As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3菌株的生理生化響應(yīng)特性

袁存霞 李艷楠 張肖沖 楊瑞 劉建利，3 李靖宇，3

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，銀川 750021；3.國家民委黃河流域農(nóng)牧交錯區(qū)生態(tài)保護(hù)重點實驗室，銀川 750021）

快速的工業(yè)化進(jìn)程導(dǎo)致重金屬污染物大量排放到生態(tài)環(huán)境中，對人類、動物、植物和微生物造成嚴(yán)重的危害，其危害程度取決于重金屬在環(huán)境、食品和生物體中的濃度和化學(xué)形態(tài)［1］。砷（arsenic，As）作為痕量類金屬元素，在自然環(huán)境中存在形式主要有無機(jī)形態(tài)砷酸鹽（As5+）、亞砷酸鹽（As3+），有機(jī)形態(tài)包括一甲基砷酸、二甲基砷酸、三甲基砷酸［2］，其中As3+的毒性和遷移能力比As5+更強(qiáng)，前者的毒性是后者的100倍。砷在土壤中可與鐵、磷、硫和硅等元素相互作用通過植物進(jìn)入食物鏈，作為磷酸鹽的結(jié)構(gòu)類似物，砷酸鹽和亞砷酸鹽分別通過抑制氧化磷酸化和對半胱氨酸殘基的巰基的親和力來發(fā)揮毒性作用，對人具有高度致癌性［3-4］。由于自然環(huán)境的變化和人類活動的影響導(dǎo)致局部區(qū)域砷污染嚴(yán)重［5］。目前，對土壤砷污染的修復(fù)中微生物修復(fù)可通過自身的代謝對重金屬進(jìn)行積累，將高毒性的重金屬轉(zhuǎn)化為低毒性或無毒性的或?qū)χ亟饘龠M(jìn)行吸附等方式［6］，減少重金屬對土壤的污染的同時也具有節(jié)能環(huán)保的優(yōu)勢。

在自然界中對砷離子具有耐受性的微生物很多，其中包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）［4］、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和棘孢木霉（Trichoderma asperellum）［7］等，這些微生物可通過亞砷酸鹽氧化、砷酸鹽還原、亞砷酸鹽甲基化、亞砷酸鹽的外排、生物積累和吸附等耐受機(jī)制來適應(yīng)砷的脅迫［8］。微生物對砷的耐受機(jī)制與其在質(zhì)粒或染色體上的基因編碼或調(diào)控密切相關(guān)。其體內(nèi)砷相關(guān)基因主要分為抗性基因或新陳代謝基因［9］。砷氧化是將高毒性的As3+氧化為低毒性的As5+。微生物As3+氧化是微氧土壤和沉積物中砷固定化的重要地球化學(xué)過程，加速了砷濃度的衰減，并顯著控制了微氧條件下砷的行為，降低砷的遷移率，提高砷的固定效率［10］。砷還原的作用機(jī)理可以通過操縱子編碼的蛋白參與As3+解毒或者在還原過程中充當(dāng)最終的電子受體［11-12］。此外，微生物可分泌多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)組成胞外聚合物（EPS）等，通過-COOH、-NH2、-CH2、-OH和-C=O等官能團(tuán)的離子交換、氧化還原、絡(luò)合以及分子間的相互作用來吸附重金屬［13-14］。有研究表明，蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）在24 h時對砷的吸附率分別為（16.8±4.2）mg/g、（15.4±3.1）mg/g、（9.4±0.6）mg/g［15］。微生物對砷吸附能力的強(qiáng)弱與砷的轉(zhuǎn)化率有關(guān)［16］。

本研究選擇實驗室先前從生物土壤結(jié)皮（biological soil crusts，BSCs）中篩選得到的對多種重金屬具有耐受性的Bacillus sp.ZJS3進(jìn)行研究，探究Bacillus sp.ZJS3對As3+的耐受機(jī)制，以期為砷污染的治理提供優(yōu)勢菌株和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料是采集自騰格里沙漠東南緣地區(qū)生物土壤結(jié)皮（藻結(jié)皮和蘚結(jié)皮），于-80℃冰箱保存的菌種。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母浸粉5 g。

硫酸溶液：在75 mL水中加入25 mL濃硫酸。

抗壞血酸溶液：將1 g抗壞血酸和0.5 g亞硫酸鈉溶于100 mL蒸餾水中。

1.2 方法

1.2.1 菌株砷耐受范圍及其生長曲線測定 從-80℃冰箱取出保存菌種的甘油管，用接種環(huán)挑取菌落接種到LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)形成菌落，用無菌水沖洗斜面培養(yǎng)基，配制成200 mL菌懸液，培養(yǎng)24 h。查閱文獻(xiàn)［17］確定菌株ZJS3對砷的最低耐受濃度為100 mg/L，吸取0.2 mL菌懸液采用涂布法接種在不同As3+濃度梯度的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫條件下培養(yǎng)2 d，觀察菌落是否生長，進(jìn)一步確定As3+菌株最高耐受濃度。

選取As3+的濃度梯度為0 mg/L、100 mg/L、140mg/L、180 mg/L、220 mg/L、260 mg/L、300 mg/L，配制成LB液體培養(yǎng)基。將菌懸液以5%的接種量接種到培養(yǎng)基中，每個處理3個重復(fù)，在恒溫30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，每2 h用微量分光光度計測定其OD600，以空白LB液體培養(yǎng)基為對照。

1.2.2 菌株最適生長條件的單因素實驗 控制As3+的濃度為最低耐受濃度100 mg/L。pH影響實驗過程中，控制培養(yǎng)基pH分別為4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為30℃；轉(zhuǎn)速影響實驗過程中，控制轉(zhuǎn)速分別為50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min，pH為7.0，溫度為30℃；溫度影響實驗過程中，控制培養(yǎng)溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH為7.0。配制成液體培養(yǎng)基，將菌懸液以5%的接種量接種到培養(yǎng)基中，每個處理3個重復(fù)，在恒溫30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，用微量分光光度計測定其OD600，以空白LB液體培養(yǎng)基為對照。

1.2.3 As3+和Na+共同處理下菌株的生長 設(shè)置As3+濃 度 為 100 mg/L、130 mg/L、160 mg/L、190 mg/L、220 mg/L、250 mg/L、280 mg/L、300 mg/L（分別標(biāo)記為As1-As8），及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈉1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%（分別標(biāo)記為Na1-Na8），分別加入到錐形瓶中，配制成液體培養(yǎng)基，將菌懸液以5%的接種量接種到培養(yǎng)基中，每個處理3個重復(fù)，在恒溫30℃、轉(zhuǎn)速200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，用微量分光光度計測定其OD600，以空白LB液體培養(yǎng)基為對照。

1.2.4 菌株的氧化還原特性測定

1.2.4.1 定性硝酸銀（AgNO3）染色實驗［18］根據(jù)菌株最低耐受濃度100 mg/L和最高耐受濃度300 mg/L，配制液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以空白LB液體培養(yǎng)基為對照，將培養(yǎng)好的菌液和對照吸取到10 mL EP管中，向EP管中滴加0.1 mol/L AgNO3溶液，觀察其顏色的變化（Ag+與As3+反應(yīng)形成黃色沉淀，與As5+反應(yīng)形成深棕色沉淀）。

1.2.4.2 砷鉬藍(lán)法［19］測定砷含量及價態(tài) 選取As3+濃度為100 mg/L和300 mg/L，配制成液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液分別移取10 mL經(jīng)100 mg/L及300 mg/L砷脅迫的菌液于200 mL容量瓶用蒸餾水稀釋至刻度。

As5+含量的測定（處理一）：分別量取稀釋后的菌液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，加2 mL硫酸溶液，加2 mL鉬酸銨（30 g/L）溶液，加1 mL抗壞血酸溶液。

總砷含量的測定（處理二）：分別量取稀釋后的菌液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，加2 mL硫酸溶液，滴加高錳酸鉀溶液（0.01 mol/L），使溶液滴定至微紅色，加2 mL鉬酸銨溶液，加1 mL抗壞血酸溶液。

將上述兩個處理在沸水浴中放置10 min，取出冷卻，用水定容至50 mL容量瓶中，搖勻。使用紫外分光光度計在OD620處，以蒸餾水為對照，測定溶液的吸光度，每個處理3個重復(fù)。

As3+含量的測定：總砷含量減去As5+含量剩余的即為As3+的含量。

1.2.5 活性氧（ROS）、抗氧化酶活性和丙二醛含量測定 培養(yǎng)As3+（140 mg/L、260 mg/L）處理和不加As3+處理的菌株。用血球計數(shù)板計算出稀釋1 mL菌株的數(shù)量，控制菌體數(shù)量一樣，用索萊寶（Solarbio）科技有限公司研發(fā)的活性氧（ROS）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒和抗氧化酶活檢測試劑盒測定菌株的酶活性及含量。每個處理3個重復(fù)，均用Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛）測定。

1.2.6 生物掃描電鏡（SEM）觀察 根據(jù)ZJS3對As3+的耐受范圍，選取0 mg/L、140 mg/L和260 mg/L三個濃度梯度進(jìn)行培養(yǎng)，將ZJS3及As3+脅迫的培養(yǎng)物，3 000 r/min離心后棄培養(yǎng)基，收集菌體沉淀于管底（黃豆大?。?，用磷酸緩沖液洗1-2次，棄掉上清液，沿管壁緩慢加入4℃預(yù)冷的固定液，然后放入4℃冰箱保存12 h以上，將樣品送至杭州研趣信息技術(shù)有限公司進(jìn)行掃描電鏡拍攝（SU8010）。

1.2.7 EPS中蛋白質(zhì)和多糖測定 通過加熱法提取 EPS［20］。培養(yǎng)含 As3+量 0 mg/L、100 mg/L、180 mg/L、220 mg/L的菌液，吸取10 mL菌液，放到溫度為80℃水浴鍋中保溫10 min左右。冷卻后用高速冷凍離心機(jī)（TGL 16MB）以9 000 r/min常溫離心20 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.2.7.1 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量［21］制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL各以水補至2 mL，然后加入1.0 mL的6%苯酚和5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min以后測定OD490，以2.0 mL的dH2O按同樣操作為空白，縱坐標(biāo)為吸光值，橫坐標(biāo)為多糖含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品多糖含量測定：準(zhǔn)確吸取樣品溶液2.0 mL按上述步驟同樣操作，測吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

1.2.7.2 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量［21］制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL， 加 入 NaCl溶液補至1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)試劑5 mL，搖勻，反應(yīng)5-10 min后，于OD595測定吸光值，以1 mL的NaCl溶液按同樣顯色操作作為空白，縱坐標(biāo)為吸光值，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品蛋白含量測定：準(zhǔn)確吸取樣品溶液1.0 mL按上述步驟同樣操作，測吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.2.8 菌株的吸附特性 測定pH對菌株As3+吸附率的影響時，設(shè)置pH為4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，保持加菌量為5%，As3+濃度為最低脅迫濃度；測定加菌量對菌株As3+吸附率的影響時，設(shè)置加菌量為1%、3%、5%、7%、10%，保持pH為最佳pH（即7.0），As3+濃度為最低脅迫濃度；測定As3+濃度對菌株As3+吸附率的影響時，設(shè)置As3+濃度梯度為 100 mg/L、140 mg/L、180 mg/L、260 mg/L、300 mg/L，保持加菌量為5%，pH為最佳pH（即7.0）。將菌液培養(yǎng)24 h后13 000 r/min，常溫離心10 min取上清液過濾，用于測定剩余As3+濃度。As3+的吸附率R和吸附量qe計算分別見式（1）和式（2）。

式中，c0為處理前水中原有As3+濃度（mg/L）；ce為處理后水中剩余As3+濃度（mg/L）；V為溶液體積（mL）；m為菌株質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果

2.1 菌株Bacillus sp.ZJS3的砷耐受范圍和生長曲線

對菌株Bacillus sp.ZJS3進(jìn)行不同As3+濃度梯度的培養(yǎng)，最終得到該菌株對于As3+的耐受濃度范圍100-300 mg/L。菌株Bacillus sp.ZJS3在不同As3+濃度脅迫下的生長曲線如圖1所示。與對照組相比，由于受到砷的脅迫，菌株的生長數(shù)量始終比對照組低，且隨著砷濃度梯度的增大，菌株的生長數(shù)量也隨著濃度的增大呈梯度降低的趨勢。砷濃度為100 mg/L，菌株在10 h時生長數(shù)量達(dá)到一定值后，開始下降；在16 h時，菌株的數(shù)量出現(xiàn)回升且持續(xù)增長。砷濃度為140 mg/L，菌株在12 h時生長數(shù)量達(dá)到最大值。砷濃度為180 mg/L、220 mg/L，菌株在14 h和16 h時生長數(shù)量達(dá)到最大值。砷濃度為260 mg/L和300 mg/L，菌株在24 h內(nèi)數(shù)量未達(dá)到最大值。

圖1 菌株Bacillus sp.ZJS3在不同As3+濃度脅迫下的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain Bacillus sp.ZJS3 under stress of different As3+ concentrations

2.2 菌株Bacillus sp.ZJS3較適宜生長條件的確定

pH值、轉(zhuǎn)速、溫度對菌株Bacillus sp.ZJS3生長的影響如圖2。pH=7.0時，菌株生長的濃度顯著高于其他pH值下菌株的生長濃度，因此在As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3更適合在中性條件下生長且弱堿性條件下生長較好。隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株濃度先下降后升高，在轉(zhuǎn)速為200 r/min和250 r/min時，菌株的濃度達(dá)到最高且差異不顯著，所以在As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3轉(zhuǎn)速為200 r/min時生長較好。隨著溫度值的上升，菌株濃度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在溫度為30℃時菌株生長濃度顯著高于其余溫度下菌株的生長濃度，說明在As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3在30℃條件下生長較好。

圖2 不同條件對As3+脅迫Bacillus sp.ZJS3生長的影響Fig.2 Effects of different conditions on the growth of Bacillus sp.ZJS3 under As3+ stress

2.3 As3+和Na+共同處理下菌株Bacillus sp.ZJS3的生長

在 Na+（1%-8%）與 As3+（100 mg/L、130 mg/L、160 mg/L、190 mg/L、220 mg/L、250 mg/L、280 mg/L、300 mg/L編號為As1-As8）的共同脅迫下，低濃度的As3+和Na+脅迫下菌株的生長數(shù)量與對照組相比無顯著性差異，并且隨著Na+濃度的增加，菌株的生長數(shù)量逐漸降低。在As3+濃度為3（160 mg/L）和4（190 mg/L）時，與低濃度的Na+（1%-3%）共同脅迫下，菌株的生長數(shù)量與對照組相比差異顯著，對菌株的生長有明顯的促進(jìn)作用；在高濃度As3+和Na+的脅迫下，對菌株生長產(chǎn)生明顯的抑制作用（圖3）。所以，在一定濃度As3+脅迫下，適當(dāng)?shù)脑黾覰a+的濃度，可以促進(jìn)菌株Bacillus sp.ZJS3生長。

圖3 As3+和Na+共同脅迫下Bacillus sp.ZJS3的生長Fig.3 Growth of Bacillus sp.ZJS3 under the combined stress of As3+ and Na+

2.4 菌株Bacillus sp.ZJS3的氧化還原特性

圖4中5個EP管中最左邊為對照組（不加菌），右邊4個均為樣本組（加菌）。向砷濃度為100 mg/L和300 mg/L的EP管中滴加硝酸銀，觀察到溶液逐漸由黃色變?yōu)樯钭厣?，說明溶液中含有As5+。

圖4 定性硝酸銀（AgNO3）染色Fig.4 Qualitative silver nitrate（AgNO3）staining

砷鉬藍(lán)法測定溶液中不同價態(tài)砷含量的結(jié)果表明，隨著時間的增加As3+含量逐漸降低，而As5+含量逐漸升高（圖5）。A、B是在100 mg/L As3+脅迫下24 h和48 h測得的溶液中As3+、As5+和總砷的含量；C、D是在300 mg/L As3+脅迫下24 h和48 h測得的溶液中As3+、As5+和總砷的含量。硝酸銀（AgNO3）染色和砷鉬藍(lán)法測定結(jié)果表明菌株Bacillus sp.ZJS3具有氧化還原的能力。

圖5 砷鉬藍(lán)法測定砷含量Fig.5 Determination of arsenic content by arseno-molybdenum blue method

2.5 活性氧（ROS）、抗氧化酶活和MDA含量測定

ROS為氧的正常代謝的天然副產(chǎn)物，主要來源于氧的自由基和非自由基。Bacillus sp.ZJS3胞內(nèi)ROS的含量在高濃度As3+的脅迫逐漸降低，在較低濃度下ROS含量可能會升高（圖6）。細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶可以有效的避免細(xì)胞內(nèi)活性氧和過氧化氫等對細(xì)胞的影響。隨著As3+濃度的增加，與對照組相比，過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性和MDA整體呈現(xiàn)上升趨勢，MDA含量的升高證明了細(xì)胞膜發(fā)生了脂質(zhì)過氧化（圖7）。

圖6 As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3胞內(nèi)的ROS含量Fig.6 Content of ROS in Bacillus sp.ZJS3 cell under As3+stress

圖7 As3+脅迫對Bacillus sp.ZJS3的抗氧化酶活及MDA含量的影響Fig.7 Effects of As3+ stress on the antioxidant enzyme activity and MDA content of Bacillus sp.ZJS3

2.6 生物掃描電鏡（SEM）

在未受砷脅迫時，ZJS3的形態(tài)呈現(xiàn)粗短狀，且細(xì)胞表面附著褶皺（圖8-A）。隨著砷脅迫程度的增強(qiáng)，ZJS3細(xì)胞表面的物質(zhì)逐漸增多，菌體表面變得略光滑，菌體形狀呈現(xiàn)變長的狀態(tài)，且表面出現(xiàn)一層顆粒狀的物質(zhì)（圖8-B、C）?？赡苁怯捎谏榇x過程中，某個基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞膜表面變長，也可能是有砷吸附在細(xì)胞膜的表面，因此需要對Bacillus sp.ZJS3對砷的耐受機(jī)制需要進(jìn)一步研究確定。

圖8 不同As3+濃度脅迫下Bacillus sp.ZJS3的掃描電鏡圖Fig.8 SEM of Bacillus sp.ZJS3 under different As3+ stress

2.7 菌株Bacillus sp.ZJS3 EPS的蛋白質(zhì)和多糖測定

在0 mg/L、100 mg/L、180 mg/L、220 mg/L的砷濃度的脅迫下菌體胞外多糖的含量隨著砷濃度的增加顯著增大，這說明可溶性多糖可能螯合砷離子，阻止砷離子靠近細(xì)胞減少砷離子對菌株的危害（圖9-A）；而菌體胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量隨著砷離子濃度的增加先升高后降低，低濃度的砷脅迫可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成大量的蛋白質(zhì)來抵抗砷脅迫，隨著砷濃度的增加，對細(xì)胞合成蛋白質(zhì)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的含量下降（圖9-B）。

圖9 As3+脅迫下菌株Bacillus sp.ZJS3 EPS中多糖和蛋白質(zhì)的含量Fig.9 Contents of polysaccharides and proteins in EPS of Bacillus sp.ZJS3 under As3+ stress

2.8 菌株的吸附特性

在pH=7.0時，吸附率達(dá)到最高25.00%，吸附量為3.23 mg/g（圖10-A）；在砷濃度為100 mg/L、pH=6.0、接菌量為1%時，菌株的吸附率為23.63%，吸附量為3.06 mg/g；pH=6.0，接菌量為5%時，隨著砷離子濃度的增加，菌株的吸附率先升高后降低（圖10-B）；在砷濃度為100 mg/L、接菌量為5%時，Bacillus sp.ZJS3對As3+的吸附率隨著pH的升高先上升后降低（圖10-C）。因此，影響ZJS3吸附率的最適pH值為7。

圖10 不同條件下ZJS3對As3+的吸附率Fig.10 Adsorption rates of As3+ by ZJS3 under different conditions

3 討論

谷氨酸棒桿菌MTCC 2745［22］能夠在砷濃度為1 000 mg/L的培養(yǎng)基中生長，菌株Bacillus sp.ZJS3對As3+的最高耐受濃度與的谷氨酸棒桿菌MTCC 2745耐受濃度相比，菌株Bacillus sp.ZJS3的耐受濃度較低。芽孢桿菌具有較厚的細(xì)胞壁，可以通過自身的耐鹽基因的調(diào)節(jié)增強(qiáng)耐鹽性，不會因脫水而死亡［23］。有關(guān)研究表明，與單獨砷相比，砷和鹽共同處理下植物的葉、莖和根中砷的積累減少，在高砷脅迫條件下，鹽提高了As的耐性指數(shù)［24］。結(jié)果表明，在低濃度的As3+和Na+共同處理的條件下，與對照組相比，菌株生長的更好，可能是由于低濃度的鹽，減少了砷離子在菌株體內(nèi)的積累，提高了砷離子的耐性，所以低濃度的鹽脅迫可以緩解As3+對Bacillus sp.ZJS3菌體的毒害。細(xì)菌在長期的砷環(huán)境下生存，逐漸進(jìn)化形成某種機(jī)制來減少砷離子對菌株的毒害，以便修復(fù)環(huán)境中的砷污染，砷污染的修復(fù)一般有As3+氧化、As5+還原、砷的甲基化、吸附和沉淀等方式［25］。本研究中篩選到的Bacillus sp.ZJS3是一種As3+氧化細(xì)菌，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，比較適宜的培養(yǎng)條件pH為7.0、轉(zhuǎn)速為200 r/min、溫度為30℃。在24 h內(nèi)低濃度砷脅迫下，生長濃度是先升高后降低再升高。剛開始升高是由于多糖螯合As3+，菌體產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)來抵抗砷脅迫，減少了As3+對菌體的毒害作用［26］，但多糖只能螯合部分As3+，隨著濃度的增大，As3+對菌株產(chǎn)生毒害作用加劇，Bacillus sp.ZJS3可以將As3+氧化為As5+，降低了砷離子的毒性，菌株生長濃度再次升高。

為探究該菌體是否對砷離子具有吸附特性，本研究對含有As3+和含有不同濃度的As3+的菌液拍攝了生物掃描電鏡（SEM），與對照組相比，As3+處理過得菌體變長，且隨著As3+濃度越高菌體表面出現(xiàn)顆粒狀的物質(zhì)逐漸增多。通過吸附率的測定，該菌株具有一定的吸附特性，但對砷離子的吸附率較低。相對于吸附率較高的菌株A4［17］，其菌體表面褶皺明顯增多，且團(tuán)粒結(jié)構(gòu)變大，與該菌株形態(tài)有所差別，可能是由于菌株的將As3+氧化成As5+毒性變低且吸附率較低的原因。由于細(xì)胞吸附金屬離子主要靠靜電吸引、離子交換和表面絡(luò)合的方式進(jìn)行吸附，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時，吸附位點飽和，吸附率會逐漸降低［27］。本研究中pH影響吸附率實驗表明，較低的pH值，會促進(jìn)細(xì)胞壁與水合氫離子結(jié)合，占據(jù)吸附活性位點，增加細(xì)胞表面的靜電斥力，阻止金屬離子與細(xì)胞壁結(jié)合［28］；較高的pH，會使細(xì)胞的生長和活性都受到影響，pH越高，溶液中會產(chǎn)生沉淀覆蓋在細(xì)胞表面，吸附作用受到抑制。

微生物在重金屬或其他極端條件的脅迫下，會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS（單線態(tài)氧、超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基），但過量的ROS會對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生危害作用，可以通過SOD、CAT、POD共同作用來改變酶的活性來調(diào)節(jié)體內(nèi)活性氧自由基的平衡，促進(jìn)抗氧化酶的活性升高［29］。MDA含量是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)。本研究中ROS含量隨著As3+濃度升高而降低，與大腸桿菌MG1655所測得的結(jié)果一致［30］，但大腸桿菌MG1655是由于Mn-SOD酶在抗重金屬脅迫中起重要作用，本研究中可能是由于SOD、CAT、POD對活性氧的有效去除或者自由基通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成了MDA，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高，有關(guān)代謝通路的分析，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究篩選到的菌株對As3+具有一定的耐受性且有較低的吸附性，能把As3+氧化成As5+，可以減少對土壤的危害，為低濃度As3+土壤污染微生物治理提供理論基礎(chǔ)。