設(shè)施栽培黃瓜長期連作對(duì)土壤真菌多樣性的影響

孫淑欣，劉慧聰，馮雪鋒，張志芳，賈海麗

（商丘學(xué)院，河南商丘 476000）

設(shè)施栽培是綜合應(yīng)用工程裝備、生物及環(huán)境技術(shù)，創(chuàng)造適宜的蔬菜生長環(huán)境，實(shí)現(xiàn)蔬菜高效生產(chǎn)的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式。黃瓜（L.）因其產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)利益高，市場需求高，在我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，也是我國設(shè)施栽培的主要蔬菜作物之一。由于生產(chǎn)條件限制、種植習(xí)慣以及經(jīng)濟(jì)利益因素，設(shè)施栽培種植面積逐年增加。

設(shè)施栽培蔬菜比傳統(tǒng)種植產(chǎn)量高、質(zhì)量好、上市早，但其也存在諸多不足，設(shè)施栽培黃瓜易出現(xiàn)病蟲害，有明顯連作障礙現(xiàn)象。連作障礙形成的主要原因是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能類群發(fā)生變化，導(dǎo)致土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡。土壤微生物在土壤中扮演著重要角色，對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收轉(zhuǎn)化及作物生長發(fā)育具有顯著影響。研究表明，連作使屬水平上真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，根際土壤微生物群落多樣性降低，有益微生物豐度減少、有害微生物豐度增加。連作也會(huì)使土壤發(fā)生酸化，鹽分積累，并且隨著連作年限的增加，土壤酸化和鹽漬化會(huì)加重，同時(shí)連作易引起作物營養(yǎng)元素缺乏、化感及自毒作用。微生物是評(píng)價(jià)土壤肥力的一種關(guān)鍵指標(biāo)，也是土壤生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分，研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化有助于明確設(shè)施栽培中連作障礙發(fā)生機(jī)制，能夠更好的種植作物，以獲得更高產(chǎn)量，同時(shí)也在一定程度上提升作物的品質(zhì)。

因此，本研究以設(shè)施栽培黃瓜不同連作年限的根際土壤為研究對(duì)象，通過形態(tài)學(xué)鑒定研究黃瓜不同連作年限對(duì)根際土壤真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成的影響，以此初步探索黃瓜連作障礙的形成機(jī)制，以期為后期緩解設(shè)施黃瓜連作障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品采集于2021 年3 月，采集地點(diǎn)為河南省洛陽市洛龍區(qū)李樓鎮(zhèn)董村，在設(shè)施栽培黃瓜連作5 年、12 年以及未栽培過蔬菜的溫室外土壤采用“五點(diǎn)取樣法”進(jìn)行土樣的采集。取距離地面4～10 cm 的土壤，最后混合土樣，去除雜草后，立即放入干冰中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80℃冰箱中保存，用于微生物多樣性的研究，不同土樣分別做上標(biāo)記，并詳細(xì)記錄樣品采集的日期、地點(diǎn)及相關(guān)信息。

1.2 土壤真菌分離

采用稀釋平板法，孟加拉紅培養(yǎng)基進(jìn)行土壤真菌分離。稱取1 g 土壤置于9 mL 無菌水中，充分震蕩混勻，用移液槍吸取1 mL的懸浮液置于另一9 mL的無菌水中，充分震蕩混勻，再從此懸浮液中吸取1 mL懸浮液置于新的9 mL的無菌水中，同樣震蕩搖勻，同樣的方法稀釋至10，選用10、10、10、10四個(gè)梯度，每個(gè)梯度涂布10 個(gè)平板，標(biāo)明日期、土樣及濃度，然后用移液槍分別從相應(yīng)的土壤稀釋液中吸取200 μL，用涂布器涂布均勻，放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，然后對(duì)真菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，之后轉(zhuǎn)移到PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。

1.3 土壤真菌純化與鑒定

涂布5 d 后觀察菌落生長情況，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色以及長出時(shí)間不同，用挑針挑取菌落邊緣菌絲在新PDA 培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，純化后3～5 天對(duì)純化的菌落進(jìn)行形態(tài)特征觀察，并做相應(yīng)記錄。然后通過顯微鏡，觀察純化菌菌絲結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)特征，根據(jù)真菌形態(tài)分類學(xué)原理，參照相關(guān)資料對(duì)分離的真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定各分離菌的種屬地位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

真菌培養(yǎng)5 d 后開始統(tǒng)計(jì)并記錄菌落數(shù)，并分別對(duì)三種土樣中分離出來的土壤真菌菌落數(shù)量進(jìn)行分析比較，分離率計(jì)算公式如下：

真菌分離率（%）=某一分離真菌的菌落數(shù)/所有分離真菌的菌落數(shù)×100

采用多樣性指數(shù)（'）、豐富度指數(shù)（）、均勻度指數(shù)（）和Jaccard 相似性指數(shù)（）對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。

＝/其中，為第種物種個(gè)體數(shù)，為總個(gè)體數(shù)，為每個(gè)樣品中的物種總數(shù)。

其中a，b 表示兩種生境類型中的真菌的屬數(shù)或種數(shù)；c 表示兩種生境中共有的真菌屬數(shù)或種數(shù)。

根據(jù)Jaccard 相似性系數(shù)原理：當(dāng)為0.00～0.25 時(shí)，為極不相似；當(dāng)為0.25～0.50 時(shí)，為中等不相似；當(dāng)為0.50～0.75 時(shí)，為中等相似；當(dāng)為0.75～1.00 時(shí)，為極相似。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同連作年限土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成

通過對(duì)設(shè)施栽培黃瓜連作5 年、12 年以及未栽培過蔬菜的溫室外土壤進(jìn)行采集，經(jīng)分離、純化，大田土樣共分離出了75 株菌株，黃瓜連作5 年的土樣分離出96 株菌株，黃瓜連作12 年的土樣分離出236 株菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，3 種土樣在屬水平上共包含12 屬31 種（如圖1 至圖12），其它139 株不產(chǎn)生子實(shí)體結(jié)構(gòu)，統(tǒng)一歸為不產(chǎn)孢類群真菌。其中大田土樣分離和鑒定出10 屬17 個(gè)種，已鑒定屬包括根霉屬、毛殼菌屬、串珠菌屬、青霉屬、曲霉屬、殼色多隔孢屬、毛霉屬、地霉屬、輪枝孢屬和鏈格孢屬；設(shè)施黃瓜連作5 年的土樣初步鑒定出8 屬15 個(gè)種，已鑒定屬包括曲霉屬、青霉屬、根霉屬、毛霉屬、地霉屬、輪枝孢屬、腐霉屬和鏈格孢屬；設(shè)施黃瓜連作12 年的土樣經(jīng)鑒定初步得出5 屬16 種，包括曲霉屬、青霉屬、串珠菌屬、毛霉屬和鐮孢屬。

圖1 青霉屬分生孢子及分生孢子梗

圖2 曲霉屬分生孢子及分生孢子梗

圖3 根霉屬菌落形態(tài)、假根及孢囊孢子

圖4 串珠菌屬菌落形態(tài)及分生孢子

圖5 鏈格孢屬菌落形態(tài)及分生孢子

圖6 毛殼菌子囊殼及子囊孢子

圖7 腐霉屬菌落形態(tài)及孢子囊、菌絲

圖8 殼色多隔孢屬菌落形態(tài)及分生孢子

圖9 鐮孢屬菌落形態(tài)及分生孢子

圖10 地霉屬菌落形態(tài)、菌絲及分生孢子

圖11 枝孢屬菌落形態(tài)及孢子

圖12 毛霉屬孢囊梗、菌絲及孢子囊

由表1 可看出，經(jīng)過分離和初步形態(tài)學(xué)鑒定，在分離獲得的大田土壤真菌類群中，地霉屬、毛殼菌屬、青霉屬和無孢類群為優(yōu)勢種群，地霉屬真菌數(shù)量最多，占大田土壤真菌總菌株數(shù)的40.00%，青霉屬和毛殼菌屬數(shù)量相差不大，其分離率分別為12.00%和13.33%；輪枝孢屬、毛霉屬和鏈格孢屬為亞優(yōu)勢種群，其余的為弱勢種群。

表1 不同連作年限土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成

與大田土壤真菌相比，設(shè)施黃瓜連作5 年的土壤中曲霉屬和根霉屬的種類和數(shù)量均有增加，總的真菌種類有所減少。其中曲霉屬和無孢類群真菌為優(yōu)勢種群，分別占黃瓜連作5 年土壤總菌株數(shù)的43.75%和20.83%；根霉屬和輪枝孢屬為亞優(yōu)勢種群，其分離率分別為11.46%和13.54%；青霉屬、鏈格孢屬、腐霉屬、地霉屬和毛霉屬真菌為弱勢種群，其分離率分別為4.17%、3.13%、1.04%、1.04%和1.04%。

設(shè)施黃瓜連作12 年的土樣中曲霉屬和無孢類群真菌為優(yōu)勢種群，占黃瓜連作12 年土壤真菌總菌數(shù)的分離率分別為41.53%和46.61%；青霉屬真菌為亞優(yōu)勢種群，其分離率為8.47%，其余各屬為弱勢種群。

2.2 不同連作年限土壤真菌群落多樣性分析

連作年限不同的黃瓜根際土壤真菌種群的多樣性水平存在差異，如表2 所示。隨著連作年限的增加，土壤真菌屬水平種類逐漸減少，菌株數(shù)逐漸增加，某些真菌種群積累；同樣，隨著連作年限的增加，土壤真菌群落的多樣性指數(shù)（′）、均勻度指數(shù)（）和豐富度指數(shù)（）均逐漸降低，大田土壤多樣性指數(shù)最高，其數(shù)值為1.85，均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)也是最高，其值分別為0.77、2.32。

表2 不同連作年限土壤真菌群落多樣性

2.3 不同連作年限土壤真菌相似性分析

經(jīng)過土壤真菌的分離鑒定，大田土壤真菌與設(shè)施黃瓜連作5 年的土壤真菌有3 種菌相同；大田土壤真菌與設(shè)施黃瓜連作12 年的土壤有2 種真菌相同；設(shè)施黃瓜連作5 年的土壤真菌與設(shè)施黃瓜連作12 年的土壤有2 種真菌相同。由Jaccard 相似性指數(shù)公式可得不同連作年限土壤的真菌群落相似性系數(shù)（表3）。

表3 不同連作年限土壤的真菌群落相似性系數(shù)

通過比較不同土壤真菌的發(fā)現(xiàn)大田和設(shè)施黃瓜連作5 年、設(shè)施黃瓜連作5 年和設(shè)施黃瓜連作12 年的相似性指數(shù)均在0.25～0.50，根據(jù)Jaccard 相似性系數(shù)原理，這兩種為中等不相似；而大田和設(shè)施黃瓜連作12 年的相似性指數(shù)在0～0.25，其為極不相似?？梢钥闯鰞烧咧g連作年限越長，土壤真菌差別越大相似性越低。

3 結(jié)論與討論

設(shè)施連作栽培是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其是專業(yè)化生產(chǎn)比較明顯的地區(qū)或生產(chǎn)單位廣泛應(yīng)用的一種種植方式。長時(shí)間的連作會(huì)使土壤水分大量的消耗；營養(yǎng)物質(zhì)的不均衡消耗；連作也會(huì)使植物體內(nèi)積累有毒物質(zhì)，產(chǎn)生自毒作用；連作會(huì)導(dǎo)致作物病蟲草害加重；連作同樣會(huì)導(dǎo)致土壤供肥能力的降低，以及導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的改變。

土壤微生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能多樣性對(duì)維持土壤系統(tǒng)健康有極其重要的作用，而土壤微生物結(jié)構(gòu)和活性的穩(wěn)定性取決于微生物多樣性。本研究通過對(duì)設(shè)施黃瓜不同連作年限土樣的分離鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，真菌種類多樣性逐漸降低，但是真菌總數(shù)量逐漸增加，這與連作對(duì)菠蘿、植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果相似。隨著連作年限的增加，土壤中優(yōu)勢種群發(fā)生變化，曲霉屬真菌逐漸成為優(yōu)勢種群，根霉屬、鐮孢屬、輪枝孢屬、鏈格孢屬等病原菌數(shù)量逐漸增加，這與鄭立偉等人研究結(jié)果一致。鐮刀菌能夠引起莖基腐病和枯萎病等病害，鏈格孢屬真菌是引起植物葉枯病的主要病原菌等，對(duì)作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失。

綜上所述，設(shè)施黃瓜長期連作的土壤中真菌種群產(chǎn)生了顯著的影響。隨著連作年限的增加，土壤中優(yōu)勢種群發(fā)生變化，病原微生物數(shù)目增加，逐漸成為優(yōu)勢種群，但土壤中真菌種類越來越少，多樣性降低；連作年限間隔期越長，兩種土壤之間的相似性越低；隨著連作年限的增加，土壤真菌群落的多樣性指數(shù)（′）逐漸降低，病原菌均勻度指數(shù)（）和豐富度指數(shù)（）逐漸增加，這與Liu Hang等研究結(jié)果基本一致。連作使病原菌種群數(shù)目富集，但有益真菌種群數(shù)目減少，連導(dǎo)致真菌種群平衡被破壞，植物根際微生態(tài)平衡被破壞，不利于作物的生長。

本研究通過對(duì)大田和設(shè)施黃瓜連作土壤真菌的分離鑒定，初步分析出了設(shè)施黃瓜連作對(duì)土壤真菌多樣性的影響，對(duì)于指導(dǎo)設(shè)施黃瓜栽培地土壤多樣性的生產(chǎn)和科學(xué)防治土傳病害具有重要作用。