亮腹釉小蜂產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

陳玲玲，黃承志，毛潤(rùn)乾，修寶林，高 晶，葉鳳嫻，Mubasher Hussain，邱棟梁，申寶營(yíng)，王朝紅*

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2. 廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所/廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室/廣東省礦物油農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，廣州 510260）

柑橘木虱Diaphorina citriKuwayama是柑橘類(lèi)植物的重要害蟲(chóng)之一，也是柑橘毀滅性病害——柑橘黃龍病最主要的傳播媒介，因此防控柑橘木虱是柑橘產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵舉措。亮腹釉小蜂Tamarixia radiate(Waterston)是柑橘木虱的優(yōu)勢(shì)寄生蜂，常寄生柑橘木虱 4～5齡的若蟲(chóng)[1,2]。一頭亮腹釉小蜂通過(guò)取食和寄生的方式可殺滅柑橘木虱若蟲(chóng)多達(dá)500頭。研究表明[3]，柑橘園釋放亮腹釉小蜂可有效控制柑橘木虱，在美國(guó)得克薩斯州，大量釋放亮腹釉小蜂可使柑橘木虱種群數(shù)量降低 91.2%[4]。目前，亮腹釉小蜂已被世界各地的柑橘種植區(qū)引入用于防控柑橘木虱[5-7]，并在巴西[8]、墨西哥[9]、美國(guó)加利福尼亞州[10]、得克薩斯州[4]和佛羅里達(dá)州等地[11]實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。在中國(guó)，廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所于2020年實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[12]。

然而，不同地區(qū)生產(chǎn)的亮腹釉小蜂對(duì)柑橘木虱的寄生效率有明顯差異。在美國(guó)佛羅里達(dá)州，亮腹釉小蜂在春夏季寄生率相對(duì)較低，平均寄生率＜20%，而在秋季平均寄生率可達(dá) 60%以上[5]；在巴西，寄生率為 43.3%～88.8%[8]；在墨西哥西部，平均寄生率達(dá) 60.58%[14]。這可能受釋放地溫度、濕度等環(huán)境因素影響，也與亮腹釉小蜂的質(zhì)量相關(guān)。尤其是同一釋放地區(qū)寄生率的大幅度波動(dòng)，極可能與寄生蜂質(zhì)量有直接關(guān)系。因此，建立亮腹釉小蜂質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其生產(chǎn)和應(yīng)用有重要意義。

建立亮腹釉小蜂質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，首先要保證產(chǎn)品的純度，在形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)方面確認(rèn)物種。研究表明，亮腹釉小蜂的寄生能力與其活動(dòng)能力、發(fā)育狀態(tài)、個(gè)體大小及性別比例等因素息息相關(guān)[8]。體色光鮮、健全的亮腹釉小蜂才能有效寄生柑橘木虱，殘肢或殘翅的雌蜂存活困難，無(wú)法進(jìn)行寄生活動(dòng)。亮腹釉小蜂營(yíng)兩性生殖，僅雌性可以寄生，雄性本身并無(wú)寄生能力。因此，維持較高水平的雌性比例（雌蜂率），才能保證亮腹釉小蜂對(duì)柑橘木虱的防控效果。亮腹釉小蜂在20 ℃左右貯存3 d，仍能保持較高的存活率和寄生能力，但在高溫條件下其死亡率大大升高[8]。生產(chǎn)上獲得亮腹釉小蜂產(chǎn)品后，需盡快將其轉(zhuǎn)移至氣候箱保存，并盡快運(yùn)送至田間釋放。但在實(shí)際生產(chǎn)中往往需要一定時(shí)間，檢測(cè)天敵產(chǎn)品短時(shí)間內(nèi)不同溫度下的存活能力可反映產(chǎn)品質(zhì)量。寄生能力是亮腹釉小蜂產(chǎn)品質(zhì)量好壞最直接的表現(xiàn)。前人研究表明，亮腹釉小蜂在不同地區(qū)對(duì)柑橘木虱的寄生能力有明顯的差異，在菲律賓，田間的寄生率為 15%～67%[7]；在中國(guó)臺(tái)灣，寄生率為30%～87%[6]；在美國(guó)，田間寄生率可高達(dá)91.2%[4]；對(duì)亮腹釉小蜂產(chǎn)品的寄生能力進(jìn)行檢測(cè)極有必要。因此，本文選定亮腹釉小蜂的形態(tài)特征、分子特征、外觀（體色暗淡率和殘肢殘翅率）、包裝數(shù)量、雌蜂率、寄生率及不同貯存溫度條件下寄生蜂死亡率（15 ℃、25 ℃及30 ℃）共7個(gè)項(xiàng)目作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，以廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所生產(chǎn)的亮腹釉小蜂為測(cè)試對(duì)象進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果建立和制定亮腹釉小蜂成蟲(chóng)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 寄主植物與供試蟲(chóng)源

年橘Citrus reticuiataBlanco cv. Nianju購(gòu)自廣州，種植于廣州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心溫室，室內(nèi)陽(yáng)光充足，定期澆水施肥，及時(shí)修剪，保證充足的嫩梢嫩枝供試驗(yàn)使用。

柑橘木虱種群采自廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)室，以年橘為植物載體飼養(yǎng)于網(wǎng)室內(nèi)作為試驗(yàn)用蟲(chóng)。

亮腹釉小蜂為廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所生產(chǎn)產(chǎn)品，成蟲(chóng)，每瓶200頭左右（瓶身標(biāo)識(shí)：每瓶含亮腹釉小蜂200頭）。

1.2 儀器設(shè)備

PCR儀（廣州市昊洋貿(mào)易有限公司）、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）、XW-80A旋渦混合儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）、MSHOT體視顯微鏡MZ62（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠）、60目防蟲(chóng)袋、吸蟲(chóng)器（湖北廣之應(yīng)科技有限公司）

1.3 物種形態(tài)特征

物種形態(tài)特征是物種種類(lèi)鑒定的基礎(chǔ)。對(duì)亮腹釉小蜂產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)首先應(yīng)進(jìn)行形態(tài)鑒定，保證物種形態(tài)特征與前人描述[8,15]相吻合。本文隨機(jī)選擇5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中10頭（5頭雌、5頭雄）進(jìn)行物種形態(tài)鑒定。

1.4 物種分子特征

近年來(lái)利用基因序列對(duì)物種進(jìn)行鑒定的方法得到廣泛的推廣和使用。目前在GeneBank上已能查到亮腹釉小蜂的多個(gè)基因序列特征，本文根據(jù)Folmer等[14]和Barr等[15]的試驗(yàn)方法，分別利用細(xì)胞色素氧化酶I（cytochrome oxidase subunit I，COI）的保守區(qū)域和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、2（internal transcribed spacer，ITS-1、ITS-2）進(jìn)行物種分子鑒定。

隨機(jī)抽樣選擇5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中1頭進(jìn)行總DNA的提取，試劑盒選用天根生物血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（DP304），試驗(yàn)步驟嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明。PCR反應(yīng)使用50 μL體系，DNA模板2 μL，引物各0.5 μmol/L（表1），25 μL Mix（2X SanTaq PCR Mix 預(yù)混液，含藍(lán)染料，生工生物B532061），用無(wú)菌水補(bǔ)足。

表1 分子鑒定選用的上下游引物Table 1 Upstream and downstream primers selected for molecular identification

反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃（5 min）→變性94 ℃（30 s）→退火50～60 ℃（30 s）→延伸72 ℃（30～60 s/kb）→延伸72 ℃（10 min）→保存4 ℃（∞），其中第2步變性至第4步延伸重復(fù)35個(gè)循環(huán)。

1.5 雌蜂體色及殘疾檢測(cè)

利用體式顯微鏡觀察亮腹釉小蜂是否體色暗淡，是否殘翅殘肢。隨機(jī)選擇 10瓶亮腹釉小蜂，每?jī)善繛?個(gè)樣本，從兩瓶中取200頭雌性亮腹釉小蜂測(cè)試，記錄體色暗淡或出現(xiàn)殘翅殘肢的雌蜂數(shù)量，并分別統(tǒng)計(jì)體色暗淡和殘肢殘翅個(gè)體數(shù)量占總數(shù)的比率（體色暗淡率和殘肢殘翅率），共檢測(cè)5次。

1.6 數(shù)量檢測(cè)

隨機(jī)選擇5瓶亮腹釉小蜂進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)，記錄每瓶中亮腹釉小蜂的實(shí)際數(shù)量，計(jì)算每瓶亮腹釉小蜂數(shù)量占包裝瓶標(biāo)識(shí)數(shù)量（200頭/瓶）的比率，每瓶為一個(gè)樣本，共檢測(cè)5個(gè)樣本。

1.7 雌蜂率檢測(cè)

本文隨機(jī)選擇5瓶亮腹釉小蜂，記錄其雌蜂數(shù)量，統(tǒng)計(jì)雌蜂率，重復(fù)5次。

1.8 不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率檢測(cè)

隨機(jī)選擇15瓶亮腹釉小蜂并分成3組，每瓶取100頭；將各組亮腹釉小蜂分別置于溫度15 ℃（低溫）、25 ℃（常溫）、30 ℃（高溫），相對(duì)濕度50%～70%、光周期14L:10D的人工氣候箱中處理10 h；記錄亮腹釉小蜂的死亡數(shù)量，統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.9 寄生率檢測(cè)

準(zhǔn)備帶有嫩稍的年橘，選取合適位置套15 cm×15 cm的60目防蟲(chóng)袋，在其中轉(zhuǎn)入100頭4齡末柑橘木虱若蟲(chóng)。從1瓶亮腹釉小蜂產(chǎn)品中隨機(jī)選取10頭雌蟲(chóng)轉(zhuǎn)入上述防蟲(chóng)袋中，24 h后移除亮腹釉小蜂。7～9 d后檢查統(tǒng)計(jì)被寄生的柑橘木虱數(shù)量，統(tǒng)計(jì)寄生率。以上試驗(yàn)在26 ℃，相對(duì)濕度60%，光周期14L:10D的條件下進(jìn)行，重復(fù)5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種形態(tài)特征

（1）雌蜂

體長(zhǎng)0.92～1.04 mm，大部分黑褐色，復(fù)眼和單眼紅褐色，頭寬于長(zhǎng)，上顎2齒及1截齒，下顎須和下唇須各1節(jié)。觸角8節(jié)（觸角式1，1，3，3），具1小環(huán)狀節(jié)；柄節(jié)長(zhǎng)為寬的3.7倍；梗節(jié)等長(zhǎng)或稍長(zhǎng)于第1索節(jié)；第1～3索節(jié)長(zhǎng)比分別為11:10:9，分別具4～7個(gè)刺狀感覺(jué)器；棒節(jié)3節(jié)，末端具針狀突出，各棒節(jié)分別具7～11個(gè)刺狀感覺(jué)器。觸角基節(jié)暗褐色，柄節(jié)淺色，背緣暗色，其余各節(jié)暗黃色。

中胸盾中葉近側(cè)緣具2對(duì)毛，小盾片亞中線外緣具2對(duì)毛，盤(pán)狀感覺(jué)器靠近前1對(duì)毛；并胸腹節(jié)褶不完整，具不規(guī)則的網(wǎng)狀紋。翅透明，前翅長(zhǎng)為寬的2.3倍；亞緣脈端部呈折斷痕，亞緣脈具1根剛毛，端部下方具2～3根毛；前緣室基部具1～2根細(xì)毛，端部具3～4根細(xì)毛；緣脈具7～9根剛毛。足跗節(jié)4-4-4，足淺黃色，基節(jié)和跗節(jié)末端暗褐色。

腹部腹板黃色，第1～4節(jié)背板或第1～5節(jié)背中央大部分黃色，呈大黃色斑。第3產(chǎn)卵瓣暗褐色，產(chǎn)卵器從腹部第2腹節(jié)伸出，稍突出腹末端，產(chǎn)卵器為中足脛節(jié)長(zhǎng)的1.6倍，第3產(chǎn)卵瓣為產(chǎn)卵器長(zhǎng)的0.2倍（圖1）。

圖1 亮腹釉小蜂（Patrícia Milano繪圖[8]）Fig. 1 Tamarixia radiata（Patrícia Milano[8]）

（2）雄蜂：

體色與形態(tài)相似于雌蟲(chóng)，體長(zhǎng)0.84～1.05 mm。觸角9節(jié)（觸角式1，1，4，3）；柄節(jié)基向近2/5～1/2處具1小長(zhǎng)圓形感覺(jué)區(qū)；索節(jié)4節(jié)，各節(jié)分別具1排6～7根長(zhǎng)剛毛；第1棒節(jié)1排剛毛稍短，棒節(jié)末端具針狀突出。腹部第1～2節(jié)背板中央大部分暗黃色，邊緣黑褐色，呈小暗黃色斑；腹部第1～3腹板大部分暗黃色，其余腹板黑褐色。雄性外生殖器長(zhǎng)，從腹部第4腹節(jié)基部伸出，指狀突端部暗褐色（圖1）。

2.2 物種分子特征

亮腹釉小蜂分子鑒定結(jié)果顯示，目的基因COI、ITS-1和ITS-2在NCBI（National Center for Biotechnology Information Search Database）數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)的種內(nèi)相似度均較高（表2）：COI的種內(nèi)相似度為98.5%～100.0%，而與數(shù)據(jù)庫(kù)中同屬的其他種間相似度不高于94.0%；ITS-1種內(nèi)相似度最低為97.9%，而與同屬的其他種相似度僅為82.0%；ITS-2種內(nèi)相似度為99.0%～100.0%，種間相似度小于82.7%。因此本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，COI、ITS-1和ITS-2相似度應(yīng)高于97%，則認(rèn)為該種為亮腹釉小蜂。

表2 亮腹釉小蜂分子鑒定信息Table 2 Tamarixia radiata molecular identification information

2.3 雌蜂外觀檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果如表3，在5次亮腹釉小蜂雌蜂外觀檢測(cè)中，亮腹釉小蜂體色暗淡率最高為1.5%，亮腹釉小蜂殘肢殘翅率的比率最高為0.4%。

表3 亮腹釉小蜂檢測(cè)結(jié)果Table 3 Test data of Tamarixia radiata

本文根據(jù)檢測(cè)結(jié)果并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，規(guī)定亮腹釉小蜂產(chǎn)品中的雌性亮腹釉小蜂體色暗淡率不高于2.0%、殘肢殘翅率不高于1.0%。

2.4 數(shù)量檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果如表3所示，隨機(jī)抽取5瓶亮腹釉小蜂產(chǎn)品，其數(shù)量占標(biāo)識(shí)的比率最低為99.0%。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，本文規(guī)定產(chǎn)品包裝中亮腹釉小蜂的數(shù)量比率不低于標(biāo)識(shí)數(shù)量的95.0%。

2.5 雌蜂率檢測(cè)結(jié)果

本文檢測(cè)結(jié)果如表3所示，在5次檢測(cè)中，雌蜂率最低為71.0%。所以，本文規(guī)定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雌蜂率不低于70.0%。

2.6 不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率檢測(cè)結(jié)果

天敵產(chǎn)品的耐貯存能力是決定天敵能否進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)和作為商品進(jìn)行運(yùn)輸?shù)臎Q定性條件之一。亮腹釉小蜂在不同貯存條件下的死亡率反應(yīng)其抗逆能力和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，是保證亮腹釉小蜂能夠有效寄生的指標(biāo)之一，也是亮腹釉小蜂質(zhì)量指標(biāo)一種重要參數(shù)。由于缺乏文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)參考，本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將亮腹釉小蜂在不同溫度條件下貯存10 h后，記錄其死亡率。

檢測(cè)結(jié)果如表3，15 ℃低溫貯存死亡率最高為3.0%，25 ℃常溫貯存死亡率最高為2.0%，30 ℃高溫貯存死亡率最高為4.0%。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，規(guī)定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率均不得高于5.0%。

2.7 寄生率檢測(cè)結(jié)果

本次檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨機(jī)抽取的亮腹釉小蜂寄生率最低為92.0%，最高可達(dá)到100.0%（表3）。因此，本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，亮腹釉小蜂產(chǎn)品在實(shí)驗(yàn)室條件下寄生率不低于90%。檢測(cè)結(jié)果用于質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，不能用于田間標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。

3 討論

迄今為止，國(guó)際上巴西等國(guó)實(shí)現(xiàn)了亮腹釉小蜂的工廠化生產(chǎn)，在國(guó)內(nèi) 2020年廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)[8-13]，而并無(wú)有關(guān)亮腹釉小蜂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。本文首次確定了亮腹釉小蜂成蟲(chóng)質(zhì)量的檢測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)指標(biāo)，檢測(cè)項(xiàng)目包括檢測(cè)物種形態(tài)及分子特征、外觀（體色暗淡率、殘肢殘翅率）、產(chǎn)品數(shù)量、雌蜂率、寄生率及不同溫度下（15 ℃、25 ℃及30 ℃）亮腹釉小蜂貯存死亡率共7個(gè)質(zhì)量指標(biāo)。通過(guò)檢測(cè)廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所生產(chǎn)的亮腹釉小蜂各項(xiàng)指標(biāo)，首次確立了指標(biāo)參數(shù)，制定了亮腹釉小蜂成蟲(chóng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表4。

表4 亮腹釉小蜂產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Product quality standards of Tamarixia radiata

在物種分子特征檢測(cè)上，常用細(xì)胞色素氧化酶 I（cytochrome oxidase subunit I，COI）的保守區(qū)域、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、2（internal transcribed spacer，ITS-1、ITS-2），本文做的這兩種檢測(cè)都是可以用于質(zhì)量技術(shù)檢測(cè)，在生產(chǎn)實(shí)際中只需選擇其中一種即可；而簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（Inter simple sequence repeat，ISSR）電泳條帶特征[16]進(jìn)行物種分子檢測(cè)時(shí)，由于不易操作，所以不作為物種分子特征檢測(cè)的方法。

在不同溫度下貯存寄生蜂死亡率檢測(cè)上，目前采用15 ℃（低溫）、25 ℃（常溫）及30 ℃（高溫）3種溫度，將亮腹釉小蜂分別置于這3種溫度下處理10 h后進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于在變溫條件下貯存不同時(shí)間寄生蜂死亡率的檢測(cè)方法，暫無(wú)可行的方法，還有待研究。

利用本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)評(píng)價(jià)廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所寄生蜂天敵工廠生產(chǎn)出來(lái)的亮腹釉小蜂成蟲(chóng)[17]，結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法合理，可操作性強(qiáng)。