長莖葡萄蕨藻對溫度脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制

李恬靜薇，馬彬，鄒瀟瀟，朱軍，鮑時翔

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，海南 海口 571101）

長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）隸屬綠藻門（Chlorophyta）、羽藻綱（Bryopsodophyceae）、蕨藻屬（Caulerpa），俗稱“海葡萄”，是一種在熱帶地區(qū)廣泛分布的大型經(jīng)濟(jì)綠藻，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值[1]。長莖葡萄蕨藻營養(yǎng)豐富，含有多種人體必需的氨基酸、維生素[2]、礦質(zhì)元素和不飽和脂肪酸，且脂肪含量低，是潛在的高營養(yǎng)價值保健食品，在日本和東南亞都被視為高級食材。長莖葡萄蕨藻還可為海洋動物提供餌料以及良好的棲息環(huán)境，對改善海洋環(huán)境，提高生物多樣性和維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重大意義[3]。長莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖業(yè)興起于日本，而后傳到菲律賓、馬來西亞、越南、韓國和中國臺灣等地，目前在中國的東南沿海城市已經(jīng)開始了大規(guī)模的養(yǎng)殖，逐漸形成一條新興大型海藻產(chǎn)業(yè)鏈，豐富了我國傳統(tǒng)大型海藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[4]。

鹽度、溫度、光照和水流等生態(tài)因子都影響長莖葡萄蕨藻的養(yǎng)殖效果，其中溫度的影響最大，是莖葡萄蕨藻生長發(fā)育的限制因素[5]。長莖葡萄蕨藻最適生長溫度在25℃～30℃之間，27℃時生長速率最快[6]。當(dāng)溫度低于18℃或高于30℃時均會出現(xiàn)藻體白化現(xiàn)象[7]。目前長莖葡萄蕨藻主要在海南省沿海一帶在室外池塘養(yǎng)殖，水位較淺，養(yǎng)殖池內(nèi)水溫受外界溫度影響較大。冬季水溫最低可達(dá)15℃，夏季持續(xù)的高溫和陽光照射，部分養(yǎng)殖池內(nèi)水溫最高達(dá)37℃（海南省昌江養(yǎng)殖基地測量）。溫度脅迫影響藻類的各種生理生化過程，如高溫脅迫可抑制光合作用，破壞活性氧代謝平衡，給機(jī)體造成不可逆的損傷等，嚴(yán)重時甚至死亡[8]；低溫脅迫主要損傷藻類的細(xì)胞膜系統(tǒng)，破壞膜的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性，還可以導(dǎo)致脂膜過氧化，破壞細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡等[9]。為抵抗溫度脅迫，藻類通常在短時間內(nèi)就可以迅速做出響應(yīng)。目前，有關(guān)長莖葡萄蕨藻的研究大多是溫度對其生長的影響，對溫度脅迫的響應(yīng)機(jī)制還不太明確。為了解長莖葡萄蕨藻抵抗溫度脅迫的遺傳機(jī)理，挖掘抵抗溫度脅迫的關(guān)鍵基因和代謝通路，培育抗逆優(yōu)良品系，研究溫度脅迫對長莖葡萄蕨藻的響應(yīng)機(jī)制至關(guān)重要。

本文通過研究長莖葡萄蕨藻光合系統(tǒng)、氧化和抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對低溫（15℃）和高溫脅迫（37℃）的短期應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制，可為系統(tǒng)研究長莖葡萄蕨藻在溫度脅迫下的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用的長莖葡萄蕨藻樣品來自本實驗室在海南省昌江長莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖基地。挑選健壯、生長狀態(tài)良好的藻體樣品，用無菌海水清洗3 次后，在光照培養(yǎng)箱（PGX-450D，寧波賽福）中暫養(yǎng)一周后進(jìn)行處理。培養(yǎng)期間，溫度（27±1）℃，光強(qiáng)40 μmol·m-2·s-1，鹽度30，光暗周期為12h∶12h。光照強(qiáng)度由光量子測定儀（MQ-200,Apogee Instruments,USA）測定。本研究所用試劑盒來自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

在潔凈的1 L 燒杯中分別加入800 mL 無菌海水和適量潔凈藻體，分別置于27℃（對照）、15℃（低溫）和37℃（高溫）光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組3 個重復(fù)。預(yù)實驗中，溫度脅迫24 h 可顯著影響長莖葡萄蕨藻，24～48 h 之間藻體開始陸續(xù)死亡，因此，確定處理時間為24 h，于1 h、2 h、4 h、8 h、12 h 和24 h時，測量葉綠素?zé)晒鈪?shù)（最大光量子產(chǎn)量），并取樣，用紙擦干藻表面水分，迅速放于液氮中速凍，然后置于-80℃冰箱中儲存。單獨取3 株樣品迅速置于顯微鏡下觀察和拍照。

1.3 生理指標(biāo)的測定

用MINI-PAM（Walz,Effeltrich,Germany）測定最大光量子產(chǎn)量，樣品暗處理適應(yīng)20 min 后，首先提供0.3 μmol·m-2·s-1的測量光，測得最小熒光值（F0），然后提供0.8 s 約4 000 μmol·m-2·s-1的飽和脈沖，測得最大熒光值（Fm）。最大光量子產(chǎn)量（Fv/Fm）由以下方程計算求得：Fv/Fm=（Fm-F0）/Fm[10]。其他生理指標(biāo)的測定均采用分光光度法。葉綠素含量采用無水乙醇和丙酮1∶2（v∶v）充分混合配制成的提取液提取后測定；丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[10]；超氧化物歧化酶活力的測定采用羥胺法[11]；脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定；可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[10]。以上實驗步驟參考南京建成試劑盒說明書操作，使用紫外可見光分光光度計（756PC，上海光譜）進(jìn)行測量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實驗采用Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，用IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，包括單因素方差分析、多重比較及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度脅迫對長莖葡萄蕨藻外觀形態(tài)的影響

高、低溫脅迫顯著影響長莖葡萄蕨藻的外觀形態(tài)。正常條件下，長莖葡萄蕨藻顏色均勻，藻體飽滿，處理1 h 時出現(xiàn)色素聚集，隨脅迫時間的延長聚集區(qū)域逐漸增加，球狀小枝顏色變淺，12 h 時開始出現(xiàn)脫水現(xiàn)象，24 h 時脫水現(xiàn)象明顯，表皮褶皺，藻體變軟（圖1）。

2.2 溫度脅迫對長莖葡萄蕨藻光合作用的影響

正常條件下長莖葡萄蕨藻最大光量子產(chǎn)量（Fv/Fm）在0.75～0.80 之間（圖2）。在27℃下長莖葡萄蕨藻最大光量子產(chǎn)量無明顯變化，在高溫和低溫脅迫下Fv/Fm隨處理時間的延長逐漸降低，處理24 h 后分別比初始值下降了62.6%和68.7%。在低溫脅迫下，長莖葡萄蕨藻的Fv/Fm下降趨勢比高溫脅迫顯著。方差分析表明，低溫脅迫下1 h 時就出現(xiàn)了極顯著差異（P<0.01），高溫脅迫下1 h 出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），2 h 時出現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）（圖2）。

不同溫度脅迫下，長莖葡萄蕨藻葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量分別在0.046～0.070 mg·g-1、0.040～0.057 mg·g-1和0.089～0.128 mg·g-1之間波動。各處理組間沒有隨脅迫時間的延長而表現(xiàn)出顯著性差異，說明24 h 以內(nèi)的溫度脅迫并未顯著影響長莖葡萄蕨藻的葉綠素含量（圖3）。

2.3 溫度脅迫對長莖葡萄蕨藻氧化抗氧化系統(tǒng)的影響

低溫脅迫下，長莖葡萄蕨藻體內(nèi)丙二醛含量隨處理時間的延長先上升后下降，但并未達(dá)到顯著水平，8 h 后達(dá)到最高值。高溫脅迫前期，長莖葡萄蕨藻體內(nèi)丙二醛含量并未出現(xiàn)明顯變化，24 h 后顯著降低（圖4）。長莖葡萄蕨藻體內(nèi)超氧化物歧化酶活力隨低、高溫脅迫時間的延長而升高，24 h 后比對照組分別上升了33.4%和46.2%，高溫脅迫的上升趨勢較為顯著。高溫脅迫2 h 與對照組差異顯著（P<0.05），低溫脅迫4 h 差異顯著（P<0.05）（圖5）。

2.4 溫度脅迫對長莖葡萄蕨藻兩種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

溫度脅迫使長莖葡萄蕨藻體內(nèi)脯氨酸含量升高。在正常溫度（27℃）下，長莖葡萄蕨藻體內(nèi)脯氨酸含量較為穩(wěn)定，在15℃和37℃下，脯氨酸含量隨處理時間的延長而上升，24 h 后分別比初始值升高了20.7%和142.3%，高溫脅迫下脯氨酸含量的升高幅度明顯高于低溫脅迫。與對照組相比，低溫脅迫8 h 時差異顯著（P<0.05），12 h 時差異極顯著（P<0.01）；高溫脅迫2 h 時差異顯著，低溫脅迫4 h時差異極顯著（P<0.01）（圖6）。低溫和高溫脅迫同樣會導(dǎo)致長莖葡萄蕨藻體內(nèi)可溶性糖含量升高，24 h 后分別比初始值上升了61.1%和73.8%。方差分析表明，與對照組相比，低溫脅迫4 h 后差異顯著（P<0.05），高溫脅迫2 h 后差異顯著（P<0.05）（圖7）。

3 討論

3.1 長莖葡萄蕨藻光合系統(tǒng)對溫度脅迫的響應(yīng)

光合作用是植物最重要的生長反應(yīng)之一，光合速率直接決定著植物的生長力。溫度脅迫對長莖葡萄蕨藻光合系統(tǒng)的影響可以通過最大光合速率和葉綠素含量的變化來反映。光系統(tǒng)Ⅱ最大光量子產(chǎn)量（最大光合效率）Fv/Fm可以反映植物的潛在最大光能轉(zhuǎn)換效率。在健康生理狀態(tài)下，綠藻的最大Fv/Fm一般在0.7～0.8 之間。Fv/Fm下降代表機(jī)體受到脅迫，光合作用被抑制[12]。Guo 等[13]研究發(fā)現(xiàn)：溫度和光照脅迫使長莖葡萄蕨藻Fv/Fm下降。本研究中，長莖葡萄蕨藻Fv/Fm在溫度脅迫1 h 時就顯著下調(diào)，是最先表現(xiàn)出顯著差異的生理指標(biāo)，說明長莖葡萄蕨藻光合系統(tǒng)對溫度脅迫十分敏感，當(dāng)處于不適宜的溫度條件下時，光合作用最先受到抑制。這種現(xiàn)象在其他藻類中也曾被證實[14]。在低溫脅迫下長莖葡萄蕨藻Fv/Fm的下降速率明顯高于高溫處理組，說明低溫脅迫對長莖葡萄蕨藻光合作用的抑制作用更為顯著。而溫度脅迫下長莖葡萄蕨藻葉綠素含量未發(fā)生顯著性變化，說明24 h 溫度脅迫并不影響葉綠素含量，葉綠素合成酶的活性沒有受到明顯抑制，光合速率的下調(diào)則可能是光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（如PSII的放氧復(fù)合體、光吸收天線、反應(yīng)中心、電子受體側(cè)和電子供給側(cè)）受損，抑制了光合作用。溫度脅迫時發(fā)現(xiàn)，長莖葡萄蕨藻顏色變淺，可能是長莖葡萄蕨藻葉綠體在細(xì)胞內(nèi)自由移動形成的色素聚集所致。推測這種色素聚集現(xiàn)象可能是長莖葡萄蕨藻主動抵抗溫度脅迫而產(chǎn)生的一種防御機(jī)制。

3.2 長莖葡萄蕨藻抗氧化系統(tǒng)對溫度脅迫的響應(yīng)

在溫度脅迫下，細(xì)胞中的許多代謝通路會受到抑制并產(chǎn)生大量的活性氧。過量活性氧和自由基的累積會損傷蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)，氧化影響其正常的生理功能。丙二醛（MDA）為膜脂過氧化產(chǎn)物，可與膜結(jié)構(gòu)上的酶和蛋白質(zhì)結(jié)合而使其失去活性，破壞膜結(jié)構(gòu)，因此，可以根據(jù)植物細(xì)胞內(nèi)MDA 的含量來判斷細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度[15]。低溫脅迫下長莖葡萄蕨藻體內(nèi)丙二醛含量先升高后降低，但差異并不顯著；高溫脅迫下長莖葡萄蕨藻體內(nèi)丙二醛含量前期無顯著差異，24 h 后有一定程度的降低，說明溫度脅迫24 h 產(chǎn)生的活性氧并未顯著影響長莖葡萄蕨藻膜系統(tǒng)，這可能是長莖葡萄蕨藻具有有效的活性氧清除能力，也可能是長莖葡萄蕨藻體內(nèi)含有大量的膠質(zhì)和多糖保護(hù)了細(xì)胞膜系統(tǒng)。脅迫產(chǎn)生的活性氧可以激活藻類的抗氧化系統(tǒng)，使其有效的清除活性氧來抵抗溫度變化的脅迫[16,17]，但當(dāng)脅迫超過一定范圍時，會直接損傷細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使酶失去活性[18]。超氧化物歧化酶可將超氧自由基轉(zhuǎn)變成H2O2，以此來消除活性氧對機(jī)體的損傷。李虎等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理（20℃、17℃、14℃）2 h 后，長心卡帕藻（Kappaphycus alvarezii）體內(nèi)SOD 活力顯著上升。本實驗中，低溫和高溫脅迫下長莖葡萄蕨藻體內(nèi)SOD 活力都有顯著上調(diào)趨勢，高溫脅迫下SOD 活力變化較為迅速，表明低溫和高溫脅迫下長莖葡萄蕨藻體內(nèi)超氧自由基含量增多，藻體處于脅迫狀態(tài)，但在脅迫24 h內(nèi)并未損傷抗氧化系統(tǒng)，依然可以通過提高SOD 的活力來清除溫度脅迫產(chǎn)生的過量活性氧，高溫脅迫下SOD 活性氧清除能力更強(qiáng)。

3.3 長莖葡萄蕨藻滲透性調(diào)節(jié)系統(tǒng)對溫度脅迫的響應(yīng)

溫度脅迫12 h，長莖葡萄蕨藻脫水，細(xì)胞質(zhì)收縮，表皮出現(xiàn)褶皺。Ko 等[20]在高溫處理的單細(xì)胞藻中也發(fā)現(xiàn)了這種細(xì)胞質(zhì)收縮現(xiàn)象，說明溫度脅迫通常也會導(dǎo)致滲透壓脅迫。藻類為保持細(xì)胞的完整，可通過改變滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來抵抗脅迫。脯氨酸為最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，具有清除自由基的功能[21]。在低溫和高溫脅迫72 h 后，龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）中脯氨酸含量分別增加了44.9%和69.8%[22]。正常條件下，長莖葡萄蕨藻脯氨酸含量較低，溫度脅迫后，脯氨酸含量迅速升高，尤其是高溫脅迫下，24 h 后上升量高達(dá)140%。說明脯氨酸在長莖葡萄蕨藻抵抗溫度脅迫，尤其是高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。植物細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖不僅可以避免溫度脅迫所引起的蛋白質(zhì)變性，保護(hù)蛋白質(zhì)，還可以維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，通過自身含量的變化減少水分流失，使細(xì)胞滲透勢保持平衡，以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的[23,24]。長莖葡萄蕨藻可溶性糖含量較高，除具有生物組織常見的幾種可溶性糖外，還含有海藻糖等物質(zhì)[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫處理下的兩種南極冰藻（衣藻Chlamydomonas sp.L-4和塔胞藻Pyramidomonas sp.L-1）和鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）可溶性糖含量都有明顯增加[26,27]。本研究中，在低溫和高溫脅迫下，長莖葡萄蕨藻體內(nèi)可溶性糖含量都有一定程度的升高，但上升幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于脯氨酸上升幅度。溫度脅迫長莖葡萄蕨藻可以通過增加脯氨酸和可溶性糖來抵抗脅迫，其中脯氨酸發(fā)揮作用較大。實驗觀察和對實驗結(jié)果的綜合分析表明，溫度脅迫下長莖葡萄蕨藻生長狀態(tài)與滲透壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)關(guān)系密切，推測溫度脅迫導(dǎo)致的滲透壓脅迫可能是長莖葡萄蕨藻生理機(jī)能受損的主要原因。

3.4 結(jié)論

長莖葡萄蕨藻對溫度變化十分敏感，短時間的溫度脅迫能抑制其光合速率；長莖葡萄蕨藻可通過激活抗氧化系統(tǒng)，提高超氧化物歧化酶SOD 的活性來抵抗溫度脅迫帶來的過氧化損傷；通過在體內(nèi)積累脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來保護(hù)細(xì)胞的完整，維持正常的生理功能；低溫脅迫對長莖葡萄蕨藻光合系統(tǒng)的影響更大，而高溫脅迫對抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)影響較大。本研究為系統(tǒng)研究長莖葡萄蕨藻在溫度脅迫下的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。