HPLC法同時測定和評價“黔中金蕎麥”中4種成分含量

陶小艷，張 濤，周思旋，向清華，唐遠(yuǎn)江，趙 宇，盧昱希，史開志

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550004)

金蕎麥[Fagopyrumdibotrys(D. Don) Hara] 屬于蓼科蕎麥屬植物，收錄于《中華人民共和國藥典》、《中華人民共和國獸藥典》和《飼料藥物添加劑允許使用品種目錄》以及《飼料原料目錄》中，其野生品種為國家Ⅱ級重點保護植物[1]，既可作為藥物使用，又可作為飼料以及飼料添加劑使用，適用范圍廣，應(yīng)用價值高。藥用部位塊狀根莖具有清熱解毒、排膿消腫清肺排痰等功效，歸肺經(jīng)，對呼吸系統(tǒng)疾病有一定療效，現(xiàn)代藥理研究表明，金蕎麥具有抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗過敏、增強免疫等作用[2～3]。為了保護和利用好野生金蕎麥這一優(yōu)質(zhì)植物資源，貴州省畜牧獸醫(yī)研究所以貴州黔中地區(qū)野生金蕎麥作為親本，栽培馴化而成牧草新品種“黔中金蕎麥”，其先后通過省級和國家級牧草品種審定。經(jīng)選育的“黔中金蕎麥”適應(yīng)性較強、營養(yǎng)價值高、抗病蟲害性強、耐刈割利用、易繁殖，高蛋白低纖維利于消化，是飼養(yǎng)豬、雞、等畜禽喜食的優(yōu)質(zhì)青飼牧草[4～5]。艾蓉等以“黔中金蕎麥”替代部分精糧飼喂豬和雞，發(fā)現(xiàn)可降低養(yǎng)殖成本、提高經(jīng)濟收益[6]。鄧蓉等評價“黔中金蕎麥”的種草養(yǎng)畜社會生態(tài)效益，發(fā)現(xiàn)“黔中金蕎麥”的種植不僅可以提高種植經(jīng)濟效益，還可提高土壤肥力、改善水土流失[7]?，F(xiàn)已廣泛種植并應(yīng)用于貴州省六盤水、大方、黔西、威寧、息烽等10余個縣(市)的生態(tài)畜牧養(yǎng)殖，取得了一定成效[8]。

金蕎麥中的化學(xué)成分多以酚酸類、黃酮類和萜類為主，發(fā)揮的作用也多是這些化合物?！扒薪鹗w麥”作為藥飼兼用、綠色環(huán)保的優(yōu)質(zhì)牧草，化學(xué)成分也比較豐富，但金蕎麥在中國藥典中的含量測定標(biāo)準(zhǔn)是表兒茶素(C15H14O6)，評價指標(biāo)太過單一，無法全面來評價金蕎麥的質(zhì)量，因此,本試驗以大中小極性的黃酮類物質(zhì)及物質(zhì)總和為指標(biāo)來綜合評價 “黔中金蕎麥”的質(zhì)量，采用高效液相色譜法同時測定“黔中金蕎麥”與野生金蕎麥中表兒茶素、原花青素B2、蘆丁和槲皮素4種成分的含量，旨在建立一種簡便快捷、準(zhǔn)確可靠的質(zhì)控方法，以及分析“黔中金蕎麥”與野生金蕎麥在這4種成分含量上的差異，有效控制藥材的內(nèi)在質(zhì)量，充分保障其藥用價值。此試驗試驗亦可為“黔中金蕎麥”作為藥用資源選育、飼料添加劑開發(fā)以及用于臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 試驗藥材 2020 年于貴州省畜牧獸醫(yī)研究所麥坪試驗基地分別選擇種源、栽培環(huán)境和管理條件一致的1～3年生及不同季節(jié)栽培地采集“黔中金蕎麥”塊根樣品共5份；從麥坪試驗基地遷至黔西種植的“黔中金蕎麥”塊根樣品1份；在龍里、丹寨、普安、關(guān)嶺和羅甸等收集野生金蕎麥塊根共5份，采自石柱(重慶)和云南的野生金蕎麥塊根樣品共2份，總計13份樣品。

1.2 試驗儀器與耗材 LC-20A高效液相色譜儀(SIL-20A 自動進樣器，SPD-20A 檢測器，日本島津公司)；C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本GL Sciences公司)；電子天平(A-R1140，瑞士梅特勒-托利多上海有限公司公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1300，上海愛朗儀器有限公司)；恒溫數(shù)字顯示水浴鍋(HH-6，科密儀器儀表有限公司)；超聲波清洗機(JT-410HT，深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司)；0.45 μm微孔濾膜(島津(上海)實驗器材有限公司)；聚酰胺(30-60目，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 試驗試劑與藥品 無水乙醇(分析純，重慶川東化工(集團)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；磷酸(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；表兒茶素、原花青素B2和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(編號：C100865、C100664和C100001，貴州迪大科技有限公司)，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：ALT600928，天津阿爾塔科技有限公司)。

2 試驗方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱量原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，分別加適量色譜甲醇于10 mL的容量瓶中，超聲溶解后定容，得各標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液，備用。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥、粉碎后的藥材2.00 g于燒瓶中，加80%乙醇40 mL，浸泡過夜，加熱回流提取2 h，過濾后取全部濾液于水浴鍋上揮干，加色譜甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，定容，離心取上清液5 mL過聚酰胺柱，先用50 mL的蒸餾水洗脫，棄掉水洗液，再用150 mL的無水乙醇洗脫，濃縮醇洗液，溶解、轉(zhuǎn)移、定容至10 mL的容量瓶中，得供試品溶液，進樣前搖勻，并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，備用。

2.3 色譜條件 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)梯度洗脫，進樣量10 μL，檢測波長254 nm，溫度30 ℃。梯度洗脫見表1。

激勵是給學(xué)生最好的動力，老師在課堂教育時營造情境氛圍，用激勵的語言去指導(dǎo)學(xué)生，從而讓學(xué)生產(chǎn)生對體育學(xué)習(xí)的興趣。激勵教學(xué)就是要做到理性和感性相結(jié)合，學(xué)生在一種輕松的環(huán)境下學(xué)習(xí)，有嚴(yán)有松，既能鍛煉身體，又能培養(yǎng)自身的服從命令聽指揮的意識。在學(xué)生碰到一些狀況時，老師千萬不要用一些嘲笑不友好的態(tài)度對待學(xué)生，要曉之以理，動之以情，幫助學(xué)生解決狀況，尊重學(xué)生，讓學(xué)生在激勵的語言下取得更大的進步。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Procedore of gradient elution

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性關(guān)系考察 取適量原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液，分別配置成5、25、45、65、85 μg/mL的濃度梯度溶液， 5、10、20、40、80 μg/mL的濃度梯度溶液， 0.5、1、2、4、8 μg/mL的濃度梯度溶液， 0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL的濃度梯度溶液，按2.3項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 精密度考察 精密吸取含原花青素B2100 μg/mL、表兒茶素100 μg/mL、蘆丁100 μg/mL、槲皮素100 μg/mL的混合對照品溶液10 μL，按2.3項下色譜條件進樣測定，重復(fù)6次，記錄色譜圖，測定峰面積，計算其RSD值。

2.4.3 重復(fù)性考察 精密稱“黔中金蕎麥”(黔西)的干燥粉末6份，每份約2.00 g，按照2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，計算其RSD值。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 精密吸取“黔中金蕎麥”(黔西)制成的供試品溶液10 μL，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h按2.3項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，計算其RSD值。

2.4.5 回收率測試 采用加樣回收法，精密稱取6份已知含量的黔中金蕎麥(黔西產(chǎn))約1 g，分別精密加入混合對照品20 mL(用色譜甲醇配置成的含原花青素B234 μg/mL、表兒茶素18.75 μg/mL、蘆丁3.45 μg/mL、槲皮素0.85 μg/mL)，按2.2項方法提取制備供試品，按2.3項色譜條件測定，計算其峰面積。

2.4.6 樣品測試 取測試試驗藥材按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，根據(jù)各對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察 以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：原花青素B2：y=1922.3x-192.8(r2=0.9998)；表兒茶素：y=2190.3x-119(r2=0.9998)；蘆?。簓=22572x+652(r2=0.9996)；槲皮素：y=33687x-89.8(r2=0.9999)。

3.2 精密度考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.14%、0.10%、0.09%、0.07%(n=6)，表明所用儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.83%、1.09%、0.74%、1.50%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 穩(wěn)定性考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.88%、0.80%、1.62%、1.28%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 回收率試驗 加樣回收試驗結(jié)果顯示：原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的平均回收率分別為98.37%、98.68%、96.11%和97.56%，RSD分別為1.02%、1.00%、1.18%和1.01%。以上結(jié)果表明此方法檢測“黔中金蕎麥”中原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的含量可靠、穩(wěn)定。加樣回收率測試結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(n=6)Tab 2 Sample recovery test(n=6)

3.6 樣品測試 以2.3項下的色譜條件對混合標(biāo)準(zhǔn)品及各供試品進行色譜測定，色譜圖如圖1所示。

1-原花青素B2，2-表兒茶素，3-蘆丁，4-槲皮素

3.6.1 “黔中金蕎麥”與不同產(chǎn)地野生金蕎麥的成分含量 對采自貴州省內(nèi)不同產(chǎn)地及云南、重慶的野生金蕎麥與“黔中金蕎麥”1年生根莖供試品溶液按照2.3項下色譜條件進樣測定，檢測結(jié)果見表3。

從表3中可以看出：在此試驗方法下除關(guān)嶺和羅甸產(chǎn)的野生金蕎麥未檢測到槲皮素外，其余樣品均檢測出4種指標(biāo)成分?！扒薪鹗w麥”4種成分的總含量高于除丹寨外的其他野生金蕎麥，采自黔西的“黔中金蕎麥”總含量(1189.70 μg/g)優(yōu)于采自麥坪的“黔中金蕎麥”(1108.01 μg/g)。“黔中金蕎麥”和黔產(chǎn)的各地野生金蕎麥的含量各不相同，且具有一定差異。原花青素B2和蘆丁的含量“黔中金蕎麥”最高，采自黔西的分別為710.27、71.69 μg/g，采自麥坪的分別為798.79、65.47 μg/g，其中采自麥坪的原花青素B2含量最高(798.79 μg/g)，采自黔西的蘆丁含量和槲皮素含量最高(71.69、17.91 μg/g)；除龍里產(chǎn)的野生金蕎麥槲皮素含量(15.11 μg/g)高于采自麥坪的“黔中金蕎麥”(7.81 μg/g)，采自丹寨的野生金蕎麥表兒茶素含量高最高(588.00 μg/g)外，“黔中金蕎麥”的表兒茶素和槲皮素的含量均高于其他野生金蕎麥。

表3 “黔中金蕎麥”與不同產(chǎn)地野生金蕎麥中4種成分含量(n=2)Tab 3 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" and wild from different origins (n=2)

3.6.2 生長年限對“黔中金蕎麥”的化學(xué)成分含量的影響 對采自麥坪不同生長年限的“黔中金蕎麥”根莖供試品溶液按照2.3項下色譜條件進樣測定，檢測結(jié)果見表4。

表4 不同生長年限的“黔中金蕎麥”中4種成分含量(n=2)Tab 4 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" with different growth years (n=2)

表4的試驗結(jié)果顯示：在4種指標(biāo)成分含量上，前3種成分含量在第2年采收時含量達到最高，總含量也達最高，槲皮素含量無明顯規(guī)律性變化，第3年含量最高，有逐年累計的可能，或者是在生長過程中，蘆丁受影響發(fā)生水解產(chǎn)生槲皮素，造成槲皮素含量升高，但第3年時4種成分總含量急劇減少。為充分利用資源，且考慮其總體成分含量以及治療作用，故適宜在“黔中金蕎麥”生長第2年時采收。

3.6.3 采收時間對“黔中金蕎麥”化學(xué)成分含量的影響 對不同時間采收的“黔中金蕎麥”根莖供試品溶液按照2.3項下色譜條件進樣測定，檢測結(jié)果見表5。

表5 不同采收時間的“黔中金蕎麥”中4種成分含量(n=2)Tab 5 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" at different harvest times (n=2)

表5結(jié)果顯示：不同采收時間對4種指標(biāo)成分含量的影響未呈現(xiàn)出一定的趨勢，6月份與12月份采收在總含量上差異不明顯，總體綜合來看12月采收較好，不僅成分含量高，且金蕎麥地上部分也具有一定的經(jīng)濟利用價值，能在冬季枯死之前地上部分作為青綠飼料加以利用，降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟效益。

綜合評價，在此試驗方法下，“黔中金蕎麥”的物質(zhì)含量豐富，品質(zhì)佳，其中以來自黔西的“黔中金蕎麥”在此4種指標(biāo)成分評價下，品質(zhì)最佳。以12月份、2年生的“黔中金蕎麥”采收最適宜，活性物質(zhì)成分含量高。

4 討論與結(jié)論

金蕎麥中物質(zhì)成分豐富、復(fù)雜，含有各類化學(xué)成分，主要是多酚類、黃酮類、甾體類和萜類等化學(xué)成分，以較大極性類物質(zhì)居多，具有治療糖尿病、抗癌、抗氧化、抗菌以及增強免疫等多種藥理作用，是一種具有良好開發(fā)前景的中藥。金蕎麥中含有大量黃酮類物質(zhì)，如表兒茶素、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、兒茶素和原花青素B2等黃酮單聚體和一些二聚體等物質(zhì)[9]，黃仁術(shù)等[10]研究發(fā)現(xiàn)其中表兒茶素具有明顯抗菌消炎作用，黔中金蕎麥中表兒茶素含量較高，達到中國藥典含量測定要求，而丹寨產(chǎn)的野生金蕎麥中表兒茶素含量近乎是藥典標(biāo)準(zhǔn)的兩倍。馮黎莎、王立波等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)金蕎麥的根莖和莖葉都具有一定的抑制細(xì)菌和真菌的作用，且金蕎麥中的黃酮以及多酚類化合物對乙型溶血性鏈球菌和肺炎球菌具有抑制作用。還可以保護由肺炎球菌菌株所致的小鼠感染，可能與其中的原花青素B2對細(xì)胞的保護作用有關(guān)[13]；同時，金蕎麥中的多酚類和黃酮類物質(zhì)還具有較強的總抗氧化能力和抗脂質(zhì)過氧化作用[14-15]。程友斌等[16]對金蕎麥不同提取部位進行抗炎測試研究，發(fā)現(xiàn)氯仿和水液為抗炎活性部位，具有顯著的抗炎作用，推測其活性物質(zhì)可能是中等極性和較大極性類型的物質(zhì)成分，如黃酮類、多酚類以及萜類等類型的物質(zhì)，具體的活性物質(zhì)類型還需進一步研究。金蕎麥具有很好的、廣泛的藥理作用，體現(xiàn)出其巨大的藥用價值，從各研究中可以看出，其藥理作用與其植物體內(nèi)的黃酮類、酚酸類、萜類等物質(zhì)有極大關(guān)系。在此試驗中可以看出，“黔中金蕎麥”黃酮類物質(zhì)總含量高于野生金蕎麥，尤其是槲皮素含量較高，可能在藥理作用和療效方面也存在一定的優(yōu)勢，具有良好的藥用價值，為其作為藥用資源開發(fā)利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

黔產(chǎn)的野生金蕎麥含量各不相同，差異較大，質(zhì)量不穩(wěn)定，成分總含量低，但丹寨野生金蕎麥總含量顯著高于其他野生金蕎麥，可能和貴州各地區(qū)海拔梯度有關(guān)，進而影響陽光、水分等吸收，以及土壤、環(huán)境等差異，導(dǎo)致植物物質(zhì)成分的差異，體現(xiàn)出貴州地勢地理環(huán)境的多樣性，從而導(dǎo)致植物物質(zhì)成分的多樣性。而采自黔西和麥坪兩地的“黔中金蕎麥”在此試驗條件下顯示，在總含量上差異不明顯，各成分含量均較高，優(yōu)于黔產(chǎn)野生金蕎麥，也優(yōu)于云南與重慶產(chǎn)的野生金蕎麥，且質(zhì)量穩(wěn)定，體現(xiàn)出自主選育的“黔中金蕎麥”的優(yōu)勢、價值和意義。

本試驗建立了以HPLC同時測定“黔中金蕎麥”中原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素4種成分含量的方法，適用于 “黔中金蕎麥”的含量測定，也可用于“黔中金蕎麥”的質(zhì)量控制?！扒薪鹗w麥”活性物質(zhì)豐富、總黃酮含量高，質(zhì)量穩(wěn)定，符合中國藥典和中國獸藥典對金蕎麥的含量測定標(biāo)準(zhǔn)，即表兒茶素含量(C15H14O6)≥0.03%(按干燥品計算)，可為該藥材在臨床的應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)?！扒薪鹗w麥”作為一種高蛋白低纖維、營養(yǎng)豐富的牧草資源，采用本試驗建立的檢測方法明確其內(nèi)控質(zhì)量，可大面積示范推廣種植，運用于畜禽養(yǎng)殖具有一定的經(jīng)濟效益和社會效益。