Na+、K+、Ca2+、Mg2+、葡萄糖和甘油濃度對(duì)擬赤梢魚(yú)精子活力的影響

王雨，楊建，耿龍武，張宇婷，徐偉，叢艷鋒，杜汝君

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.黑龍江省冷水性魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；4.杜爾伯特蒙古族自治縣水產(chǎn)總站，黑龍江 大慶 166200）

擬赤梢魚(yú)（Pseudaspius leptocephalus）隸屬鯉科（Cyprinidae）、雅羅魚(yú)亞科（Leuciscinae）、擬赤梢魚(yú)屬（Pseudapius）的唯一種[1]，在我國(guó)僅分布于黑龍江流域，是肉質(zhì)細(xì)膩、味道鮮美的黑龍江流域名貴淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[2]。近年來(lái)，環(huán)境污染、產(chǎn)卵場(chǎng)破環(huán)、過(guò)渡捕撈等導(dǎo)致擬赤梢魚(yú)資源明顯衰退，亟需保護(hù)。目前，關(guān)于擬赤梢魚(yú)的研究?jī)H見(jiàn)核型分析[3]、肌肉營(yíng)養(yǎng)成分[4]和人工繁育[5]等。

魚(yú)類(lèi)精子活力與其受精能力密切相關(guān)，提高精子活力有利于提高人工繁殖的受精率[6]。精子活力主要通過(guò)精子激活率、精子運(yùn)動(dòng)激烈程度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間等指標(biāo)來(lái)反映，是檢測(cè)精子質(zhì)量的重要指標(biāo)[7]。研究表明，滲透壓、pH、溫度、離子等環(huán)境因子對(duì)魚(yú)類(lèi)精子活力的影響顯著[8]，其中，滲透壓是影響大多數(shù)魚(yú)類(lèi)精子運(yùn)動(dòng)能力的主要因素。Na+、K+、Ca2+、Mg2+是維持魚(yú)類(lèi)精漿滲透壓的主要離子，不同種離子對(duì)同種魚(yú)類(lèi)精子活力的影響及同種離子對(duì)不同種魚(yú)類(lèi)精子活力的影響均存在差異[9]。如K+能抑制鮭鱒魚(yú)類(lèi)精子的活動(dòng)，而在鯉科魚(yú)類(lèi)中能夠提高精子運(yùn)動(dòng)速度[10-12]。近年來(lái)，隨著魚(yú)類(lèi)配子和胚胎冷凍保存研究的進(jìn)一步深入，糖類(lèi)物質(zhì)、磷脂作為冷凍稀釋液中基礎(chǔ)溶液的重要組分，在形成滲透壓、提供外源營(yíng)養(yǎng)中起著不可替代的作用[13]。葡萄糖可顯著延長(zhǎng)凹目白鮭（Coregonus autumnalis）精子壽命[14]。本研究通過(guò)分析對(duì)比不同濃度無(wú)機(jī)離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+和葡萄糖、甘油有機(jī)溶劑中擬赤梢魚(yú)精子活力變化規(guī)律，旨在闡明不同環(huán)境因子對(duì)擬赤梢魚(yú)精子活力的影響，并為擬赤梢魚(yú)精子生理學(xué)研究和人工繁殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)魚(yú)為隨機(jī)采取的6 尾5 齡成熟度好、健康無(wú)傷的擬赤梢雄魚(yú)，平均體長(zhǎng)為（26.86±0.85）cm，體質(zhì)量為（194.03±18.27）g，取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站。用促黃體生成激素釋放激素類(lèi)似物（LRH-A2）2.0 μg·kg-1和馬來(lái)酸地歐酮（DOM）0.5 mg·kg-1對(duì)雄魚(yú)樣本進(jìn)行人工催產(chǎn)，胸腔注射1 次，28 h 后，用干燥潔凈的毛巾擦去魚(yú)體表面及生殖孔附近的水分，輕壓魚(yú)腹部流出精液，滴入干燥潔凈的2 mL 離心管中，立即置于4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩＞翰杉^(guò)程中應(yīng)避免尿液、血液和糞便污染精液。

用去離子水和分析純氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、葡萄糖和甘油分別配制不同濃度梯度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、葡萄糖及甘油激活液，不同激活液濃度設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，以去離子水作為對(duì)照組。

表1 不同梯度激活溶液設(shè)計(jì)Tab.1 The design of different gradient activation solutions

1.2 精子活力觀察與測(cè)定

移液槍吸取2 μL 新鮮精液于載玻片上，再吸取精子激活液20 μL 加至精液中，迅速用槍頭將其攪勻，無(wú)需加蓋蓋玻片，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，于10×10倍顯微鏡（BX1 OlyMpus Microscope）下觀察。觀察過(guò)程以一個(gè)視野為準(zhǔn)。精子活力觀察標(biāo)準(zhǔn)參照喬志剛等[15]、蘇德學(xué)等[16]劃分的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：精子激活率（Activation rate）以激活起始時(shí)給定視野內(nèi)被激活精子數(shù)量占全部精子數(shù)量的百分?jǐn)?shù)計(jì)算；精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（Fast Movement period，F(xiàn)MP）以精子激活開(kāi)始至70%的精子能看清運(yùn)動(dòng)軌跡的時(shí)間計(jì)算；精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間（Moving duration，MD）以精子激活開(kāi)始至90%的精子原地顫動(dòng)為止的時(shí)間計(jì)算；精子壽命（Life span，LS）以精子激活開(kāi)始至90%的精子停止運(yùn)動(dòng)為止的時(shí)間計(jì)算。精子活力觀察與測(cè)定由同一人用相同方法完成，不同實(shí)驗(yàn)處理組各樣品測(cè)定3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan 法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na+對(duì)精子活力的影響

在0.02～0.14 mol·L-1的Na+激活液中，擬赤梢魚(yú)精子激活率在0.02～0.06 mol·L-1時(shí)差異不顯著（P>0.05），在0.08 mol·L-1時(shí)雖顯著降低，但仍維持在80%以上。隨著Na+濃度的升高，擬赤梢魚(yú)精子的FMP、MD 和LS 均先增加后減少，其中0.14 mol·L-1濃度組擬赤梢魚(yú)精子的FMP、MD 和LS 小于對(duì)照組。而在0.08 mol·L-1濃度組激活液中，擬赤梢魚(yú)精子的FMP、MD 和LS 均大于其他組，F(xiàn)MP、MD 和LS分別為（26.87±0.69）s、（74.49±7.19）s 和（446.48±21.96）s（表2）。

表2 擬赤梢魚(yú)精子在不同濃度NaCl 溶液中的活力Tab.2 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of NaCl solution

2.2 K+對(duì)精子活力的影響

在K+濃度為0.02～0.14 mol·L-1范圍內(nèi)，隨K+濃度的升高擬赤梢魚(yú)精子的激活率降低，濃度為0.08 mol·L-1時(shí)，擬赤梢魚(yú)精子的激活率顯著降低（P<0.05）。在K+濃度為0.02～0.14 mol·L-1范圍內(nèi)，精子FMP、MD 和LS 隨K+濃度的升高先增加后降低，濃度為0.10 mol·L-1組時(shí)，精子FMP、MD 和LS達(dá)到峰值，分別為（25.73±0.44）s、（55.53±4.38）s和（183.19±11.80）s。在K+為0.14 mol·L-1組中，擬赤梢魚(yú)精子的FMP、MD 和LS 顯著小于對(duì)照組（P<0.05）（表3）。

表3 不同濃度KCl 溶液中擬赤梢魚(yú)的精子活力Tab.3 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of KCl solution

2.3 Ca2+對(duì)精子活力的影響

在Ca2+濃度為0.003～0.021 mol·L-1的范圍內(nèi)，擬赤梢魚(yú)精子激活率、FMP、MD 和LS 均隨Ca2+濃度的增加而減少，精子聚集程度也不斷增加。實(shí)驗(yàn)組精子激活率均顯著小于對(duì)照組（P<0.05），0.003 mol·L-1時(shí)精子激活率已降至（56.68±5.77）%；而精子的FMP、MD 和LS 僅在Ca2+為0.003 mol·L-1組的激活液中與對(duì)照組水平無(wú)顯著差異（P>0.05），分別為（15.97±0.56）s、（31.63±1.93）s、（48.12±1.74）s（表4）。

表4 不同濃度CaCl2 溶液中擬赤梢魚(yú)的精子活力Tab.4 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of CaCl2 solution

2.4 Mg2+對(duì)精子活力的影響

隨著溶液中Mg2+濃度的升高，擬赤梢魚(yú)精子的激活率、FMP、MD 和LS 均隨著Mg2+濃度的升高而逐漸降低。其實(shí)驗(yàn)組的精子激活率均顯著小于對(duì)照組（P<0.05），且在Mg2+為0.021 mol·L-1組激活率為0%，而精子的FMP、MD 和LS 在0.003～0.009 mol·L-1濃度范圍內(nèi)均高于對(duì)照組。在0.002 mol·L-1組的激活液中，精子的激活率、FMP、MD 和LS 分別為（57.21±2.72）%、（17.65±0.68）s、（35.74±1.61）s和（66.31±5.19）s（表5）。

表5 不同濃度MgCl2 溶液中擬赤梢魚(yú)的精子活力Tab.5 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of MgCl2 solution

2.5 葡萄糖對(duì)精子活力的影響

在葡萄糖濃度為0.22 mol·L-1組中，擬赤梢魚(yú)精子的激活率為（83.33±2.78）%，小于對(duì)照組擬赤梢魚(yú)精子的激活率；而葡萄糖濃度為0.30 mol·L-1組的激活液中，精子的激活率降為0%。在葡萄糖濃度為0.06～0.22 mol·L-1的范圍內(nèi)，擬赤梢魚(yú)精子的FMP、MD 和LS 隨著葡萄糖濃度的升高而增加，在濃度為0.22 mol·L-1組中達(dá)最大值，分別為（25.51±1.84）s、（52.14±3.93）s、（76.74±4.05）s（表6）。

表6 不同濃度葡萄糖溶液中擬赤梢魚(yú)的精子活力Tab.6 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of Glu solution

2.6 甘油對(duì)精子活力的影響

在不同濃度甘油激活液中，精子的激活率顯著小于對(duì)照組（P<0.05），在甘油濃度為0.30 mol·L-1組中，精子的激活率為0%。在甘油濃度為0.06～0.22 mol·L-1范圍內(nèi)，擬赤梢魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)能力同在葡萄糖激活液中變化一致，均隨濃度的升高而增加，精子的FMP、MD 和LS 均在濃度為0.22 mol·L-1的激活液中達(dá)最大值，分別為（27.01±1.34）s、（48.16±7.41）s 和（90.54±2.75）s（表7）。

表7 不同濃度甘油溶液中擬赤梢魚(yú)的精子活力Tab.7 Sperm motility of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of Gly solution

3 討論

3.1 無(wú)機(jī)離子對(duì)精子活力的影響

魚(yú)類(lèi)精子釋放到外界環(huán)境時(shí)，其所處的環(huán)境滲透壓發(fā)生變化，立即被激活[17]。激活后的精子大部分能量用于滲透壓調(diào)節(jié)[18]。當(dāng)精細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差逐漸減小時(shí)，用于自身滲透壓的能量消耗隨之減少，能量多用于維持精子的運(yùn)動(dòng)[6]。

Na+、K+是維持精漿滲透壓的主要離子，在影響精子活力方面發(fā)揮重要作用。Na+可以通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞膜去極化產(chǎn)生動(dòng)作電位，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，間接激活精子運(yùn)動(dòng)，也使運(yùn)動(dòng)強(qiáng)烈程度增大[19]。本研究中，在Na+、K+濃度為0.02～0.12 mol·L-1的范圍內(nèi)擬赤梢魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)均不同程度提高，而在0.14 mol·L-1時(shí)受到抑制，這說(shuō)明一定濃度的Na+、K+對(duì)擬赤梢魚(yú)精子活力具有促進(jìn)作用，當(dāng)超過(guò)某一限制濃度時(shí)就會(huì)出現(xiàn)抑制。這一結(jié)果與對(duì)馬口魚(yú)（Opsariicjthys bidens）[20]、高白鮭（Coregouns peled）[21]和四川裂腹魚(yú)（Schizothorax kozlovi）[22]等魚(yú)類(lèi)精子活力的研究結(jié)果一致。

本研究中，Na+、K+激活液濃度為0.02～0.12 mol·L-1時(shí)，其均對(duì)擬赤梢魚(yú)的精子活力具有促進(jìn)作用，其中最適Na+濃度為0.08 mol·L-1。在該濃度下擬赤梢魚(yú)精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)最佳，尤其是精子壽命顯著延長(zhǎng)。研究證實(shí)，大鱗鲃（Barbus capito）、稀有鯽（Gobiocypris rarus）等魚(yú)類(lèi)的精子激活劑中Na+的最適濃度與本研究中擬赤梢魚(yú)的最適Na+濃度較為接近，分別為0.085 mol·L-1和0.09 mol·L-1[23,24]，而高體雅羅魚(yú)（Leuciscus idus）精子最適Na+濃度則為0.135 mol·L-1[25]，這表明不同種魚(yú)類(lèi)精子激活液中Na+濃度不同。擬赤梢魚(yú)精子活力的三個(gè)運(yùn)動(dòng)指標(biāo)均在濃度為0.10 mol·L-1的K+激活液中為最高，但此時(shí)其精子的激活率低于80%，不利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。本研究中，擬赤梢魚(yú)精子最適K+濃度為0.08 mol·L-1，低于同屬鯉科魚(yú)類(lèi)大鱗鲃精子的最適K+濃度0.13 mol·L-1[23]，而中華鱘（Acipenser sinensis Gray）精子的最適K+濃度僅為0.005‰[26]?？梢?jiàn)，不同種魚(yú)類(lèi)精子的最適K+濃度差異較大。

本研究中，精液激活劑中Ca2+、Mg2+對(duì)擬赤梢魚(yú)精子活力的作用方式與Na+、K+不同。其中，高Ca2+、Mg2+濃度的激活液顯著抑制精子的激活率，而精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命也隨著Ca2+、Mg2+濃度的升高逐漸降低。翹嘴鲌（Erythroculter ilishaeformis）精子在Ca2+、Mg2+濃度為0.001～0.003 mol·L-1范圍內(nèi)，其激活率高于對(duì)照組[27]，是否在更低濃度范圍內(nèi)同樣存在擬赤梢魚(yú)精子最適濃度，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。與白斑狗魚(yú)（Esox lucius）[28]、薩羅羅非魚(yú)（Sarotherodon melanotheron Rüppell）[29]等研究結(jié)果一樣，本研究中Ca2+、Mg2+也可引起擬赤梢魚(yú)精子的聚集。蘇德學(xué)等[28]認(rèn)為，精子聚集不是由于滲透壓作用，而是Ca2+本身影響精子的生理生化過(guò)程。羅明坤等[29]還推測(cè)Ca2+能損傷精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，引起精子聚集，導(dǎo)致活力下降。本研究顯示，Mg2+對(duì)擬赤梢魚(yú)精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的抑制作用不及Ca2+，龔進(jìn)玲等[30]的研究同樣報(bào)道了達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus Dumeril）精子對(duì)Ca2+、Mg2+敏感性不一。

3.2 葡萄糖、甘油對(duì)精子活力的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖與甘油對(duì)擬赤梢魚(yú)精子活力的影響作用相似，在一定濃度范圍內(nèi)，均可顯著延長(zhǎng)精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命。目前關(guān)于葡萄糖、甘油顯著延長(zhǎng)魚(yú)類(lèi)精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命的調(diào)控機(jī)制尚未明確。Gardiner[31]推測(cè)，體外受精魚(yú)類(lèi)精子具有三羧酸循環(huán)代謝的能力，可以通過(guò)氧化作用利用細(xì)胞外源性碳水化合物，延長(zhǎng)精子壽命。

不同魚(yú)類(lèi)精子最適葡萄糖、甘油濃度差異較大。澳洲鱈鱸（Maccullochella peelii peelii）精子在0.27 mol·L-1的葡萄糖濃度下活力及存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)[32]，而厚唇裂腹魚(yú)（Schizothorax irregularis）最適葡萄糖濃度為0.17 mol·L-1、最適甘油濃度為0.13 mol·L-1[33]。在本研究中，在0.22 mol·L-1的葡萄糖、甘油激活液中擬赤梢魚(yú)精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)顯著延長(zhǎng)，但在之后的0.30 mol·L-1激活液中精子活力驟降，是否在0.22～0.30 mol·L-1濃度范圍內(nèi)存在更佳適宜的濃度，還需進(jìn)一步驗(yàn)證[34]。擬赤梢魚(yú)繁殖期短，其精液質(zhì)量及精子活力在繁殖期后期顯著下降，本研究尚未做進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 結(jié)論

綜上所述，激活劑中Na+、K+濃度范圍為0.02～0.12 mol·L-1時(shí)可提高擬赤梢魚(yú)精子活力，0.14 mol·L-1時(shí)則出現(xiàn)抑制作用。其中，擬赤梢魚(yú)精液激活劑中精子活力最適的Na+、K+濃度均為0.08 mol·L-1；與Na+、K+的激活作用不同，低濃度的Ca2+、Mg2+（0.003～0.021 mol·L-1）明顯抑制擬赤梢魚(yú)精子的激活，因此在生產(chǎn)中應(yīng)避免使用高Ca2+、Mg2+含量的水體，以免抑制精子發(fā)揮作用。葡萄糖和甘油濃度為0.22 mol·L-1的激活劑中，擬赤梢魚(yú)精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命顯著延長(zhǎng)，為擬赤梢魚(yú)人工繁殖中提高精子活力以及精子冷凍保存液的配制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。