一測多評法同時測定不同產(chǎn)地淫羊藿提取物中的4種黃酮類成份

吳 蕾

(安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，合肥 230091)

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬EpimediumLinn.植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國有悠久的藥用歷史[1]，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效，在養(yǎng)殖方面主要以提取物的形式應(yīng)用以提高動物的生產(chǎn)、繁殖性能，其在混合型飼料添加劑市場有著廣泛的應(yīng)用。但目前淫羊藿提取物還缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亟需建立一個統(tǒng)一、全面、客觀的淫羊藿提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]。淫羊藿含多種藥理活性成分如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷等，這些成份進入體內(nèi)后協(xié)同發(fā)揮作用，故其質(zhì)量控制應(yīng)綜合考慮多種藥理活性成分含量的測定，才能更加全面地反映提取物的內(nèi)在質(zhì)量?！耙粶y多評法”(Quantitative Analysis of Multi-components with a Single-marker, QAMS)是近年來得到良好應(yīng)用的中藥類復(fù)雜成分評價方法，已在《中國藥典》中成功應(yīng)用于多個品種[3]。QAMS法通過測定一個易得有效成分而實現(xiàn)中藥多成分定性定量，是適合中藥特點的多指標(biāo)質(zhì)量控制和評價模式[4-6]。本研究以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)物，建立朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷的相對校正因子(relative correlation factor, RCF)，并對QAMS法與外標(biāo)法所得結(jié)果進行比較，以驗證QAMS法的可行性和準(zhǔn)確性，旨在為淫羊藿提取物多指標(biāo)成分質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；D3000高效液相色譜儀(美國Thermofisher公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；SQP十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；KS500超聲波清洗器(寧波科生儀器廠)；VD23減壓干燥箱(德國BINDER)；恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)。

三批淫羊藿藥材購自安徽省亳州康美中藥大市場，產(chǎn)地分別為甘肅、吉林、陜西，樣品經(jīng)合肥市食品藥品檢驗中心王瑋主任藥師鑒定，購自吉林的藥材為朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai，購自陜西、甘肅的藥材為柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim，藥材打粉經(jīng)乙醇回流濃縮減壓干燥后分別制備成提取物備用。另三批淫羊藿提取物由四川恒瑞通達生物科技有限公司提供，批號分別為200303、200302、200401。朝藿定A(批號110623-72-8)、朝藿定B(批號110623-73-9)、朝藿定C(批號110642-44-9)對照品均購自上海安譜有限公司，HPLC(峰面積歸一化法)純度98%；淫羊藿苷(批號110737-201516)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度94.2%。乙腈、甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法原理 QAMS法是指在多指標(biāo)質(zhì)量評價時，以藥材中某一典型組分(有對照品供應(yīng)者)為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的RCF，通過RCF計算其他組分的含量[7]。計算公式為：fkm=fk/fm=Wk×Am/Wm×Ak，Ak為內(nèi)標(biāo)物(k)峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物(k)濃度，Am為其他組分(m)峰面積，Wm為其他組分(m)濃度。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相乙腈-水(25∶75)，柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，理論板數(shù)按淫羊藿苷計應(yīng)≥5000，色譜圖見圖1、圖2。

圖1 朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of Epimedin A, Epimedin B, Epimedin C and Icariin

圖2 淫羊藿提取物樣品色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of Epimedium extract

2.2.2 對照品溶液的制備 取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別配置成濃度為1 mg/mL的儲備液。精密吸取以上儲備液各25 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL至10 mL量瓶中，甲醇定容，分別配置成2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL的混和線性標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存于4 ℃冰箱中，備用，有效期1個月。

2.2.3 供試品溶液的制備 取淫羊藿提取物(過80目篩)0.1 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%乙醇溶液，稱定重量，超聲30 min(140 W，頻率40 kHz)，放冷后再稱重，以50%乙醇補足重量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述混合線性標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定,記錄峰面積。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理，分別得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1，各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性良好。

表1 淫羊藿提取物中4種黃酮類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 1 The regression equations and linear ranges of 4 chemical reference substances in Epimedium extract

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液(四川恒通，批號200302)10 μL連續(xù)進樣6次，記錄朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的峰面積，得出日內(nèi)精密度分別為2.3%、2.0%、2.4%和1.5%，連續(xù)進樣3 d，每天6次，記錄峰面積，以上4種指標(biāo)成分日間精密度分別為2.3%、2.2%、2.0%、1.6%。

2.2.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(四川恒通，批號200302)，分別于配置后0、2、4、8、12、24 h注入高效液相色譜儀，依法測定,記錄峰面積，得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷穩(wěn)定性的RSD分別為2.0%、1.9%、2.5%、1.5%，表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 按上述供試品溶液制備方法，分別稱取同一批淫羊藿提取物(四川恒通，批號200302)約0.1 g，共6份,分別進行測定, 測得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的平均含量分別為3.88、8.05、6.18、14.01 mg/g，RSD分別為2.1%、2.1%、2.2%、1.1%。

2.2.8 回收率試驗 采取加樣回收率法(按1∶1加入)，取同一批已知含量的淫羊藿提取物(四川恒通，批號200302)約0.1 g共6份，精密稱定，分別精密加入一定量的2.2.2項下混合對照品溶液，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，精密吸取上述供試品溶液10 μL，依法測定，計算回收率，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的加樣回收率分別為93.6%、95.5%、100.1%、92.4%，RSD分別為2.2%、1.8%、2.2%、2.1%。

2.3 校正因子的測定及考察

2.3.1 校正因子的測定 取2.2.2項下濃度為20 μg/mL對照品混合溶液，分別進樣10 μL，測定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的峰面積，按照2.1項下方法分別計算朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與內(nèi)參物淫羊藿苷間的RCF，結(jié)果見表2。

表2 相對校正因子的測定Tab 2 Results of the RCFs tests

2.3.2 校正因子的重復(fù)性試驗 按照2.2.2項下方法，配制混合對照品溶液，平行4份，分別進樣10 μL，分別計算朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與內(nèi)參物淫羊藿苷間的RCF。表3結(jié)果顯示，RSD≤3.0%，表明RCF重復(fù)性良好。

表3 相對校正因子重復(fù)性試驗Tab 3 Results of RCFs repeatability tests

2.3.3 校正因子的耐用性考察

2.3.3.1 不同儀器對校正因子的影響 試驗中采用eclipse plus C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)分別在Agilent 1260和Thermofisher D3000進樣測定，對淫羊藿類黃酮間的RCF進行了測定。表4結(jié)果顯示，在不同品牌色譜儀上RCF無顯著性差異，RSD≤3.0%。

表4 采用不同儀器測得的相對校正因子Tab 4 RCFs measured in different instruments

2.3.3.2 不同色譜柱對校正因子的影響 試驗中在不同高效液相色譜儀(Agilent 1260、Thermofisher D3000)上，分別試驗2種不同品牌的色譜柱eclipse plus C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)和Symmetry C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，對4種淫羊藿類黃酮間RCF進行了測定。結(jié)果顯示，RCF無顯著性差異，RSD≤3.0%(表5和表6)。

表5 采用不同色譜柱測得的相對校正因子-Agilent 1260Tab 5 RCFs measured in different chromatographic columns-Agilent 1260

表6 采用不同色譜柱測得的相對校正因子-Thermofisher D3000Tab 6 RCFs measured in different chromatographic columns-Thermofisher D3000

2.3.3.3 不同柱溫對校正因子的影響 采用Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)和eclipse plus C18色譜柱，分別在不同柱溫(25、30、35 ℃)條件下對4種淫羊藿黃酮間的RCF進行測定。表7結(jié)果顯示，RCF無顯著性差異，RSD≤3.0%。

表7 采用不同柱溫測得的相對校正因子Tab 7 RCFs measured at different temperatures

2.3.3.4 不同流速對校正因子的影響 采用Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)和eclipse plus C18色譜柱，分別在不同流速(0.9、1.0、1.1 mL/min)條件下對4種淫羊藿黃酮間的RCF進行了測定。表8結(jié)果顯示，RCF無顯著性差異，RSD≤3.0%。

表8 采用不同流速測得的相對校正因子Tab 8 RCFs measured at different flow rates

2.3.3.5 校正因子的確定 在上述色譜條件下，分別測定不同進樣體積時,按照2.1項下的方法，以淫羊藿苷(Icarrin，簡稱I)為內(nèi)標(biāo), 計算朝藿定A(Epimedin A，簡稱A)、朝藿定B(Epimedin B，簡稱B)、朝藿定C(Epimedin C，簡稱C)的RCF分別為0.831、0.820、0.918。

2.4 待測組分色譜峰的定位 本文采用相對保留值(待測成分與內(nèi)標(biāo)調(diào)整保留時間之比)作為定位標(biāo)準(zhǔn)，并在不同品牌高效液相色譜系統(tǒng)和不同色譜柱下對此參數(shù)進行考察，見表9，各成分的相對保留值波動較小，RSD≤3.0%，表明利用相對保留值進行峰的定位是可行的。

表9 不同儀器和色譜柱下測得的相對保留值Tab 9 Relative retention values measured in different instruments and columns

2.5 淫羊藿提取物含量測定QAMS法與外標(biāo)法的結(jié)果比較 分別稱取淫羊藿提取物(過80目篩)約0.1 g (n=4)，精密稱定，按2.2.3項下方法制備各供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定。采用外標(biāo)法和QAMS法計算自提及市售的淫羊藿提取物中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量，見表10。外標(biāo)法測定的含量值與QAMS法測定的含量值經(jīng)t檢驗比較，P>0.05，表明這兩種方法測得結(jié)果無顯著性差異，由此說明QAMS法可用于淫羊藿提取物的多成分質(zhì)量評價研究。

表10 不同方法所測得的黃酮類物質(zhì)含量(n=2)Tab 10 Positioning results of the 4 analytes measured by QAMS and ESM methods mg/g

3 討論與結(jié)論

本試驗初期分別以50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇4種提取溶劑進行超聲提取，發(fā)現(xiàn)以50%乙醇提取30 min具有相對較高的提取率。另外通過查閱文獻，分別以乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液等為流動相，比較其峰型、基線、分離度等，發(fā)現(xiàn)乙腈-水作為流動相既簡便又可滿足分離需求，故根據(jù)結(jié)果分析，確定了色譜條件。

本試驗還分別考察了不同色譜柱、不同儀器下各待測組分色譜峰的保留時間及相對保留時間，結(jié)果顯示各保留時間差異顯著，但其與內(nèi)標(biāo)物的相對保留時間波動較小。因此采用相對保留時間法進行淫羊藿藥材中各待測組分色譜峰的定位。

中藥成分的多樣性和整體作用機理，決定了單一成分不能全面反映中藥材的質(zhì)量。以《中國藥典》為代表的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)確立了“從單指標(biāo)向多指標(biāo)、從指標(biāo)性成分向藥效成分控制”的發(fā)展方向[8-9]。QAMS法可以實現(xiàn)通過測定一種成分的含量達到多指標(biāo)控制的目的，能夠一定程度上解決中藥對照品供應(yīng)緊缺、價格昂貴等問題。在《中國藥典》中，QAMS法已成功應(yīng)用于丹參、生姜等藥材，是目前中藥質(zhì)量控制和評價模式新的發(fā)展趨勢之一[3]。淫羊藿含多種活性成分，僅依據(jù)淫羊藿苷對其進行質(zhì)量評價，無法真實評價其內(nèi)在質(zhì)量，且淫羊藿經(jīng)歷提取過程轉(zhuǎn)換成提取物后，不同廠家提取工藝、水平不同將極大的影響提取物的質(zhì)量及藥理活性，故其質(zhì)量評價需要一個多指標(biāo)綜合性評價方式。本試驗通過一系列方法學(xué)考察證明了QAMS法能夠綜合反映淫羊藿提取物的整體質(zhì)量且不提高分析成本，驗證了QAMS法在淫羊藿提取物質(zhì)量控制中的可行性和適應(yīng)性，為此類中藥的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考方法。