI 用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析[8]。

4.網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與分析

采用版本3.7.1 為Cytoscape 軟件，建立草藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein ProteinInteraction network，PPI network）。通過Network Analyzer plugin（Cytoscape 內(nèi)置插件）分析計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，獲取中藥復(fù)方靶病網(wǎng)絡(luò)信息，包括節(jié)點度（Degree，DG）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality，BC）、緊密中心性( Closeness Centrality，CC）。通過使用Cytoscape插件cytohubba 進(jìn)一步分析PPI 網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步設(shè)置節(jié)點顏色以反映度值以識別關(guān)鍵目標(biāo)[9]。

5.Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析

（1）將SC-FL治療少弱精子癥的相關(guān)靶點導(dǎo)入生物信息學(xué)注釋數(shù)據(jù)庫David（版本6.8，https://david.ncifcrf.gov/）；

（2）將Select Identifier 設(shè)置為 Officical Gene Symbol，將 List Type 設(shè)置為Gene List，物種選擇人類，并選擇Gene Ontology（GO)下的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）以及細(xì)胞組成（cellular component，CC）后，進(jìn)行GO富集分析；

（3）選擇 Pathway 分析中 KEGG Pathway，設(shè)定顯著性為P ＜0.01，進(jìn)一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的主要功能注釋與體內(nèi)通路；

（4）使用ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/），繪制條形圖[10]；

（5）保存SC-FL 治療少弱精子癥的GO 分析和KEGG通路分析結(jié)果。

結(jié) 果

一、SC-FL的化學(xué)成分分析

在進(jìn)行保留時間矯正、峰識別、峰提取等工作時，使用Compound Discoverer 3.1。使用ThermomzValut本地數(shù)據(jù)庫和ThermomzCloud在線數(shù)據(jù)庫根據(jù)二次質(zhì)譜信息對物質(zhì)進(jìn)行鑒定。SC-FL的全譜鑒定結(jié)果如圖1所示。

圖1 SC-FL全譜鑒定結(jié)果離子圖

二、靶點收集

從 SwissTargetPrediction 和 PubChem 獲 得 SC-FL靶點795個，從GeneCard獲得少弱精子癥相關(guān)靶點432個。最終獲得68個與SC-FL和少弱精子癥相關(guān)的重疊靶點。圖2 顯示與SC-FL 和少弱精子癥相關(guān)的重疊靶點，然后通過string數(shù)據(jù)庫分析PPI。

圖2 SC-FL和少弱精子癥均相關(guān)的重疊靶點

三、網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和拓?fù)浞治?/h3>

利用Cytoscape構(gòu)建中藥復(fù)方靶病網(wǎng)絡(luò)，中藥復(fù)方靶病網(wǎng)絡(luò)圖如圖3所示。通過軟件中的“Network analysis”進(jìn)行拓?fù)浞治?。把“度”參?shù)最高的4種化合物認(rèn)定為關(guān)鍵化合物，分別為 Luteolin，Kaempferol，Adenosine monophosphate 和 3-Methoxy-5，7，3′，4′-tetrahydroxyflavone。網(wǎng)絡(luò)分析后前4位化合物的信息如表2所示。

圖3 草藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

表2 網(wǎng)絡(luò)分析后前四化合物信息表

PPI 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)的結(jié)果，如圖4（a）所示，利用Cytoscape 軟件中的插件，cytohubba 進(jìn)行分析，將“度”參數(shù)的前10的靶點認(rèn)定為關(guān)鍵靶點，分別為AKT1（絲氨酸/蘇氨酸激酶1），ESR1（雌激素受體1），CASP3（半胱天冬酶3），EGFR（表皮生長因子受體），MAPK1（絲裂原激活的蛋白激酶1），TNF（腫瘤壞死因子），AR（雄激素受體），PTGS2（前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2），NR3C1（核受體亞家族3C 組成員1），TLR4（Toll 樣受體 4）。排名前10關(guān)鍵靶點信息表3和圖4（b）所示。

表3 排名前10關(guān)鍵靶點信息表

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵靶點圖

四、GO和KEGG富集分析

從對68 個靶點進(jìn)行的富集分析的結(jié)果可以看出，SC-LF 涉及的細(xì)胞生物學(xué)過程有44 個，細(xì)胞成分有8個，分子功能有9 個，信號通路有51 個（P＜ 0.01）。依據(jù)P值的大小，選擇排名處于前5 位的通路，分別為Pathways in cancer(癌癥通路)、Proteoglycans in cancer(蛋白聚糖在癌癥中的通路)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt 通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1 通路)、Prostate cancer(前列腺癌通路)。見圖5。

圖5 GO和KEGG富集分析

討 論

一、補腎生精法與SC-FL

腎精虧虛是少弱精子癥的核心病機，補腎生精為重要治則[11]。枸杞屬肝腎經(jīng)絡(luò)，味甘、平，具有滋補肝腎、補精明目的功效。菟絲子性質(zhì)溫和，味甘。具有補腎填精、養(yǎng)肝明目、健脾止瀉、固沖安胎之功?！侗静菁酚小把a而不重、溫而不燥”之說。從中藥配伍方面看，枸杞注重補腎陰，菟絲子部分補腎陽，陰陽兼用；同時，這兩種藥物性質(zhì)溫和，屬于肝腎經(jīng)絡(luò)。溫陽而不燥，滋陰而不寒，微調(diào)陰陽，平衡陰陽，達(dá)到陰陽互根，陰陽互用的效果，益氣養(yǎng)子。

二、SC-FL有效成分分析

木犀草素（Luteolin），山奈酚（Kaempferol），一磷酸腺苷（Adenosine monophosphate）和 3-O-Methylquercetin（3-O-甲基槲皮素）（3-Methoxy-5，7，3′，4′-tetrahydroxyflavone），是草藥-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖分析排名前四的活性成分。

Luteolin屬于黃酮類物質(zhì)，擁有類雌激素、抗氧化、抗炎等多種作用[12]。有研究指出其具有類FSH 作用，可促進(jìn)睪酮和雌二醇的分泌。并且發(fā)現(xiàn)，它在FSH 的促分泌作用上效果顯著[13]。

Kaempferol與Luteolin同屬于黃酮類化合物，在抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)線粒體膜電位方面療效顯著[14-17]。同時，它能夠提高精子活力的主要原因之一就是因為其具備清除自由基的能力[18-19]。此外，Kaempferol還可以減少細(xì)胞脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和細(xì)胞凋亡，其機制與增加細(xì)胞抗氧化酶的含量有關(guān)[20]。Adenosine monophosphate 是新陳代謝的重要調(diào)節(jié)劑，Yang X[21]等研究發(fā)現(xiàn)，它的累積會導(dǎo)致睪丸代謝紊亂，進(jìn)而影響生殖功能。

3-Methoxy-5，7，3′，4′-tetrahydroxy-flavone 具有抗氧化、抗炎、抗菌和心血管保護(hù)等作用，可以通過減少炎癥反應(yīng)來提高精子活力與CYP19A1、AKT1、ESR2等靶點相連。Diao R等[22]采集了56名白細(xì)胞減少癥不育男性和44名正常生育男性的精液樣本。通過計算機輔助精液分析（CASA）（10μMol/L）測定槲皮素孵育前后的精子活力，說明槲皮素對白細(xì)胞介導(dǎo)的不育男性精子的抗氧化損傷起到了明顯的保護(hù)作用。

三、SC-FL有效成分作用靶點網(wǎng)絡(luò)分析

AKT1、ESR1、CASP3、EGFR、MAPK1、TNF、AR、PTGS2、NR3C1、TLR4，是最終獲得68個與SC-FL和少弱精子癥相關(guān)的重疊靶點中排名前10的重要靶點。

AKT1（AKT Serine/Threonine Kinase 1，AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1），Akt 在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用，其活性是精子活力和線粒體活性氧的關(guān)鍵[23，24]。PI3K/AKT 信號通路參與多種生物學(xué)功能，包括DNA合成、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[24]。有研究指出，不育男性的精子PI3K/Akt通路的磷酸化水平與正常男性精子相比顯著下調(diào)[25]。

ESR1（Estrogen Receptor 1，雌激素受體1），雌激素受體是一種與雌激素應(yīng)答DNA 元件相結(jié)合的激活轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族的一員，作為媒介來轉(zhuǎn)導(dǎo)雌激素的多向性效應(yīng)，有雌激素受體α(ESR1)與雌激素受體β(ESR2)兩種亞型[26,27]。ESR1 在維持男性生殖系統(tǒng)正常發(fā)育和功能以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，其所表達(dá)的雌激素受體α可通過經(jīng)典激活途徑、非經(jīng)典激活途徑和生長因子受體激活途徑調(diào)節(jié)精子的發(fā)生和成熟，維持睪丸微環(huán)境的正常[28]。據(jù)報道，缺乏ESR1 的雄性小鼠的精子會出現(xiàn)精子異常，受精率下降[29]。有研究指出，ESR1 在睪丸支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、生殖細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞液中表達(dá)[30]。

CASP3（Caspase-3，半胱天冬酶3）是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要蛋白[31]。它的表達(dá)上調(diào)會對精子質(zhì)量產(chǎn)生不利影響，從而導(dǎo)致生殖細(xì)胞死亡[32-34]。

EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生長因子受體），表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactor receptors，EGFRs）是一類被大量肽配體激活的受體酪氨酸激酶，可誘導(dǎo)形成具有活性的自身（反式）磷酸化受體同源/異二聚體。多細(xì)胞生物進(jìn)化的關(guān)鍵一步是受體酪氨酸激酶(RTK)的出現(xiàn)。長期以來，EGFR 一直被認(rèn)為是RTK 行為的原型，對細(xì)胞功能和人類健康至關(guān)重要[35]。EGFR 是調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞生長、存活、增殖和分化的最重要的受體之一。

精子頂體反應(yīng)是受精的關(guān)鍵步驟，是一種鈣依賴性分泌事件，必須在受精前完成。EGFR 激活后，會發(fā)出Ca2+信號，使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度瞬間增加[36]，促進(jìn)精子獲能，發(fā)生頂體反應(yīng)，提升生育能力[37]。

MAPK1（Mitogen-Activated Protein Kinase 1，絲裂原激活的蛋白激酶1），絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）是哺乳動物中存在的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[38]。它可以通過細(xì)胞外信號激活，例如物理和化學(xué)脅迫，細(xì)胞因子，生長因子等。在下一步中，它可以通過三個級聯(lián)反應(yīng)激活下游轉(zhuǎn)錄因子，將各種類型的外部刺激轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與細(xì)胞增殖，分化，轉(zhuǎn)化，炎癥和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。有研究證實，MAPK 通路的激活對小型豬精子頂體反應(yīng)至關(guān)重要，將MAPK 途徑抑制后，頂體反應(yīng)減少，引發(fā)不育[39]。

睪酮等雄激素是正常男性生殖發(fā)育所必需的類固醇激素，并且雄激素通過AR（Androgen Receptor，雄激素受體）發(fā)揮作用，AR在睪丸中的信號傳導(dǎo)對于精子的產(chǎn)生至關(guān)重要[40]。PTGS2（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2，前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2），前列腺素內(nèi)轉(zhuǎn)油氧化物合成酶（也稱為COX）是速率限制酶，其在植物酸的損傷細(xì)胞膜產(chǎn)物中轉(zhuǎn)化為前列腺蛋白，并且它們存在至少2個同種型，PTGS1（COX-1）和PTGS2中存在（COX-2）。PTGS2表達(dá)是細(xì)胞因子和生長因子誘導(dǎo)的，并且在炎癥期間上調(diào)。此外，PTGS2 蛋白在一些睪丸管周細(xì)胞中表達(dá)。據(jù)我們所知，目前僅在不育男性的管周細(xì)胞中描述了PTGS2 表達(dá)[41,42]。

四、PI3K-Akt 信號通路可能是SC-FL 治療少弱精子癥的關(guān)鍵通路

在精原細(xì)胞的更新、修復(fù)、增殖等功能與PI3K/Akt通路相關(guān)mRNA 及蛋白中有著密不可分的關(guān)系[43-45]。通過PI3K/Akt 通路可增加和維持生殖細(xì)胞數(shù)量，因此，這條通路對于細(xì)胞增殖而言至關(guān)重要[46]。此前，課題組的相關(guān)研究表明，調(diào)控精子數(shù)量和活力的重要通路之一，即為 PI3K/Akt通路[47]。

PI3K/AKT通路上相關(guān)mRNA及蛋白在促進(jìn)DNA合成、調(diào)控細(xì)胞周期以及抑制細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[48]，比如對調(diào)控精原細(xì)胞的增殖、凋亡方面[49]。PI3K/AKT 通路上游有 PI3K 、GFRα-1、RET 等分子，下游涉及到 AKT、Bcl-2、Bax、Bad 等分子。Bcl-2有線粒體通透性過渡孔之稱，與線粒體凋亡通路密切相關(guān)[50-51]。Bcl-2家族的蛋白有兩種的截然不同的功能，其中以Bax、Bad為代表的蛋白，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而另外一種以Bcl-2 為代表的蛋白，可以抑制細(xì)胞凋亡[52]。

結(jié) 語

SC-FL治療少弱精子癥具有多靶標(biāo)、多途徑、多細(xì)胞、綜合作用的特點。其發(fā)揮作用的機制與增殖凋亡、炎癥反應(yīng)和能量代謝等息息相關(guān)，預(yù)測發(fā)現(xiàn)可能與PI3K/AKT信號通路密不可分。