信陽地區(qū)番茄果腐病病原菌的分離鑒定

谷清義，梅 陽，耿曉桐，張耀洲，申 君

（信陽農(nóng)林學(xué)院，河南信陽 464000）

番茄（）是一年生茄科植物，原產(chǎn)于南美，因其獨特的風(fēng)味和較高的營養(yǎng)價值而成為全球蔬菜的主要栽培品種，成為全球消費最多的蔬菜之一。番茄在生長過程中病害多達20多種。其中，番茄果腐病是果實成熟與貯藏期極易發(fā)生的一種病害，嚴重影響番茄的品質(zhì)。番茄果腐病的危害以成熟果實為主，發(fā)病初期果面呈現(xiàn)淺色斑，后期病斑呈褐色，無清晰邊緣，擴大后布滿整個果面。嚴重時引起果實腐爛，脫落。

番茄果腐病在信陽地區(qū)多有發(fā)生，嚴重影響番茄的產(chǎn)值和品質(zhì)。本試驗以信陽市甘岸鎮(zhèn)蔬菜大棚采摘的番茄為研究對象，采用組織分離法對病原菌進行分離純化，利用柯赫氏法則進行致病性測定，并結(jié)合形態(tài)特征和18S rDNA-ITS 基因序列對病原菌進行初步鑒定，為進一步研究信陽番茄病害的發(fā)生規(guī)律及防治提供理論依據(jù)，以期為培育抗番茄果腐病材料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：采自信陽市甘岸鎮(zhèn)大棚番茄，貯藏期間自然發(fā)病的果實。

接種材料：新鮮、健康的番茄，購自超市。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g、無菌蒸餾水定容至1000 mL（高壓蒸汽121℃滅菌20 min）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化

采用組織分離法進行病原菌的分離純化。在超干凈工作臺上，于發(fā)病果的病健交界處取約3 mm×3 mm 的塊狀果皮組織，用體積分數(shù)75%的酒精消毒15 s，3%的NaClO 溶液消毒15 s，無菌水沖洗4 次，用無菌濾紙吸掉表層水分。將組織塊轉(zhuǎn)移到PDA 平板上，在25℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落長出后挑取邊緣菌絲進行純化培養(yǎng)，重復(fù)3 至4 次純化培養(yǎng)，獲得的純化菌株在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的致病性測定

按照柯赫氏法則對分離到的病原菌進行致病性測定。將分離得到的病原菌在PDA 上25℃黑暗培養(yǎng)5 d，將病原菌用無菌蒸餾水制成濃度1×10個/mL的孢子懸液。選取無病健康的番茄果實，用2%的NaClO 溶液浸泡2 min，無菌水沖洗并晾干。用滅菌過的接種針在番茄果實表面刺出傷口，在傷口處接種孢子懸液30 μL；設(shè)5 次重復(fù)，以清水作對照，置于25℃保濕培養(yǎng)，待發(fā)病后從接種發(fā)病的果實上再次分離出致病菌株病原菌，完成柯赫氏法則驗證。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基上，置于恒溫箱中25℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌株在培養(yǎng)基的生長狀況，5 d 后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落的培養(yǎng)特征、菌絲體形態(tài)、分生孢子的形態(tài)以及有無分生孢子梗等特征，根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，初步判斷病原菌的分類地位。

1.2.4 病原菌的分子鑒定

將菌株轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，5 d 后菌絲布滿培養(yǎng)皿。刮取新鮮菌絲，采用CTAB 法提取FQ-1菌株的總DNA。對FQ-1 菌種的DNA 進行PCR擴增，PCR 擴增采用真菌核糖體DNA 通用引物ITS1 和ITS4，ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCT TATTG ATATGC-3’。將PCR 擴增后得到的產(chǎn)物送到武漢擎科生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank 中相關(guān)序列進行比對分析，以確定FQ-1 菌株類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌FQ-1 的發(fā)病癥狀和分離

利用組織分離法從10 份番茄病果上分離培養(yǎng)并純化后，獲得6 株病原菌，將其中一株優(yōu)勢菌株命名為FQ-1，進行后續(xù)試驗。該病害危害番茄成熟的果實（圖1A），發(fā)病部位有形成不規(guī)則的圓形、白色乃至黃白色病斑，病斑處略凹陷有白色絮狀菌絲，后期病斑變成暗黃色，果實腐爛，散發(fā)出異味。

2.2 病原菌FQ-1 的致病性檢測

將分離得到的病原菌FQ-1 采用離體刺傷接種法接種于健康果實表面（圖1B）。接種3d 后番茄表面有明顯病斑，導(dǎo)致番茄表面形成圓形，黃白色、水漬狀病斑，病斑凹陷能看到清晰邊緣，隨后變成暗黃近褐色，病部褐變軟腐，有異味，與自然番茄發(fā)病的癥狀相同。對回接發(fā)病果實進行再分離，獲得與接種菌菌落特征一致的分離物，說明分離病原物為致病菌。

圖1 番茄果腐病自然發(fā)?。ˋ）和人工接種（B）癥狀

2.3 FQ-1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

從自然發(fā)病的番茄上分離出病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，屬于鐮刀菌屬（）。將分離到的病原菌依照柯赫氏法則回接鑒定，發(fā)現(xiàn)為致病菌株。

FQ-1 菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)時生長迅速（圖2A），3d 菌落直徑達到52 mm，大量氣生菌絲初期為白色后變?yōu)榘迭S色，PDA 培養(yǎng)基背面為白色或米黃色。分生孢子頂細胞彎曲（圖2B），兩端尖，具單隔膜，無色透明；未見厚垣孢子，分生孢子大小不一，內(nèi)部有0～3 個隔膜。

圖2 番茄果腐病病原菌FQ-1 形態(tài)特征

2.4 FQ-1 菌種的分子鑒定

提取病原菌FQ-1 的總DNA，對rDNA-ITS 基因序列進行PCR 擴增，獲得的基因片段大小為565 bp，將獲得的 rDNA-ITS 序列（登錄號：ON993227）與GenBank 上的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)其與（MT032393）、（MT012109）、（MK228625）、sp.（GQ352485）、（MG020430）、（MT032394）等6 種鐮刀菌的同源性都99%以上。因此初步確認FQ-1 菌株是鐮刀菌，仍需對其序列和序列進行測定，將FQ-1菌種鑒定到種。

3 結(jié)論與討論

番茄因果皮薄、組織柔嫩多汁并富含糖分，采后儲存過程中容易感染微生物而發(fā)病腐爛。番茄成熟期或采后病害主要是果腐病。番茄果腐病的主要原因是病原菌的入侵。有研究表明，引起番茄果腐病的病原菌主要有尖孢鐮刀菌（）、灰葡萄孢（）、擴展青霉（）和立枯絲核菌（）等。本試驗通過對信陽市甘岸鎮(zhèn)大棚番茄進行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，初步確定從番茄上分離純化得到的病原菌FQ-1 為鐮刀菌，與王振學(xué)等從番茄中分離的病原菌為尖孢鐮刀菌相同。鐮刀菌（）廣泛存在于自然界中，是一類重要的植物病原真菌，能夠引起寄主產(chǎn)生根腐、萎蔫、葉斑、果腐等癥狀，危害果實比較嚴重，綠果和紅熟果都可以發(fā)病，紅熟果發(fā)病更嚴重。鐮刀菌除引起番茄果腐病外，還能造成番茄枯萎病、甘草根腐病、豌豆根腐病、蠶豆苗期根腐病、馬鈴薯根腐病等。

本試驗利用rDNA-ITS 序列僅鑒定出果腐病菌屬于鐮刀菌，而未將FQ-1 菌株鑒定到種，接下來需對其序列和序列進行測定，對其進行準確鑒定，并對其生物學(xué)特性和防治藥劑進行研究。