microRNA-96與膿毒癥新生兒炎癥反應的關系研究

張春磊,李秀婷,劉 娜,張成元

濰坊市婦幼保健院兒科,山東濰坊 261011

膿毒癥是指由感染、燒傷等因素導致宿主免疫反應失調而誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，也是嚴重感染、外科手術、休克、創(chuàng)傷等患者的并發(fā)癥，具有病死率高、發(fā)病率高、預后差等特點[1-2]。近年來，膿毒癥在兒童中的發(fā)病率呈逐年增長趨勢，在病情進展過程中可能造成多器官功能障礙綜合征、膿毒癥休克，嚴重威脅患兒生命健康[3-4]。目前，臨床認為新生兒膿毒癥(NS)的發(fā)病機制與凝血功能異常、組織損傷、全身炎癥反應、免疫功能障礙等有關，但臨床工作者對NS的病理生理學認知上仍存在一定不足，深入分析本病具體病因及發(fā)病機制，尤其是借助測序技術、分子生物學等手段探索新型標志物及靶點，在NS的早期診斷、治療中尤為重要[5]。作為一類新型的基因調控分子，微小核糖核酸(miRNA)可通過調節(jié)部分蛋白及基因的mRNA表達，而參與多種感染/炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[6]。miR-96是miR-183家族重要成員之一，已有諸多研究證實，其在食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達異常，但目前關于miR-96在NS中表達情況的研究較少，且相關機制尚不清楚[7]。鑒于此，本研究就miR-96表達與NS及炎癥反應的關系進行分析，旨在進一步闡述NS的機制，掌握miR-96表達與炎癥反應的相關性，為臨床診治NS提供可靠的理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年6月至2020年4月在本院住院治療的65例NS患兒作為NS組，將同期65例非感染性SIRS患兒作為非感染性SIRS組，另選50例健康體檢兒童作為健康組。納入標準：NS組、非感染性SIRS組患兒符合美國重癥醫(yī)學會(ACCM)與歐洲重癥醫(yī)學會(ESICM)聯(lián)合發(fā)布的NS、非感染性SIRS相關診斷標準[8]；家屬自愿簽署知情同意書。排除標準：伴有心、肝、腎等重大臟器病變；伴有結締組織疾病、先天性畸形、染色體疾病、先天性遺傳代謝?。恢型巨D院或因其他原因而未完成相關指標；入院24 h內即出院；出生后不足7 d。本研究符合醫(yī)學倫理委員會制定標準。

1.2方法

1.2.1miR-96檢測 采集所有受檢者外周血2 mL[健康組于體檢當日采集，NS組、非感染性SIRS組于入院后(治療前)采集]，置于EDTA抗凝試管，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿于1.5 mL EP管。參考Trizol試劑盒、總RNA提取試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)說明書提取血漿中總RNA，使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA(miR-96引物序列：上游為5′-TCT GGG TAC CGC ACT GGT AGA ATT CAC TG-3′，下游為5′-CCT TTC TAG ACC ACG GCA CCA TTC AGG A-3′)，按廠家說明書進行操作。以反轉錄的cDNA為模板，用熒光定量PCR技術(PRISM 7000型定量PCR儀)檢測miR-96的表達水平。反應條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，重復40循環(huán)，72 ℃ 10 min，采集熒光，以U6作為內參，用2-ΔΔCt法計算miR-96的相對表達量。U6引物序列：上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.2.2炎性因子檢測 采集所有受檢者外周血2 mL[健康組于體檢當日采集，NS組、非感染性SIRS組于入院后(治療前)采集]，離心10 min(3 000 r/min，離心半徑為6 cm)，取血清放于低溫冰箱中待測。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平，試劑盒購自北京億鳴復興生物科技有限公司。

2 結 果

2.13組一般資料比較 3組性別、孕周、年齡、體質量、5 min Apgar評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；NS組、非感染性SIRS組原發(fā)疾病比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；NS組序貫器官衰竭評估(SOFA評分)、急性生理學和慢性健康評價Ⅱ(APACHEⅡ評分)比非感染性SIRS組高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組一般資料比較(n/n或

2.2miR-96、炎性因子水平比較 NS組miR-96 表達水平比非感染性SIRS組、健康組低，IL-1β、IL-6、TNF-α水平比非感染性SIRS組、健康組高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清miR-96、炎性因子水平比較

2.3miR-96表達水平與炎性因子水平相關性 Pearson相關分析結果顯示，miR-96表達水平與IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈負相關(r<0，P<0.05)。見表3。

表3 miR-96表達與炎性因子水平相關性

2.4NS組不同預后患兒血清各指標差異 根據(jù)入院28 d內存活情況分為兩組。死亡組miR-96表達水平比存活組低，IL-1β、IL-6、TNF-α水平比存活組高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 NS組不同預后患兒血清各指標差異對比

2.5miR-96對NS患兒預后的預測價值 將miR-96作為檢驗變量，將NS患兒預后作為狀態(tài)變量(0=存活，1=死亡)，繪制ROC曲線，結果顯示，miR-96預測NS患兒病死的AUC為0.903(95%CI：0.846～0.978)，以0.75為臨界值，其靈敏度、特異度分別為0.894、0.855，約登指數(shù)為0.749。見圖1。

圖1 miR-96預測NS患兒預后的ROC曲線圖

3 討 論

由于新生兒各免疫器官、臟器不成熟，皮膚黏膜屏障功能差，獲得性免疫及固有免疫共同缺陷，加之受中心靜脈置管等有創(chuàng)操作影響，易發(fā)生感染，進展為NS[9]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥信號通路的級聯(lián)放大及激活，造成炎癥細胞因子過度釋放是誘發(fā)NS的主要機制之一[10]。因此，防治NS疾病及提升預后的關鍵在于維持機體內抗炎因子、促炎因子間平衡、抑制促炎因子表達。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-16、miR-21、miR-150、mR-146等多種miRNA通過作用于炎癥通路的重要基因而參與炎癥發(fā)展過程中[11-12]。

miRNA屬于一種易感基因，通過與目標mRNA的3′-UTR區(qū)相結合，誘導目標mRNA降解，調節(jié)靶基因蛋白和mRNA表達，進而參與細胞血管生成、分化、凋亡等生物學過程中[13]。WANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與調節(jié)炎性細胞及介質的表達過程中，通過靶控相關信號通路及免疫功能而影響膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展。miR-96為miR-183家族成員，定位于人類染色體7q32，在多種腫瘤中異常表達。SINGH等[15]研究報道，miR-96高表達可抑制相關靶基因轉錄后蛋白表達，降低炎癥反應，干擾相關免疫通路。LU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96在膿毒癥致腎損傷患者中呈異常表達，且其調節(jié)的靶基因主要參與Wnt信號通路及Ⅰ組代謝型谷氨酸受體通路、白細胞介素信號通路的調控中。本研究結果發(fā)現(xiàn)，相比非感染性SIRS組、健康組，NS組血清miR-96 mRNA表達較低，證實NS患兒血清miR-96水平下調，這可能與炎癥因子表達和炎癥細胞的浸潤通過TLR/IL-1β或NF-κB信號通路而調節(jié)miR-96表達有關。陳建德t[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96在NS患兒血清中呈低表達，預測免疫相關基因為IL-16、CD4、IL-17B、TNFRSF13B等，在NS炎癥反應、免疫調節(jié)及宿主免疫應答中發(fā)揮重要作用，與本研究結論基本一致。

NS從本質上來說是機體對感染性因素的反應，疾病發(fā)生時會大量釋放細胞因子、血管活性物質、氧自由基、急性期反應物質、趨化因子等，破壞抗炎因子、促炎因子之間平衡，進而導致機體免疫功能受損[18-19]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，NS組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比非感染性SIRS組、健康組高，提示NS患兒血清炎性因子水平上調，機體處于感染狀態(tài)，體內抗炎及促炎反應系統(tǒng)紊亂。黃林楓等[20]研究結果顯示，膿毒癥組IL-6、IL-10、TNF-α表達明顯高于非感染性SIRS組和對照組，與本研究結果基本一致。Pearson相關分析結果顯示，miR-96表達水平與IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈負相關，由此可以推測miR-96可通過調節(jié)炎癥反應而參與NS發(fā)生中。原因可能在于miR-96作用于IL-16、PTGS2、CD4、IL-17B等多個靶點，并調控NF-κB信號通路，觸發(fā)多種級聯(lián)反應，影響免疫細胞的分化、調節(jié)過程，進而負反饋調節(jié)免疫炎癥反應，從而控制炎癥反應。miR-96通過不同的作用機制影響NS患兒的炎癥反應，從而在不同預后轉歸的患兒中得到體現(xiàn)，本研究中，死亡組血清miR-96表達水平比存活組低，miR-96預測NS患兒病死率的AUC為0.903，靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為0.894、0.855、0.749，故早期監(jiān)測血清miR-96表達水平變化可有效預測患兒近期預后，對NS預后評估具有重要意義，且利于指導臨床對應治療。

綜上所述，NS患兒血清miR-96水平下調，炎性因子水平上調，二者呈負相關；且miR-96水平對NS預后有一定的預測價值，有望成為基因轉錄水平早期診斷NS及評估預后的新型生物標志物。但由于病例數(shù)相對較少，產(chǎn)生的統(tǒng)計學結果可能存在一定偏倚，故后期還需擴大樣本量及延長隨訪時間，進一步驗證血清miR-96表達水平與NS炎性因子及預后的關系；此外，還需從分子生物學角度深入分析miR-96是通過何種信號通路而影響炎癥反應，以進一步明確miR-96在NS患兒致病過程中的作用機制。