雙盾木的快速繁殖技術(shù)研究

賈 越，樊思羽，汪銘溥，張李平，吉文麗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712199）

雙盾木（Dipeltafloripunda）屬隸屬忍冬科雙盾木屬，北溫帶植物區(qū)系中的古老、孑遺的木本屬之一[1]。聚傘花序、花鐘狀粉紅色，在陜西省寶雞地區(qū)花期為4月初至4月中旬，花期約10 d；花后一對苞片增大呈盾牌狀，十分奇特，是難得的園林觀賞植物，1996年被寶雞市植物園引種后其每年開花，但果實干癟無種仁，播種繁殖無望[2]。

目前有關(guān)雙盾木的文獻(xiàn)中，除扦插、葉綠體基因組分析與遺傳多樣性的ISSR分析外，有關(guān)其再生繁殖方面的研究在國內(nèi)尚屬空白。通過實驗，旨在探究雙盾木快繁技術(shù)各個階段所需最適培養(yǎng)基，以構(gòu)建雙盾木組織培養(yǎng)的繁殖技術(shù)體系為基礎(chǔ)，為忍冬科雙盾木屬其他植物的快速繁殖技術(shù)提供案例與借鑒意義；同時還能為秦嶺植物的引種馴化作出貢獻(xiàn)，豐富陜西地區(qū)鄉(xiāng)土植物景觀；并且在總體上增加園林觀賞植物種類的多樣性，提升我國園林生態(tài)城市水平。

1 實驗材料與條件

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

MS粉、無水乙醇、NaClO、NAA、6-BA、2，4-D、無菌水、瓊脂和蔗糖。

1.1.2 實驗器材

電磁爐鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、玻璃瓶、玻璃棒、量筒、電子天平、超凈工作臺、鑷子、解剖刀、電熱滅菌器、培養(yǎng)架和日光燈。

1.1.3 植物材料

西北農(nóng)林科技大學(xué)博覽園內(nèi)有3株從秦嶺引種繁殖的雙盾木植株，外植體材料均采集于此，主要選用幼嫩帶芽莖段部位和葉片來進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.2 實驗條件

1.2.1 外植體采集條件

外植體采集時應(yīng)選擇晴朗無云的天氣，上午9—11點或下午3—4點2個時間段為宜，可降低材料的污染率，提高誘導(dǎo)的成功率。

1.2.2 培養(yǎng)基的配置

（1）MS培養(yǎng)基的制作。在實驗過程中，誘導(dǎo)雙盾木愈傷組織產(chǎn)生的培養(yǎng)基采用：MS粉（4.43 g/L）+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，按照所需配量加入激素原液。

（2）植物生長調(diào)節(jié)劑的配置。6-BA原液：1 mg/mL（需加入少量NaOH將其溶解，再用無菌水進(jìn)行定容）；NAA原液：1 mg/mL（需加入少量鹽酸將其溶解，再用無菌水進(jìn)行定容）；2，4-D原液：1 mg/mL。

（3）培養(yǎng)基的配置。選用MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上，加入激素6-BA、NAA及2，4-D，并調(diào)節(jié)pH在5.8~6.0，完成后分裝至培養(yǎng)瓶即可。

2 實驗方法及參數(shù)選擇

2.1 初代培養(yǎng)

2.1.1 嫩芽的處理與培養(yǎng)

（1）處理方法。采取的嫩芽用軟毛刷輕輕刷去表面灰塵，清水沖洗干凈之后用無菌水沖洗3~5遍。

（2）消毒。在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上，將處理過的嫩芽先用75%酒精浸泡1 min，后以無菌水沖洗2~3遍；接著用10%的NaClO浸泡10~25 min，再用無菌水沖洗2~3遍，最后用無菌濾紙吸干表面水分。剝?nèi)ヒ粚油馄ず蠼臃N于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

為了確定最佳消毒時間，實驗按照15、20、25 min 3個時間梯度進(jìn)行消毒，每個梯度接種10瓶，每瓶接種1個外植體，共計30瓶。培養(yǎng)基添加MS粉（4.43 g/L），瓊脂（7 g/L），蔗糖（3 g/L），NAA，6-BA，pH 5.8~6.0。

（3）激素含量梯度實驗。針對最適誘導(dǎo)的激素梯度進(jìn)行實驗。選用NAA和6-BA作為實驗激素，NAA分為0.05、0.1、0.2 mg/L這3個梯度，6-BA分為0.5、1.0 mg/L這2個梯度，對其進(jìn)行交叉實驗，每組接種15瓶，每瓶接種3個外植體。

2.1.2 葉片的處理與培養(yǎng)

（1）處理方法。采取的葉片先用軟毛刷輕輕刷去表面灰塵，用清水沖洗干凈，重點清洗葉脈及葉片基部，最后用無菌水沖洗3~5遍。

（2）消毒方法。將葉片切成4 mm×4 mm左右的小塊，用75%酒精浸泡1 min后用無菌水沖洗2~3遍，接著用不同含量的NaClO溶液浸泡10~25 min，再用無菌水沖洗2~3遍，最后用無菌濾紙吸干表面水分，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

為了確定含量和時間，我們將NaClO含量分為10%、15%、18%、20%4個梯度，將消毒時間分為10、15、20、25 min 4個消毒時間梯度，每個梯度接種10瓶，每瓶接種2~3個葉片，共計120瓶。培養(yǎng)基添加MS粉（4.43 g/L）、瓊脂（7 g/L）、蔗糖（3 g/L）、2，4-D、6-BA并將pH調(diào)節(jié)至5.8~6.0。

（3）激素選擇。愈傷組織的分化與再生是植物實現(xiàn)由細(xì)胞到植株的過程。查閱雙盾木同科植物組織培養(yǎng)文獻(xiàn)后，選定激素6-BA和2，4-D進(jìn)行誘導(dǎo)實驗。

2.2 繼代培養(yǎng)

在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，獲得的愈傷組織數(shù)量有限，不能充分發(fā)揮組織培養(yǎng)快速繁殖的優(yōu)勢，所以需要根據(jù)初代培養(yǎng)中影響雙盾木培養(yǎng)的主要因素，合理選擇繼代培養(yǎng)基組合，以獲得大量增殖的材料。

實驗選定6-BA和NAA作為調(diào)控愈傷組織增殖的生長類激素，給6-BA設(shè)置1.0、1.5、2.0mg/L3個梯度；同時給NAA設(shè)置0.2、0.4 mg/L共2個梯度。

3 討論與結(jié)論

3.1 消毒方法

根據(jù)上述實驗中不同的消毒時間、NaCIO含量等參數(shù)選擇得出表1和表2數(shù)據(jù)。

表1 不同消毒時間嫩芽接種效果（污染率）比較

表2 愈傷形成情況

而不同葉片消毒時間和NaClO含量的對應(yīng)關(guān)系見表3。

表3 不同消毒時間、NaClO含量葉片接種效果（污染率）比較

由此得出結(jié)論：雙盾木嫩芽最佳滅菌方式為75%酒精處理60 s后用無菌水沖洗3~5遍，接著用10% Na－ClO溶液處理15 min，剝?nèi)ネ馊~片接入培養(yǎng)基，平均污染率最低可控制到2%；嫩葉最佳滅菌方式為75%酒精處理60 s后用無菌水沖洗3~5遍，接著用20%NaClO溶液處理15 min。

3.2 初代培養(yǎng)

根據(jù)不同的激素含量可得到表4中對應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)，可以看到：當(dāng)NAA為0.2 mg/L、6-BA為1.0mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

表4 嫩芽初代培養(yǎng)實驗結(jié)果

由此得出結(jié)論：嫩芽最適培養(yǎng)基配方組合為MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)86%。

3.3 繼代培養(yǎng)

按照2.2小節(jié)中不同梯度參數(shù)進(jìn)行交叉實驗，可得到表5中繼代增殖培養(yǎng)實驗數(shù)據(jù)。

表5 繼代增殖培養(yǎng)實驗結(jié)果

由此得出結(jié)論：愈傷組織適宜的繼代培養(yǎng)基組合為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖倍數(shù)達(dá)到1.292，且生長率較高，達(dá)到44.4%。其他幾組培養(yǎng)基雖也有增殖效果，但是增殖倍數(shù)均小于1.292，無不定芽發(fā)生。

4 建議與展望

在植物組織培養(yǎng)技術(shù)被廣泛運用的今天，作者認(rèn)為通過組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)雙盾木的大量繁殖存在廣闊的進(jìn)步空間，以及深入研究和推廣的價值。結(jié)合實驗，作者對雙盾木組織培養(yǎng)的研究提出以下幾點建議，希望這項研究在今后可以取得突破性進(jìn)展。

（1）選取外植體時，以幼嫩植物器官為主，越幼嫩的植物器官細(xì)胞活性越強，實驗也越容易成功[3]。同樣是4 mm×4 mm的葉片，剛生長出的嫩葉比半成熟葉片的出愈率高，未展葉嫩芽出愈率高于展葉嫩芽。

（2）合理確定消毒時間。一般的原則是莖大于葉大于芽，成熟器官大于幼嫩器官[4]。實驗中，嫩葉與嫩芽消毒時間一致的情況下，嫩葉所需消毒溶液含量是嫩芽的2倍。

（3）外植體消毒過后再進(jìn)行實驗時，應(yīng)剝掉最外層表皮；選用嫩芽做外植體時，在接種過程中要剝除最外層包被葉片。

（4）在培養(yǎng)出愈傷組織后，可以直接進(jìn)行生根培養(yǎng)，免去生成不定芽的步驟，縮短試驗周期[5]。推薦使用當(dāng)年生枝，更容易生成愈傷組織；若遇到雙盾木休眠期，可以從休眠植株上剪下有芽新枝在溫室進(jìn)行水培。