植物提取物對油茶炭疽菌的抑菌活性篩選

羅建梅，張興怡，伍建榕,2，劉 麗，洪英娣，張東華*，閆曉慧*

（1. 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，昆明 650224；2. 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224）

油茶Camellia oleifera屬山茶科Theaceae山茶屬Camellia植物，是我國特有的油料植物[1]。用油茶果實(shí)精煉出的茶油不含對人體有害的黃曲霉毒素、棉酚、芥酸等成分，同時(shí)具有良好的保健功能，能減少脂肪的積累，提高人體免疫力，降低血漿中膽固醇濃度，改善和預(yù)防高血壓、冠心病、動脈硬化等心血管疾病，是一種理想的高營養(yǎng)、低熱量、高檔保健食用油[2,3]。但油茶在種植的過程中病害發(fā)生較普遍，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的油茶病害有 42種[4]，其中油茶炭疽病是最重要的病害之一，可引起嚴(yán)重的落蕾、落果，導(dǎo)致油茶減產(chǎn)20%～30%[5]。當(dāng)下對于油茶炭疽病的防治主要是使用化學(xué)殺菌劑，但過多使用化學(xué)殺菌劑，不僅會影響茶油的品質(zhì)，還會破壞生態(tài)環(huán)境、危害人類的身體健康，尋求新型環(huán)保的生物農(nóng)藥，生產(chǎn)綠色健康的茶油，是目前急需解決的問題[6,7]。植物是生物活性化合物的天然寶庫，植物源農(nóng)藥有效成分為天然活性物質(zhì)，具有見效快，易降解，有害生物不易產(chǎn)生抗藥性，對非靶標(biāo)生物安全，對環(huán)境友好等優(yōu)勢，倍受關(guān)注[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，植物中的萜烯類、黃酮類、多酚類、生物堿等次生代謝物都具有殺蟲或抗菌活性[9]。目前已報(bào)道的具有農(nóng)藥活性的植物約2400多種，其中抑菌植物超過1300種，主要集中在菊科、樟科、豆科、禾本科、唇形科、百合科等科[10,11]，我國擁有豐富的植物資源，尚有大量的植物種類未被研究。本研究測定了49種植物的70種提取物對油茶炭疽病菌的抑制作用，篩選出2種對油茶炭疽菌有較好抑制活性的植物提取物，為今后油茶炭疽病的生物防治提供新的思路，為開發(fā)植物源殺菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 植物材料共 49種，分別采自云南、遼寧和廣西，由西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院胡世俊副教授鑒定，詳情見表1。

表1 供試植物名錄Table 1 The list of tested plants

1.1.2 供試菌株 油茶炭疽菌C. fructicola由西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院伍建榕教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備 植物材料風(fēng)干粉碎，稱取200 g的粗粉，甲醇超聲提取3次，每次30 min，合并3次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收溶劑，得到甲醇提取物，水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取得相應(yīng)溶劑的提取物濃縮至干備用。精確稱取一定量的提取物用二甲基亞砜（DMSO）溶解后配成100 mg/mL母液，置于4℃冰箱備用。

1.2.2 抑菌活性測定 已純化的油茶炭疽菌菌種置于超凈工作臺上，菌落邊緣打菌餅備用。采用帶毒平板法[12,13]測定不同植物提取物對油茶炭疽菌的抑菌活性，將100 mg/mL母液采用巴氏消毒法滅菌備用。PDA培養(yǎng)基高壓滅菌，冷卻至 50 ℃以下，在無菌條件下將母液加入培養(yǎng)基中充分混勻，使提取物最終濃度為1 mg/mL，空白對照為含等量DMSO的PDA培養(yǎng)基，陽性對照為多菌靈。培養(yǎng)基凝固后，每皿中央接入一個(gè)菌餅（5 mm），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，接種完成后用封口膜密封倒置放于28 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天采用十字交叉法測量菌落直徑，直至對照組長滿平板，計(jì)算抑菌率，純生長量=菌落平均直徑-5，抑制率（%）＝（對照純生長量－處理純生長量）/對照純生長量×100。利用Excel和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

1.2.3 抑菌毒力（EC50）測定 將臭靈丹石油醚萃取物和益母草乙酸乙酯萃取物設(shè)置0.25、0.5、0.75、1、2 mg/mL五個(gè)濃度梯度，陽性對照藥劑為多菌靈，其濃度為12.5、25、50、100、200 μg/mL。采用1.2.2方法進(jìn)行抑菌活性測定。將計(jì)算出的各濃度抑菌率換算成機(jī)率值，以濃度對數(shù)為x軸，抑菌率機(jī)率值為y軸，用Excel作圖得出毒力方程求出EC50。

1.2.4 孢子濃度測定 取已培養(yǎng)好的油茶炭疽病菌的對照組和試驗(yàn)組培養(yǎng)皿，加入5 mL無菌水，將培養(yǎng)皿表面的孢子刮下，充分混勻，用脫脂棉進(jìn)行過濾，并用無菌水沖洗濾渣3次，使濾液體積達(dá)到10 mL，使用25中格的血球計(jì)數(shù)板，加適量的孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察左上、左下、右上、右下和中央5個(gè)中格即80個(gè)小格的孢子數(shù)，并計(jì)算孢子濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物的抑菌活性測定

26種植物的甲醇提取物在濃度為1 mg/mL時(shí)對油茶炭疽菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性（表2），其中唇形科植物益母草的甲醇提物對油茶炭疽菌的抑制率最高為44.03%，其次為菊科的藿香薊40.30%，兩種提取物抑菌活性無顯著差異。此外茵陳蒿、角蒿、千里光和金腰箭也表現(xiàn)出較好的抑菌活性，抑制率均在30%以上，其余植物提取物的抑菌活性相對較低，抑菌率2.99%～29.10%。

測定了15種植物的乙酸乙酯萃取物在濃度為1 mg/mL時(shí)對油茶炭疽菌的抑菌率結(jié)果如表3所示，益母草乙酸乙酯萃取物對油茶炭疽菌的抑制率為50.75%，顯著高于其他提取物，其次為柳葉菜科植物紅花月見草的乙酸乙酯萃取物，抑制率為37.31%，其余植物的乙酸乙酯萃取物對油茶炭疽病菌的抑菌活性相對較低，抑制率5.22%～26.12%。

表3 15種乙酸乙酯萃取物對油茶炭疽菌的抑菌活性Table 3 Antifungal activities of 15 ethyl acetate extracts against C. fructicola

17種植物的石油醚萃取物在濃度為1 mg/mL時(shí)對油茶炭疽菌的抑菌率結(jié)果如表4所示，其中臭靈丹石油醚萃取物對油茶炭疽菌抑菌率為54.48%，顯著高于其他植物，其次為紅花月見草的石油醚萃取物，與扁蓄、籬天劍、薇甘菊、和鈕子瓜等植物無顯著差異，其抑菌率 30.6%～36.57%，馬鞭草、千里光等 11種植物也表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性抑菌率9.70%～26.12%。

表4 17種石油醚萃取物對油茶炭疽菌的抑菌活性Table 4 Antifungal activities of 17 petroleum ether extracts against C. fructicola

12種植物的水萃取物在濃度為1 mg/mL時(shí)對油茶炭疽菌的抑菌率結(jié)果如表5所示，其中鉆葉紫菀水萃取物的抑制率最高為35.07%，其次為珊瑚櫻，抑制率為33.58%，二者之間無顯著差異，此外風(fēng)輪草、倒提壺和益母草也表現(xiàn)出一定的抑菌活性抑制率，在 23.88%～29.85%之間，其余植物的抑菌活性較低，抑菌率8.96%～18.66%。

表5 12種水萃取物對油茶炭疽菌的抑菌活性Table 5 Antifungal activities of 12 water extracts against C. fructicola

2.2 臭靈丹和益母草提取物對油茶炭疽菌的抑菌濃度梯度篩選

對抑菌率較高的臭靈丹石油醚萃取物和益母草乙酸乙酯萃取物進(jìn)一步進(jìn)行了對油茶炭疽菌抑菌濃度梯度測定如圖1所示，隨著提取物濃度的增加，抑菌效果也越來越明顯。分別在接種后的第3 d、第5 d、第7 d、第9 d測定了0～2 mg/mL范圍內(nèi)兩種提取物的抑菌結(jié)果如圖2、圖3所示，以此結(jié)果為依據(jù)擬合出各提取物的毒力方程見表6，臭靈丹石油醚萃取物對油茶炭疽菌的有效中濃度（EC50）在 0.7013～0.7947 mg/mL之間，其中第5 d的測定的毒力最強(qiáng)。益母草乙酸乙酯萃取物對油茶炭疽菌有效中濃度（EC50）在0.6246～1.0021 mg/mL之間，在第9 d測定的毒力最強(qiáng)。但兩種提取物的活性均不及陽性對照藥劑多菌靈，其 EC50為 12.1567 μg/mL。

圖1 臭靈丹、益母草提取物對油茶炭疽菌抑菌效果Fig. 1 Antifungal effects of extracts from L. pterodonta and L. artemisia against C. fructicola

圖2 不同濃度臭靈丹提取物對油茶炭疽菌的抑菌效果Fig. 2 Antifungal effects of different concentration of L.pterodonta extract against C. fructicola

圖3 不同濃度益母草提取物對油茶炭疽菌的抑菌效果Fig. 3 Antifungal effects of different concentration of L. artemisia extract against C. fructicola

表6 臭靈丹、益母草提取物對油茶炭疽菌的抑菌毒力Table 6 Toxicity of extracts from L. pterodonta and L. artemisia against C. fructicola

通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)臭靈丹石油醚萃取物處理的油茶炭疽菌菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯變化如圖4所示，與對照相比，菌絲分支明顯減少，菌體的產(chǎn)孢量也相對減少，用同一時(shí)間接種且長滿菌絲的平板制作孢子懸浮液，在相同稀釋倍數(shù)下利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子量，對照組和處理組分別為6.55×106、2.8×106孢子/mL，可能由于提取物中的抑菌活性成分影響了油茶炭疽病菌菌絲的生長及孢子的產(chǎn)生，起到抑菌作用。

圖4 臭靈丹提取物處理對油茶炭疽菌菌絲形態(tài)和產(chǎn)孢的影響（10×40倍）Fig. 4 Effects of L. pterodonta extract on mycelial morphology and sporulation of C. fructicola (10×40 times)

3 討論

目前，油茶炭疽病的防治主要采用化學(xué)藥劑，大量使用化學(xué)藥劑會危害有益生物、破壞生態(tài)環(huán)境、威脅人體健康，導(dǎo)致了“3R”問題等，于是研究者們開始轉(zhuǎn)變研究方向，從之前的化學(xué)藥劑防治轉(zhuǎn)變?yōu)樯锓乐魏蜕镛r(nóng)藥的開發(fā)[14,15]?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)記載中，周建宏等[16]對 40多種植物進(jìn)行抑菌活性測定，篩選出具有較高抑菌活性的丁香和黃芩，研制出了防治油茶軟腐病和油茶炭疽病的純植物源農(nóng)藥。李石磊等[17]將從博落回中提取出的有效成分與化學(xué)藥劑復(fù)配，研制出了復(fù)配藥劑，對防治油茶炭疽病、油茶軟腐病和油茶葉枯病具有抑制作用。楊婷等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚、丁香酚、異丁香酚對油茶炭疽菌具有良好的抑制作用。李昕[19]對苦楝、黃苓、茶枯、博落回4種植物提取物進(jìn)行抑菌活性測定及室內(nèi)毒力分析結(jié)果表明，濃度為500 mg/L的博落回提取物對油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率達(dá)71.70%，其EC50為149.88 mg/L。姚翰文等[20]研究發(fā)現(xiàn)丁香提取物對油茶炭疽菌具有良好的抑制效果，其EC50值為1.005 g/L，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的臭靈丹提取物的EC50在0.7013～0.7947 mg/mL之間，益母草提取物的EC50在0.6246～1.0021 mg/mL之間，抑制效果相對優(yōu)于丁香的提取物，具有更高的利用價(jià)值。由此可見，從植物中尋找高效低毒的綠色農(nóng)藥用于油茶炭疽病的生物防治具有廣闊的前景。

本研究發(fā)現(xiàn)臭靈丹和益母草的提取物對油茶炭疽菌的生長和繁殖均具有較好的抑制活性。臭靈丹Laggera pterodonta為菊科Compositae六棱菊屬Laggera植物，別名獅子草、臭葉子、六棱菊等，分布于云南、四川、湖北、廣西、西藏等地[21]，具有抑菌、抗腫瘤、抗病毒等生物活性，被廣泛用于治療感冒、咽喉炎、支氣管炎、瘧疾等，主要化學(xué)成分為桉烷型倍半萜和黃酮類化合物，目前已從臭靈丹中分離、鑒定出30余種桉烷型倍半萜類化合物[22]。楊光忠等[23]研究發(fā)現(xiàn)臭靈丹酸、臭靈丹二醇對金黃色葡萄球菌、草分支桿菌、枯草芽胞桿菌、銅綠假單胞菌、環(huán)狀芽胞桿菌具有明顯的抑制作用，目前對于臭靈丹的化學(xué)成分研究與應(yīng)用主要是在醫(yī)學(xué)方面，其他方面的報(bào)道相對較少。益母草Leonurus artemisia又名坤草，屬唇形科Labiatae益母草屬Leonurus植物，在全國各地均有分布，其藥用部位為干燥或新鮮的地上部分[24]，主要用于醫(yī)學(xué)方面，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、清熱解毒等功效[25]。目前，從益母草中已分離鑒定出120余種化合物，包括生物堿類、黃酮類、二萜類、香豆素類、三萜類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油類等化合物[26]。馬慶一等[28]采用濾紙片擴(kuò)散法研究表明，益母草對多種細(xì)菌、青霉都具有良好的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌抑制效果較為明顯[27]，同時(shí)有研究表明益母草中的黃酮類化合具有良好的抗菌作用。通過本試驗(yàn)結(jié)果可知，菊科和唇形科植物對油茶炭疽菌的抑菌活性相對高于其他科的植物。同種植物不同溶劑提取物的抑菌活性存在一定的差異，從抑菌結(jié)果可知，對于油茶炭疽病菌，益母草活性最好的是乙酸乙酯提取物，其次是甲醇提取物，水提取物的抑菌效果相對較差；臭靈丹石油醚提取物的抑菌活性遠(yuǎn)高于水提取物。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，乙酸乙酯提取物中的黃酮類化合物含量最高，而水提取物中的主要化學(xué)成分是多糖[29]，可見抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯和石油醚萃取物中。今后可進(jìn)一步追蹤益母草的乙酸乙酯萃取物和臭靈丹的石油醚萃取物對油茶炭疽病的抑菌活性成分并研究其抑菌機(jī)制，進(jìn)而為油茶炭疽菌生物防治及植物源殺菌劑的研制提供更多的理論支持。