高溫低氧對(duì)菌核存活率和土壤微生物組成的影響

王嘉豪，洪雨欣，李聰聰，吳波明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193）

由核盤菌Sclerotinia sclerotiorum引起的菌核病可在油菜、向日葵、大豆、胡蘿卜等多種作物上造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[1-5]。解決菌核病防治問題對(duì)我國經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)和糧油食品穩(wěn)定供給具有重大意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。菌核病的田間侵染源主要是土壤中存活的菌核。在較長時(shí)間持續(xù)濕潤條件下，存活的菌核可萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤[6]，釋放數(shù)量巨大的子囊孢子，侵染周邊植株的地上部分，造成常見的頂枯、倒伏等癥狀[7,8]。菌核也可直接萌發(fā)產(chǎn)生菌絲侵染作物的根及地下塊莖等組織，田間菌核數(shù)量高時(shí)，菌絲侵染可導(dǎo)致植株在苗期大量猝倒死亡[9]。由于抗菌核病品種培育難度較大，菌核病的防治主要依賴施用藥劑保護(hù)植物的易感器官（花），同時(shí)減少土壤中存活的菌核數(shù)量。與非寄主植物輪作已經(jīng)被證明可有效減少菌核數(shù)量。例如，稻油輪作早已在我國長江流域廣泛推廣，在油菜菌核病防控中起到了重要作用[10-12]。但是，在水資源缺乏地區(qū)或不適合種植水稻的山地，由于核盤菌的寄主范圍十分廣泛[5]，可用于輪作的作物非常少，而且與旱作物輪作需要間隔多年才能有效地控制菌核病[10-13]，輪作在實(shí)際生產(chǎn)中很難推行。在探索輪作替代方案過程中研究者發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)室高溫、高濕和低氧條件下核盤菌存活率可在短時(shí)間內(nèi)迅速降低[14]，夏季田間淹水2～3周可以顯著減少土壤中存活的菌核數(shù)量，從而減輕菌核病的發(fā)生[15,16]。盡管已知芽胞桿菌[3,17-21]、假單胞桿菌[20]、鏈霉菌[3]、盾殼霉[3,22]、木霉[3,7,21,23]、鐮孢菌[24]、粘帚霉[25]等多種微生物對(duì)核盤菌引起的菌核病具有一定生物防治效果，但是，高溫、高濕和低氧條件下土壤中菌核快速死亡的原因和具體機(jī)制尚不明確。本研究的目的就是探索高溫、高濕、低氧條件對(duì)菌核存活率的影響，分析這一過程中土壤微生物結(jié)構(gòu)的變化，以期為通過調(diào)節(jié)土壤微環(huán)境和微生物組成，在短時(shí)間內(nèi)降低土壤存活菌核數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)防控作物菌核病目標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣本及供試菌株

所用土壤包括采集于安徽省黃山市徽州區(qū)油菜田表土（0～10 cm）和池塘淤泥。采集后先自然風(fēng)干，然后粉碎并過 10目篩除去植物殘?bào)w等大塊雜質(zhì)。所用菌株采集自江西婺源的油菜菌核病受害植株，經(jīng)分離純化得到核盤菌菌核。在錐形瓶中滅菌馬鈴薯塊上擴(kuò)大培養(yǎng)4周左右得到大量高質(zhì)量菌核，洗凈風(fēng)干后，選取飽滿、顏色深黑、大小一致且外表無損傷的菌核用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 菌核處理

試驗(yàn)采用多因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，試驗(yàn)1包括土壤（池塘淤泥和油菜田土）、水分（風(fēng)干和加水10 mL/50 g土）、溫度（15 ℃和35 ℃）、氧氣（正常氧和低氧）和時(shí)間（1、2、4周）5個(gè)因素， 48個(gè)處理；試驗(yàn)2包括滅菌（滅菌和不滅菌）、水分（加水5、10和15 mL/50 g土）、氧氣（低氧和正常氧）和溫度（15 ℃和25 ℃）4因素，24個(gè)處理（時(shí)間均為4周）；試驗(yàn)3包括滅菌（滅菌和不滅菌），水分（風(fēng)干和加水10 mL/50 g土）、溫度（15 ℃、25 ℃和35 ℃）、氧氣（正常氧和低氧）和時(shí)間（2、4周）5因素，48個(gè)處理。每個(gè)處理包含一個(gè)直徑90 mm培養(yǎng)皿，其中加入50 g風(fēng)干土壤及50顆挑選好的菌核，盡量將菌核完全用土壤覆蓋。加水處理組用移液槍均勻加入10 mL無菌水，低氧處理將培養(yǎng)皿（不加蓋）放入12 cm×17 cm 的真空袋中，用真空包裝機(jī)抽凈袋中空氣并封口。抽真空時(shí)間為30 s，封口時(shí)間為3 s，真空度約為0.098 MPa。將各處理置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 土壤采樣及菌核萌發(fā)率檢測(cè)

分別在處理1（試驗(yàn)1特有）、2、4周后進(jìn)行采樣檢測(cè)。首先，每個(gè)處理收集菌核周圍附著的土壤約10 g，裝入50 mL離心管中，保存于-20 ℃冰箱中用于土壤微生物多樣性分析。然后，在流動(dòng)自來水下篩洗收集菌核，沖洗菌核表面土壤，再經(jīng)過3%含氯消毒水處理3 min，75%酒精消毒1 min，無菌水漂洗3次后置于超凈臺(tái)中風(fēng)干菌核表面水分，隨后將菌核轉(zhuǎn)移至含50 mg/L硫酸鏈霉素的PDA平板上，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，每天統(tǒng)計(jì)菌核萌發(fā)情況。運(yùn)用SAS軟件（Rev. 9.4，SAS Institute Inc.，Cary，NC USA）對(duì)菌核萌發(fā)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，因萌發(fā)率（x）數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布和方差齊性要求，數(shù)據(jù)經(jīng)邏輯斯蒂轉(zhuǎn)換（y= ln[（x+0.1）/（1.01-x）]）后，再運(yùn)用GLM過程進(jìn)行方差分析。針對(duì)效應(yīng)顯著的因子，采用LSD法對(duì)不同處理的平均值進(jìn)行多重比較。

1.4 土壤樣本DNA提取與高通量測(cè)序

選取試驗(yàn)1的16個(gè)土壤樣本和試驗(yàn)2的6個(gè)和試驗(yàn)3的8個(gè)樣本作為代表，其中3-2-1與3-2-2、3-4-1和3-4-2、3-10-1和3-10-2、 3-12-1和3-12-2為重復(fù)（表1）。每個(gè)樣本混勻后取0.5 g土壤用試劑盒（FastDNA?Spin Kit for Soil，安諾倫（北京MP Biomedicals）生物科技有限公司）提取每個(gè)樣本的總DNA。借助NanoDrop 2000檢測(cè)DNA的純度和濃度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。對(duì)合格DNA首先使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)（引物為338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和 806R 5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′）以及真菌的 ITS1 區(qū)（引物為 ITS1F 5′-CTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA-3′和 ITS2 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），進(jìn)行 Miseq 文庫構(gòu)建。然后，采用 Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

表1 試驗(yàn)1和2中高通量測(cè)序樣本編號(hào)及處理信息Table 1 Information of samples selected from experiments 1 and 2 for sequencing of bacterial 16S rDNA and fungal ITS region

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)（reads），采用FASTQ軟件移除適配序列、引物序列以及低質(zhì)量序列，利用FLASH軟件對(duì)優(yōu)化后成對(duì)序列進(jìn)行拼接，拼接時(shí)overlap最小值設(shè)為10 bp，最大配錯(cuò)率設(shè)為20%[26]。拼接后先利用UPARSE軟件去除嵌合體，得到OTU（Operational Taxonomic Units）代表序列[27,28]；利用RDP classifier平臺(tái)的Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫和UNITE數(shù)據(jù)庫分別對(duì)細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS2序列進(jìn)行分類注釋，其中比對(duì)最小閾值設(shè)為 0.7并去除與線粒體和葉綠體序列及無法與數(shù)據(jù)庫匹配的序列；純凈后的OTUs序列利用UPARSE按照97%相似水平進(jìn)行聚類劃分[29]；然后對(duì)16S rDNA和ITS2序列分別進(jìn)行抽樣分析，評(píng)價(jià)不同樣本數(shù)的覆蓋率并制作稀釋曲線；分析OTU豐富度（sobs）、Shannon多樣性指數(shù)以及處理對(duì)不同真菌和細(xì)菌群落相對(duì)豐度的影響；最后，對(duì)OTUs根據(jù)bray-curtis算法獲得不同樣本的距離矩陣，再對(duì)矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類，對(duì)不同樣本的細(xì)菌群落和真菌群落分別進(jìn)行PCoA分析（principal co-ordinates analysis），并將結(jié)果可視化展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)菌核存活的影響

少部分 15 ℃加水處理組中菌核在實(shí)驗(yàn)過程中萌發(fā)產(chǎn)生白色菌絲，但菌核基本保持完好充實(shí)（硬度較高）。與此相對(duì)照，高溫加水條件處理一周后，菌核未見萌發(fā)產(chǎn)生菌絲或子囊盤，但其質(zhì)地彈性和硬度降低，黑色表皮剝離露出淡黃色髓質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)至第4周，部分菌核髓質(zhì)被完全分解，剩下片狀黑色表皮殘骸。方差分析發(fā)現(xiàn)土壤類型以及其與其他因素的互作對(duì)菌核存活沒有顯著影響（試驗(yàn)1結(jié)果未展示），所以后續(xù)分析中不再考慮土壤類型差別，3個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果都表明高溫、高濕和低氧可加快菌核死亡。以試驗(yàn)3結(jié)果為例，滅菌土壤中各處理的菌核萌發(fā)率都高于未滅菌土壤的相應(yīng)處理（滅菌土壤中數(shù)據(jù)未展示），說明土壤中的生物因素可能會(huì)影響菌核萌發(fā)率。對(duì)未滅菌土壤方差分析發(fā)現(xiàn)，風(fēng)干土壤中，菌核萌發(fā)率顯著高于加水土壤（P＜0.05），不加水處理2周后菌核平均萌發(fā)率為69.08%，而加水各處理菌核平均萌發(fā)率為34.33%；在加水的土壤中，15 ℃處理的菌核萌發(fā)率（平均51.67%）與25 ℃處理（平均42.17%）差異不顯著，但都顯著（P＜0.05）高于 35 ℃處理（0）；因試驗(yàn)中抽真空后密封未能達(dá)到完全厭氧條件，僅實(shí)現(xiàn)了低氧，在加水土壤中低氧處理的菌核萌發(fā)率在15 ℃和25 ℃（49.33%和37.67%）都低于正常氧的相應(yīng)值（54%和46.67%），但是差異未達(dá)到顯著水平，部分原因可能是在低氧處理中重復(fù)之間波動(dòng)比較大，低氧處理不穩(wěn)定；在風(fēng)干土壤中，菌核萌發(fā)率在4周內(nèi)基本沒有明顯變化，但在加水土壤中菌核的萌發(fā)率都隨時(shí)間推移而顯著（P＜0.05）下降，在高溫條件下，這種下降速度更快；高溫和水分之間的互作顯著（P＜0.05），高溫有水低氧組合菌核萌發(fā)率下降最快，2周內(nèi)下降到 0%（圖1，第 4周數(shù)據(jù)未展示）。

圖1 不同條件下處理2周后不滅菌田間土壤中核盤菌菌核萌發(fā)率Fig. 1 Germination rate of S. sclerotiorum sclerotia after treatments under different conditions for 2 weeks in unautoclaved soil collected from rapeseed fields

2.2 測(cè)序結(jié)果及OTUs聚類分析

本研究3個(gè)試驗(yàn)得到的結(jié)果類似，重復(fù)測(cè)序的結(jié)果高度一致（2和3的結(jié)果未展示）。以試驗(yàn)1中16個(gè)樣本結(jié)果為例，經(jīng)對(duì)測(cè)序所得的reads進(jìn)行質(zhì)控過濾，獲得有效的細(xì)菌16S rDNA序列堿基總數(shù)目為554704446 bp，序列平均長度為415 bp。有效的真菌ITS2序列總堿基數(shù)為348636327 bp，序列平均長度為239 bp。有效序列按97%相似水平聚類到6299個(gè)OTUs中。OTUs抽樣分析得到的稀釋曲線圖（圖2）表明，隨著樣本數(shù)量增加sobs指數(shù)開始時(shí)快速上升，但隨后其上升速度隨著抽樣數(shù)量增加逐漸趨緩，并最終形成平臺(tái)。這說明對(duì)樣本微生物群落的檢測(cè)比率接近飽和，本研究的測(cè)序量足夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。結(jié)果也顯示，淤泥樣本中細(xì)菌和真菌OUT數(shù)目都低于油菜土。

圖2 油菜土和淤泥樣品的細(xì)菌稀釋曲線和真菌稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of for bacteria and fungi in soils from rapeseed fields and a pond

細(xì)菌16S rDNA序列的多樣性分析結(jié)果（表2）顯示，第1周和第4周相比，正常氧氣水平處理組的香農(nóng)指數(shù)在15 ℃（5.63，4.38）和35 ℃（4.39，4.71）均有差異，但差異都不顯著；而低氧處理的香農(nóng)指數(shù)在15 ℃（3.17，4.47）和35 ℃（3.37，4.37）都顯著升高（表2，t-檢驗(yàn)箱線圖未展示）。類似地，試驗(yàn)2樣本測(cè)序結(jié)果也顯示土壤含水量上升可增加細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)（數(shù)據(jù)未顯示）。綜合兩個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果表明，高溫、低氧（含水）處理可增加土壤細(xì)菌多樣性。

表2 不同處理油菜田土壤樣本中細(xì)菌和真菌多樣性（Shannon）指數(shù)Table 2 Bacterial and fungal alpha diversity index in moist soil samples after different treatments

真菌ITS2序列多樣性分析顯示，試驗(yàn)1中高溫低氧條件下油菜土真菌群落的香農(nóng)指數(shù)從第1周（4.20）到第 4周明顯下降（1.49），其他處理的香農(nóng)指數(shù)從第1到第4周變化不大（表2）。類似地淤泥樣本中，高溫和低氧處理中細(xì)菌多樣性上升，但是真菌的多樣性沒有規(guī)律（表2）。試驗(yàn) 2結(jié)果也表明，加水土壤培育4周后25 ℃條件下的真菌香農(nóng)指數(shù)低于 15 ℃（結(jié)果未顯示）。綜合兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫、低氧條件可降低土壤中真菌的多樣性。

OTU聚類結(jié)果表明，低氧和正常氧處理的細(xì)菌群落分在2個(gè)不同類群中（圖3A，試驗(yàn)2結(jié)果相似未顯示）。PCoA分析顯示，低氧和正常氧處理的細(xì)菌群落在第一維度上各自聚在一起，但第二維度上高溫低氧的池塘淤泥細(xì)菌群落與其他低氧處理距離則較遠(yuǎn)（圖4A）。

圖3 基于OTUs序列的土壤樣本（A-細(xì)菌, B-真菌）聚類分析結(jié)果Fig. 3 Cluster analysis based on OTUs sequences of soil bacteria (A) and fungi (B)

圖4 基于OTUs序列的土壤樣本本（A-細(xì)菌, B-真菌）PCoA分析結(jié)果Fig. 4 PCoA analysis based on OTUs sequences of bacteria (A) and fungi (B) in the rapeseed field and pond soil

真菌群落的聚類結(jié)果沒有明顯規(guī)律。4個(gè)高溫正常氧樣本（AB1和AB1-1、AB4和AB4-1）內(nèi)部差別較小，但與其他樣本差別較大，單獨(dú)構(gòu)成了一個(gè)分支（圖3B）。PCoA分析顯示，這4個(gè)樣本距離很近，AA4-1和AA4，BB1和BA4, BA1-1、BB4、BB4-1、BB1-1和BA4-1距離非常近，其他樣品則更加分散（圖4B）。

2.3 不同微生物群落的相對(duì)豐度

土壤OTUs共檢出18個(gè)門，包括細(xì)菌12個(gè)門、真菌6個(gè)門和一些未能分類的真菌。正常氧和低氧處理的細(xì)菌組成在門水平明顯不同（圖5）。低氧的4個(gè)處理中，厚壁菌門Firmicutes以71.81%-88.19 %的相對(duì)豐度都占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；而在正常氧組中放線菌門（Actinobacteriota，22.87%～53.42%）和變形菌門Proteobacteria（21.95%～36.50%）豐度最高，正常氧15 ℃處理中擬桿菌門Bacteroidota也占有相對(duì)比重（圖5）。油菜圖樣本和池塘淤泥樣本間這些主要門所占比重雖有差別，但總體趨勢(shì)相似（圖5）。

圖5 不同處理土壤樣本中細(xì)菌物種（A-油菜土，B-池塘淤泥）門水平分布柱狀圖Fig. 5 Relative abundances of bacterial phylum categories in soil samples from rapeseed fields (A) and a pond (B)

在屬水平，土壤樣本中共檢出68個(gè)屬的細(xì)菌，其中狹義梭菌（Clostridiumsensu-stricto 1，10，11，12）是低氧處理下特有的屬且占據(jù)較高豐度（圖6）；而 35 ℃正常氧處理 4周的樣本中放線菌Streptomyces豐度（27.13%）明顯高于其他樣本（圖6）。而淤泥樣本中放線菌Streptomyces豐度在35 ℃正常氧處理中（7.12%～7,85%）也高于其他處理（0.1%～4.40%），但是因?yàn)榭傮w占比較低并未排進(jìn)前9大屬（數(shù)據(jù)未展示）。

圖6 不同處理土壤樣本細(xì)菌物種（A-油菜土，B-池塘淤泥）屬水平分布柱狀圖Fig. 6 Relative abundances of bacterial genera in soil samples in soil samples from rapeseed fields (A) and a pond (B)

在門水平，真菌中子囊菌門Ascomycota在所有樣本中均有分布，且其相對(duì)豐度（57.27%～99.92%）在油菜土和池塘淤泥各處理樣本中均占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（圖7）。需要注意的是，在池塘土（最高26.95%）中檢出比油菜土中（最高15.04%）更多的無法分類真菌（unclassified fungi，圖7B）。在屬水平，各處理組共檢出37個(gè)真菌屬。其中相對(duì)豐度最高的屬是籃狀菌屬Talaromyces，在高溫正常氧氣處理樣品中相對(duì)豐度占比達(dá)到了62.18%～77.83%（圖8）；木霉屬Trichoderma在正常氧15 ℃處理4周的油菜土（54.23%）和池塘土（91.17%）樣本中相對(duì)豐度明顯高于其他樣本（圖8）。值得注意的是低氧35 ℃下培養(yǎng)4周后核盤菌屬Sclerotinia在油菜土中的相對(duì)豐度高達(dá)72.80%，顯示此時(shí)已有大量菌核組織分解散布到土壤樣本中（圖8A），但比重在同樣處理的池塘土中要低得多（圖8B）。

圖7 不同處理土壤樣本真菌物種（A-油菜土，B-池塘淤泥）門水平分布柱狀圖Fig. 7 Relative abundances of fungal phylum categories in soil samples from rapeseed fields (A) and a pond (B)

圖8 不同處理土壤樣本真菌物種（A-油菜土，B-池塘淤泥）屬水平分布柱狀圖Fig. 8 Relative abundances of fungal genera in soil samples from rapeseed fields (A) and a pond (B)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)高溫、高濕和低氧水平，任一單因素處理均能夠顯著影響核盤菌菌核的萌發(fā)率，而在3個(gè)因素共同作用下，35 ℃低氧高濕條件下處理4周可造成菌核完全喪失活性。這一結(jié)果與汪國森等[30]得到的升高溫度可以加快菌核死亡和Wu等[14]得到的低氧加速菌核死亡的研究結(jié)果相符合。水分是微生物活性所需，核盤菌菌核的兩種萌發(fā)方式都需要一定的土壤濕度（低于飽和濕度）[14,31]。然而，這一結(jié)果表明如果高濕（飽和濕度常常伴隨低氧）和高溫條件配合，則核盤菌菌核不僅不能萌發(fā)產(chǎn)生菌絲或者子囊盤，其存活率還迅速下降。這個(gè)發(fā)現(xiàn)也解釋了前人利用夏天水淹（高溫、高濕、低氧）防治菌核病取得較好結(jié)果的原因[15,16]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，兩茬作物之間往往只有相對(duì)較短的休耕期，不足以種植一茬輪作作物。本研究的結(jié)果表明，利用這一間隔期創(chuàng)造高溫、高濕和低氧條件可以在短時(shí)間內(nèi)殺死土壤中的核盤菌菌核，從而實(shí)現(xiàn)防控菌核病的目標(biāo)，尤其是如果這一間隔期發(fā)生在日光資源豐富的夏天時(shí)，高溫條件更是為此提供了便利。

為探索高溫、高濕、低氧條件下菌核快速死亡的原因，本研究通過對(duì)土壤中細(xì)菌16SrDNA和真菌ITS測(cè)序，分析了不同處理對(duì)細(xì)菌和真菌種群組成和豐度的影響。此前鏈霉菌屬和木霉屬在菌核病的生物防治中受到廣泛關(guān)注，鏈霉菌屬廣泛存在于土壤中，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)包括核盤菌在內(nèi)的多種植物病原真菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗真菌活性[32]，木霉屬具有較強(qiáng)的幾丁質(zhì)分解能力，可寄生核盤菌菌絲和菌核促進(jìn)菌核死亡[33]。但本研究結(jié)果表明，鏈霉菌和木霉菌都只適合有氧環(huán)境，在低氧條件下他們的豐度都大幅降低。這就基本確定不是高溫、高濕、低氧條件下核盤菌菌核快速死亡的直接原因。本研究明確了高溫低氧高濕處理使得細(xì)菌多樣性水平上升，更具體地，高溫低氧（高濕）處理可顯著提高狹義梭菌的相對(duì)豐度，這類細(xì)菌幾乎只在低氧處理土壤中才檢測(cè)到，而且不同來源土壤中的結(jié)果相同，這暗指這類細(xì)菌在自然界中非常普遍。核盤菌菌核的快速死亡是否與這一類細(xì)菌相關(guān)，以及如何利用它們更好地防控菌核病還有待進(jìn)一步研究明確。除此之外，我們?cè)诟邷氐脱跆幚碛筒送翗颖局羞€檢測(cè)到大量的核盤菌 DNA，這表明要么菌核在此條件下萌發(fā)產(chǎn)生了菌絲（因試驗(yàn)中未觀察到白色絲狀物，所以基本可以否定這一可能），要么菌核結(jié)構(gòu)崩潰（自身或者其他微生物造成），菌核殘?jiān)⒙涞搅酥車寥乐?。因此，后續(xù)研究也有必要進(jìn)一步明確高溫、低氧（高濕）處理對(duì)核盤菌菌核本身生理生化過程的影響。

綜上所述，本研究明確了高溫高濕低氧處理可以在短時(shí)間內(nèi)殺死核盤菌菌核，初步明確了高溫、高濕、低氧條件下狹義梭菌相對(duì)豐度上升最為明顯，這為進(jìn)一步明確其機(jī)制更好地利用這一現(xiàn)象防控作物菌核病打下了基礎(chǔ)。