耐鹽異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Bacillus megatherium N07的分離及脫氮特性

高宇軒 靳靜晨 徐利杉 高雅娟 張聞天 李晨晨 張國偉 靳永勝，3

（1.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院，北京 102206；2.北京環(huán)氧環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司，北京 100000；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206）

化工生產(chǎn)、石油采集和沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖等各行業(yè)所排放的總含鹽量大于1%的廢水為高鹽廢水［1］，廢水中的氮素嚴(yán)重威脅水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。高鹽廢水中的無機氮主要包括氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮［2］。氨氮易導(dǎo)致地表水富營養(yǎng)化；硝態(tài)氮可還原為亞硝酸鹽后可導(dǎo)致高鐵血紅蛋白的形成，阻礙氧氣正常運輸，已被證明危害人體健康［3］。生物處理因二次污染少、處理效率高而被廣泛應(yīng)用于污水脫氮。傳統(tǒng)的生物脫氮工藝至少包括好氧硝化與厭氧反硝化兩個獨立的步驟，但因抗高氨氮沖擊負(fù)荷能力弱、基建成本高等問題增加運行的復(fù)雜性［4］。此外，鹽分過高的含氮廢水易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，酶活性降低而使微生物喪失代謝功能，增加了廢水處理的難度。

近年來，如糞產(chǎn)堿桿菌 Alcaligenes faecalis［5］、芽孢桿菌 Bacillus［6］、不動桿菌 Acinetobacter sp.［4］等異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株能夠在好氧條件下同時完成硝化和反硝化過程，將氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)變成氣態(tài)氮，能夠簡化處理工藝的同時因其繁殖速度快、抗逆性強等優(yōu)良脫氮性能而受到廣泛關(guān)注。已有報道部分異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌為輕度耐鹽菌，在3%-5%低鹽度條件下維持正常代謝活動，如趙坤等［6］從養(yǎng)殖廢水中分離獲得 Bacillus subtilis H1，氯化鈉濃度30 g/L 時是其最佳生長和脫氮條件，且氨氮去除率達(dá)到 87.2%；Yu等［7］從腌制廢水中篩選的蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus X7，在4%鹽度下最高去除52.1%的總氮。本實驗從河北農(nóng)藥化工污水中篩選到一株巨大芽孢桿菌Bacillus megatherium N07，研究該菌在不同鹽度（1%、4%、8%）、不同溶氧條件（有氧、微厭氧）下的脫氮特性；探究單因素環(huán)境因子對菌株氮素去除率的影響，以期為高鹽廢水的生物脫氮奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種樣品 含菌樣品取自河北某農(nóng)藥化工廠中的鈉鹽廢水。水質(zhì)情況：COD濃度107 200 mg/L、氨氮378 mg/L、pH值5.87、總鹽度14.18%。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5，酵母提取物5，氯化鈉10。

BTB（溴百里酚藍(lán)）培養(yǎng)基（g/L）：硝酸鉀1，天冬酰胺1，檸檬酸三鈉1，七水合硫酸鎂1，氯化鈣0.2，氯化鐵0.05，1%溴百里酚藍(lán)溶液5 mL，pH 7.0。

硝化培養(yǎng)基（g/L）：硫酸銨0.71，蔗糖3.78，磷酸二氫鉀 3，磷酸氫二鉀8，七水合硫酸鎂 0.05，微量元素溶液2 mL/L。

反硝化培養(yǎng)基1（g/L）：硝酸鈉0.91，蔗糖3.78，磷酸二氫鉀 3，磷酸氫二鉀8，七水合硫酸鎂 0.05，微量元素溶液2 mL/L。

反硝化培養(yǎng)基2（g/L）：亞硝酸鈉0.72，蔗糖3.78，磷酸二氫鉀 3，磷酸氫二鉀8，七水合硫酸鎂0.05，微量元素溶液2 mL/L。

微量元素溶液（g/L）：EDTA 35，F(xiàn)eSO4·7H2O 5，H3BO40.014，MnCl2·4H2O 0.99，CuSO4·5H2O 0.25，ZnSO4·7H2O 0.43，無水 CaCl20.19，NaMoO4·2H2O 0.22，CoCl2·6H2O 0.24。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 富集：取化工污水樣品按5%（V/V）比例加入100 mL富集培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min恒溫培養(yǎng)。每隔72 h轉(zhuǎn)接至新的富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集3次。

初篩：將分離純化后得到的菌株，劃線于溴百里酚藍(lán)（BTB）培養(yǎng)基中28℃恒溫培養(yǎng)，于24 h、36 h觀察培養(yǎng)基顏色變化篩選反硝化型菌株；再將以上菌株在反硝化培養(yǎng)基2中培養(yǎng)，于0 h、18 h后取樣檢測，采用格里斯試劑法進(jìn)一步驗證具有反硝化能力的菌株。

復(fù)篩：將上述篩選到的具備反硝化能力的菌株接種于硝化培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min恒溫培養(yǎng)12 h測定氨氮以及總氮降解率，將降解效果最佳的菌株選定為本實驗?zāi)繕?biāo)菌株。

1.2.2 菌株鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：純化目標(biāo)菌株并劃線于LB固體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察菌落生長形態(tài)；挑取固體菌落，采用革蘭氏染色法鏡檢觀察菌體形態(tài)特征；取培養(yǎng)24 h的新鮮菌液，分別經(jīng)過2.5%戊二醛、乙醇、叔丁醇前處理，冷凍干燥4 h。噴金后用掃描電鏡觀察菌體大小與形態(tài)特征。

分子生物學(xué)鑒定：取培養(yǎng)48 h的菌液，稀釋后對其16S rRNA進(jìn)行菌液PCR 擴增。PCR反應(yīng)體系共 25 μL：模板 DNA 2.5 μL ；引物27F 0.5 μL；引物1492R 0.5μL ；Taq酶 Mix 10 μL ；超純水 11.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性解旋95℃ 5 min；變性過程94℃ 1 min；退火過程55℃ 1 min；延伸過程72℃ 1 min；重復(fù)第二步30個循環(huán)；最終延伸72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電脈檢測，電泳儀180 V，25 min。PCR擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。將測序結(jié)果的序列在NCBI 官網(wǎng)上進(jìn)行 Blast比對分析，采用MEGA7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，完成菌株同源性分析。

1.2.3 耐鹽脫氮能力研究 硝化培養(yǎng)基中以添加1%、4%、8%（m/V）的氯化鈉作為不同梯度鹽度。取新鮮菌液按2%（V/V）比例分別接種于硝化培養(yǎng)基1和反硝化培養(yǎng)基2中，于28℃，120 r/min恒溫培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定OD600值以及氮去除率。

1.2.4 好氧反硝化特性探究 取對數(shù)生長期菌液，按2%（V/V）比例分別接種于反硝化培養(yǎng)基1和反硝化培養(yǎng)基2中。設(shè)定28℃，120 r/min搖瓶培養(yǎng)作為好氧培養(yǎng)實驗組；在28℃，靜置培養(yǎng)下作為微厭氧實驗組。每隔2 h取樣測定OD600值、硝態(tài)氮以及亞硝態(tài)氮含量，探究不同溶氧對菌株反硝化能力的影響。

1.2.5 環(huán)境因子對異養(yǎng)硝化性能探索 取對數(shù)生長期的菌液，以2%（V/V）比例接種于硝化培養(yǎng)基中，設(shè)定不同碳源、C/N、pH、轉(zhuǎn)速和溫度為單因素變量，培養(yǎng)至12 h取樣檢測OD600、氨氮和總氮濃度，研究環(huán)境因子對菌株生長情況和脫氮性能的影響。其中碳源：選取檸檬酸三鈉、葡萄糖、蔗糖、丙酮酸鈉和琥珀酸鈉；C/N分別為5、10、15、20、25；設(shè)定培養(yǎng)基的初始pH分別為5、6、7、8、9；不同轉(zhuǎn)速設(shè)定為100、120、140、160和180 r/min；溫度調(diào)節(jié)為8、18、28、38℃。

1.2.6 分析方法 以上試驗均設(shè)置3組平行。氨氮測定方法：納氏試劑分光光度法［8］；總氮測定方法：過硫酸鉀雙波長分光光度法［9］；亞硝態(tài)氮測定方法：N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法［9］；硝態(tài)氮測定方法：雙波長紫外分光光度法［9］。OD600為菌液在波長為600 nm時的吸光值。并計算降解率：

降解率（%） =（CK平均值-樣品平均值）/CK平均值×100%

采用 Excel2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選

初篩：經(jīng)過連續(xù)富集后，共分離純化出7株形態(tài)不同的菌株，編號為N01-N07。將7株菌于BTB培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基的變色情況。微生物在反硝化過程的每一步都需要氫離子的參與，因此pH值由中性向堿性偏移，溴百里酚藍(lán)作為酸堿指示劑在酸性、中性和堿性環(huán)境下分別呈現(xiàn)黃色、綠色和藍(lán)色。結(jié)果表明菌株N01、N04、N07培養(yǎng)基在24 h局部產(chǎn)堿變藍(lán)，于 36 h觀察到固體平板完全由綠變藍(lán)，初步推測這3株為反硝化功能菌株。

以亞硝態(tài)氮為氮源，將菌株N01-N07單獨搖瓶培養(yǎng)，定期取樣后采用格里斯試劑法，以試劑顏色變化探究菌株對于亞硝態(tài)氮的降解效果。18 h時菌株N01、N04、N07使試劑顏色變?yōu)闊o色，說明這3株菌降解亞硝態(tài)氮效果顯著。

復(fù)篩：將上述3株具有反硝化能力的菌株單獨搖瓶培養(yǎng)，測定其硝化性能。結(jié)果如表1，由檢測結(jié)果可知，培養(yǎng)至12 h菌株N07總氮、氨氮去除率分別達(dá)到63.84%和70.95%，降解效果最佳，故選為本試驗?zāi)繕?biāo)菌株。

表1 三株反硝化菌脫氮性能比較Table 1 Comparison of nitrogen removal performance of three denitrification strains

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株 N07 的形態(tài)學(xué)觀察如圖1。在固體培養(yǎng)基上形成乳白色、邊緣整齊且表面光滑的菌落；經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽性菌（G+）；SEM掃描電鏡結(jié)果表明菌體呈直桿狀，大小為5 μm×（10-15）μm。

圖1 菌株N07的形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Morphological identification of strain N07

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 PCR擴增菌株N07的16Sr-RNA片段。將該序列通過NCBI的 Blast比對分析，采用MEGA7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2結(jié)果表明菌株N07的16S rRNA片段和Bacillus megatherium基因序列相似性達(dá)99.8%以上，與Bacillus megatheriumCS55基因片段的親緣性最高，確定N07為巨大芽孢桿菌。

圖2 菌株N07的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain N07

2.3 耐鹽脫氮能力

為了解菌株N07在高鹽環(huán)境下的生長特性，設(shè)定培養(yǎng)基鹽度為1%、4%、8%（W/V），測定菌株在1-4 d培養(yǎng)期內(nèi)的OD600。圖3-A為菌株在氨氮培養(yǎng)基中的生長情況，結(jié)果顯示在不同鹽濃度下N07菌株的OD600總體處于上升趨勢，最高值達(dá)到2.055；而在圖3-B中可知，以亞硝態(tài)氮為氮源的培養(yǎng)基中N07的OD600隨培養(yǎng)時間延長略有下降，在鹽度為4%條件下OD600從1.198降至0.838，可能是由于發(fā)酵后期培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分匱乏，菌體無法維持正常活性所致。適量鹽度有益于維持微生物體內(nèi)與環(huán)境中滲透壓一致，穩(wěn)定胞內(nèi)相關(guān)酶活性，而過量鹽度則破壞細(xì)胞質(zhì)成分，活性衰退［10］。總體來看，菌株N07在鹽度為4%時菌株生長旺盛；當(dāng)鹽度增加至8%時，菌體生長緩慢，1 d時無繁殖跡象；培養(yǎng)后期2-4 d生長速度加快，最高OD600值上升至2.014。

圖3 不同鹽度下菌株N07的生長情況Fig.3 Growth of strain N07 under different salinities

為探究菌株N07在高鹽環(huán)境下的脫氮能力，在培養(yǎng)基鹽度分別為1%、4%、8%（m/V）時測定菌株在1-4 d培養(yǎng)期內(nèi)的氨氮以及亞硝態(tài)氮降解率。圖4結(jié)果顯示，1%和4%組的氮去除率在培養(yǎng)初期迅速上升，在培養(yǎng)至2 d氨氮和亞硝態(tài)氮去除率分別為70.01%和89.39%。鹽度4%時的氮去除率在2 d后達(dá)到平臺期，降解率無明顯波動。培養(yǎng)至4 d，氨氮降解率達(dá)到73.61%。在8%鹽度環(huán)境下菌株脫氮能力前期稍弱，菌株生長受到抑制。在1-2 d含鹽量≤4%時，氨氮轉(zhuǎn)化率不足50%。但隨著培養(yǎng)時間延長至3 d和4 d，氨氮及亞硝態(tài)氮降解率呈上升趨勢，最終分別達(dá)到73.61%和83.56%。

圖4 不同鹽度下菌株N07的脫氮效果Fig.4 Nitrogen removal effect of strain N07 at different salinities

2.4 好氧反硝化特性

為探究溶氧條件對菌株N07反硝化作用的影響，以硝態(tài)氮作為唯一氮源，初始氮濃度為150 mg/L，菌株N07的生長以及反硝化脫氮情況如圖5。圖5-A結(jié)果表明，好氧條件下菌株在4 h內(nèi)進(jìn)入對數(shù)生長期，0-6 h菌體迅速生長，OD600從0.676升至1.091；而微厭氧條件最高OD600僅為0.375，菌體未大量增殖。亞硝態(tài)氮積累量主要由硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化速率和亞硝態(tài)氮的消耗速率決定。好氧組在4-6 h硝態(tài)氮濃度顯著下降，去除速率最高達(dá)到35.25 mg/（L· h），隨著硝態(tài)氮的減少亞硝態(tài)氮濃度升高，最大積累量為31.25 mg/L，這一現(xiàn)象表明亞硝酸鹽取代硝酸鹽作為電子受體。好氧條件下6 h后菌體生長進(jìn)入平穩(wěn)期，硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮濃度同時下降，其中硝態(tài)氮最高去除率達(dá)到94.94%，相應(yīng)的反硝化速率為14.24 mg/（L· h）。而從圖5-B可知微厭氧組在整個反應(yīng)過程中，硝態(tài)氮濃度始終高于120 mg/L，亞硝態(tài)氮迅速積累，直到培養(yǎng)結(jié)束仍保持在75.34 mg/L，氮素并未得到降解。結(jié)果表明：硝態(tài)氮為唯一氮源時，菌株在氧氣充足條件下生長狀況較好，能將部分硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，同步去除硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮效果顯著。

圖5 不同溶氧條件下菌株N07降解硝態(tài)氮的性能Fig.5 Degradation performance of strain N07 under different DO

以亞硝態(tài)氮作為唯一氮源，初始氮濃度為75 mg/L，菌株N07的生長以及脫氮情況如圖6。如圖6-A可知，在好氧條件下，前4 h菌體生長處于遲緩期，這種現(xiàn)象可能是由于菌株需要一定時間適應(yīng)有毒環(huán)境。4-8 h隨著菌體大量增殖，亞硝態(tài)氮濃度從115.67 mg/L降至62.63 mg/L，降解速率為13.26 mg/L，并在10 h內(nèi)亞硝態(tài)氮去除率達(dá)到100%。由于亞硝態(tài)氮發(fā)生氧化，不同溶氧條件的硝態(tài)氮濃度分別增加到22.01 mg/L 和30.79 mg/L，均存在部分由亞硝態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。然而圖6-B中，在微厭氧條件下OD600最高值僅為0.342，亞硝態(tài)氮濃度始終保持在110 mg/L以上，未有效降解?？赡苡捎诰晟L受到抑制，導(dǎo)致反硝化性能無法發(fā)揮到最佳狀態(tài)。

圖6 不同溶氧條件下菌株N07降解亞硝態(tài)氮的性能Fig.6 Degradation of nitrite nitrogen by strain N07 under different DO

2.5 單因素環(huán)境因子對脫氮性能的影響

2.5.1 碳源 有機碳源的類型會影響細(xì)菌的生長和代謝速度。分別以檸檬酸鈉（SC）、葡萄糖（GLU）、蔗糖（SUC）、丙酮酸鈉（SP）和丁二酸鈉（SS）作為唯一碳源，研究碳源種類對菌株N07脫氮性能的影響。圖7結(jié)果表明，菌株N07可以利用多種有機碳源，在以檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖和丙酮酸鈉為唯一碳源時均有較好長勢，最高OD600值達(dá)到1.86。但以丁二酸鈉作為碳源時，菌體生長以及硝化功能明顯受阻，氨氮去除率僅為15.59%。其中以蔗糖作為唯一碳源時菌株具有最高的氮去除能力，總氮和氨氮降解效率分別達(dá)到90.11%和91.78%。

圖7 碳源對菌株N07脫氮能力的影響Fig.7 Effect of carbon source on the nitrification capacity of strain N07

2.5.2 碳氮比（C/N） 在振蕩培養(yǎng)中通過改變蔗糖添加量，研究了不同C/N對菌株N07細(xì)胞生長和脫氮性能的影響。如圖8所示，經(jīng)過12 h培養(yǎng)，菌體密度隨碳源濃度增加而上升，C/N為20時生長狀況最好，OD600為1.77。高C/N會加速細(xì)胞的合成和氮素降解，當(dāng)C/N從5增加至25，氨氮去除率從82.98%提高到100%，而總氮的去除率最高為65.26%，可能由于培養(yǎng)時間過短，亞硝態(tài)氮未能完全還原。然而C/N為5時總氮去除速率僅為5.69 mg/（L· h），可能由于碳源不足使細(xì)胞處于貧營養(yǎng)狀態(tài)，硝化反應(yīng)受到抑制。

圖8 碳氮比對菌株N07脫氮能力的影響Fig.8 Effects of C/N ratio on the denitrification capacity of strain N07

2.5.3 pH 設(shè)置培養(yǎng)基初始pH值為5、6、7、8、9，恒溫培養(yǎng)12 h后如圖9所示，菌株在pH=7時總氮和氨氮去除率最高，分別達(dá)到81.97%和100%。但在pH=5的酸性環(huán)境中，觀察到N07的生長和脫氮能力明顯受阻遏，OD600僅為0.725，總氮去除率不足20%，極端的酸性條件抑制細(xì)菌的代謝并損壞細(xì)胞，導(dǎo)致菌株喪失脫氮能力。在初始pH值為7-9的中性和弱堿性條件下，氨氮去除率始終穩(wěn)定在峰值90%-100%，表示菌株N07能夠在相對較寬的pH范圍內(nèi)生長良好并具有高效的硝化性能。

圖9 初始pH值對菌株N07脫氮能力的影響Fig.9 Effect of initial pH value on the denitrification capacity of strain N07

2.5.4 轉(zhuǎn)速 溶解氧是異養(yǎng)硝化過程中的關(guān)鍵參數(shù)之一，本研究通過調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為100、120、140、160和180 r/min來控制培養(yǎng)基中的溶解氧。從圖10可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速從100 r/min升高至160 r/min，總氮和氨氮去除率隨之增加，最高降解速率分別為7.97 mg/（L· h）和 6.67 mg/（L· h）。較高的溶氧量促進(jìn)了菌株N07的生長，在轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r/min時的OD600攀升至2.1，但相應(yīng)氨氮和總氮去除率略有下降，僅為56.8%和47.51%，表明過高的溶氧量也會抑制菌株的脫氮性能。

圖10 轉(zhuǎn)速對菌株N07脫氮能力的影響Fig.10 Effect of rotation speed on the denitrification capacity of strain N07

2.5.5 溫度 大多數(shù)好氧反硝化菌對環(huán)境溫度較為敏感。研究了菌株N07在8、18、28和38℃時的生長狀況和氮去除率。由圖11觀察到，外界溫度從8℃升高至28℃，菌體生長和代謝速度加快，總氮去除率從0.44%增加到62.91%。在溫度為28℃時菌體密度和脫氮性能最高，總氮和氨氮去除速率為6.72 mg/（L· h）和 7.86 mg/（L· h），OD600為 1.733。然而菌株在8℃低溫時生長緩慢，當(dāng)溫度上升至38℃時，總氮去除率也明顯下降至14.97%，表明N07菌株不能適應(yīng)極端低溫和高溫環(huán)境。

圖11 溫度對菌株N07脫氮能力的影響Fig.11 Effect of temperature on the denitrification capacity of strain N07

3 討論

在處理高鹽（鹽度＞1%）含氮廢水過程中，常見微生物不能抵抗較高鹽度的沖擊，導(dǎo)致這類廢水生物脫氮效率低下［11］。近年來已發(fā)現(xiàn)能進(jìn)行異養(yǎng)硝化好氧反硝化功能的嗜鹽菌屬有鹽單胞菌Halomonas sp.［12］，但耐受鹽度＞5%的脫氮菌株鮮有報道。因此，篩選嗜鹽菌有望解決含鹽廢水難脫氮的問題。本研究從河北農(nóng)藥化工污水中篩選到一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化型細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)與16S rRNA序列比對鑒定為Bacillus megatherium，命名為N07。

不同種屬微生物的耐鹽程度差異較大，依據(jù)最高耐受鹽度分類，能在3%-5%鹽度下生存的細(xì)菌稱之為耐鹽菌；耐受鹽度5%-15%為中度嗜鹽菌；大于15%為極端嗜鹽菌［1］。較高鹽分引發(fā)胞外滲透壓偏高，而絕大部分耐鹽菌株能在高滲透壓脅迫下分泌滲透壓補償溶質(zhì)，如甜菜堿（betaine）、四氫嘧啶（ectoine）、海藻糖（trehalose）等來增強細(xì)胞的抗逆協(xié)助作用，從而抵御外界極端環(huán)境對細(xì)胞活性的影響［10］。菌株N07能夠在8%鹽度下正常生長，維持生命代謝活動并高效脫氮，屬于中度嗜鹽菌，推測其為滲透壓補償溶質(zhì)分泌型菌株。目前已報道的H.campisalis.sp.nov［13］能在8.8%的鹽度下生長，但僅在厭氧條件下去除硝態(tài)氮；而袁建華等［1］從生活污水中篩到甲養(yǎng)芽孢桿菌 Bacillus methylotrophicus L7 最高耐鹽度僅為 3.5%。綜合比較，本試驗菌株Bacillus megatherium N07在高鹽分環(huán)境中具備更強的抗脅迫性和脫氮能力，這一特點為處理高鹽廢水奠定基礎(chǔ)。

研究了不同溶氧條件下菌株的反硝化性能差異。該菌在好氧條件下硝態(tài)氮最高反硝化速率為14.24 mg/（L·h），顯著高于黏質(zhì)沙雷氏菌［14］CL1502（4.6 mg/（L·h））和門多辛假單胞菌 TJPU04［3］（4.69 mg/（L· h））。氮轉(zhuǎn)化和細(xì)菌同化作用是脫氮過程中去除亞硝態(tài)氮的主要途徑，亞硝酸鹽的存在對細(xì)胞具有毒性［15］。菌株 N07 相比于假單胞菌 yy7［16］（去除速率為0.76 mg/（L· h））和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌L7［11］（去除速率為 0.24 mg/（L·h）），具有更強的反硝化能力且能夠同步硝化反硝化。陳均利等［17］研究表明，大多數(shù)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌在好氧條件下會積累亞硝態(tài)氮，而厭氧條件會抑制亞硝態(tài)氮的積累，然而菌株N07脫氮趨勢與之相反。反硝化菌主要通過表達(dá)周質(zhì)硝酸還原酶Nap和膜結(jié)合硝酸還原酶Nar來催化硝酸鹽的轉(zhuǎn)化，并在有氧條件優(yōu)先表達(dá)Nap，厭氧條件會優(yōu)先表達(dá)Nar［18］，它們對氧分子的敏感程度不同。根據(jù)結(jié)果推測菌株N07的反硝化過程主要由周質(zhì)硝酸還原酶Nap介導(dǎo)。

單因素環(huán)境因子對菌株硝化性能結(jié)果表明：（1）Bacillus megatheriumN07菌株的最適碳源為蔗糖，該結(jié)果與多數(shù)具有脫氮性能的細(xì)菌不同［19］，大多好氧反硝化菌更偏好以丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉等有機酸作為其最適碳源，而菌株在以琥珀酸鈉為碳源時氨氮去除率僅為15.59%，可能由于在菌株N07的異養(yǎng)硝化過程中，大分子多糖的氧化還原電位相比于有機酸具有更大優(yōu)勢［20］，與菌株N07同屬的Bacillus subtilisZF2-3［21］也觀察到類似情況。（2）菌株N07最佳 C/N為25，在低C/N下氮去除效率低，可能是碳源的匱乏使微生物硝化過程的電子供體供應(yīng)不足所致。在反硝化菌如Vibrio diabolicus SF16［11］、Diutina rugosa DW-1［22］等也觀察到類似情況，貧營養(yǎng)條件導(dǎo)致使細(xì)胞在內(nèi)源周期發(fā)生裂解。結(jié)果進(jìn)一步證實，有效的異養(yǎng)硝化過程可能與高有機負(fù)荷條件密切相關(guān)［23］。（3）在pH探究實驗中，與Ren等［24］、Guo等［11］報道的硝化細(xì)菌相似，菌株N07更傾向于中性或弱堿性的脫氮條件。這可能是因為在堿性介質(zhì)中，由于氨氮的氧化作用釋放氫離子生成NH3，pH值趨于中性，更有利于氨單加氧酶催化反應(yīng)［25］；菌株N07不能適應(yīng)酸性環(huán)境，可能由于在強酸條件下細(xì)胞損壞導(dǎo)致菌株喪失脫氮能力［26］。（4）不同轉(zhuǎn)速對菌株的生長和氮去除率影響不顯著（P＞0.05）。菌體密度隨轉(zhuǎn)速提高而增加，但當(dāng)轉(zhuǎn)速增加至180 r/min時的氮去除率反而下降，可能歸因于溶氧過高抑制了菌株N07關(guān)鍵硝化酶基因的表達(dá)，從而降低了氮去除效率［19］。Qin等［27］篩選的Paracoccus denitrificans的最大耐受氧濃度為2.20 mg/L；Ren等［24］分離的 Marino bacter，在轉(zhuǎn)速為150 r/min（溶氧6.08 mg/L）時可去除100%的總氮。結(jié)果證明，不同種屬微生物的溶氧水平有較大差異，通過調(diào)控溶氧量能有效提高脫氮性能。（5）在溫度為28℃時菌株N07具有最佳硝化性能，然而隨環(huán)境溫度降低，菌株生長與脫氮功能受到削弱。該現(xiàn)象在馮葉［28］發(fā)現(xiàn)的Pseudomonas mandelli也被檢測到，其在 10℃下生長時，負(fù)責(zé)同步硝化-反硝化的基因會延遲表達(dá)。向書迪等［13］在研究表明，溫度過低或過高會阻遏細(xì)菌的代謝和蛋白質(zhì)合成途徑，導(dǎo)致硝化過程關(guān)鍵酶活性減弱。在低溫條件，菌株N07可能是冷休克蛋白酶和抗氧化酶分泌不足［28］，機體受到損傷致使脫氮效率低下。

4 結(jié)論

從河北化工污水分離到一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株N07，根據(jù)16S rRNA序列比對結(jié)果，鑒定為Bacillus megatherium，革蘭氏 G+，掃描電鏡菌體呈直桿狀，大小為5 μm×（10-15）μm。Bacillus megatheriumN07在8%鹽度下繁殖生長并高效脫氮，最高氨氮及亞硝態(tài)氮降解率分別達(dá)到73.61%和83.56%。該菌在好氧條件下可同步去除硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮，最高去除速率分別為35.25 mg/（L· h）和13.26 mg/L。菌株N07在以蔗糖為碳源、C/N為25、pH為7、轉(zhuǎn)速160 r/min、溫度為28℃時具有最佳脫氮性能。