肝癌組織中miR-7-5p、UbcH10表達(dá)水平與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性研究

檀喜玲,馮 喆,高 芳

1.邯鄲市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河北邯鄲 056009;2.邯鄲市中心醫(yī)院普外科，河北邯鄲 056001;3.邯鄲市第一醫(yī)院普外科，河北邯鄲 056002

據(jù)WHO公布的數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌)是一種發(fā)病率居第6位、死亡率居第2位的常見(jiàn)惡性腫瘤，其中乙型肝炎病毒相關(guān)細(xì)胞癌和丙型肝炎病毒相關(guān)細(xì)胞癌占比約為80.00%[1]。肝癌早期無(wú)特異性癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，且手術(shù)治療后5年內(nèi)的死亡率高達(dá)50.00%[2]。因此，尋找高靈敏度、高特異度的分子標(biāo)志物用于肝癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估成為臨床研究的熱點(diǎn)。微小RNA(miRNA)是一類由21～23個(gè)堿基組成的非編碼單鏈RNA,通過(guò)種子序列與靶細(xì)胞的3′UTR相結(jié)合，促進(jìn)靶基因miRNA降解或抑制蛋白翻譯過(guò)程，負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[3]。miRNA-7是miRNA成員之一，miRNA-7-5p是miRNA-7的成熟體，其已被證實(shí)可靶向控制P13K/Akt、FAK等基因來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[4]。泛素結(jié)合酶UbcH10是第10個(gè)被識(shí)別的人泛素結(jié)合酶，作為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白，能夠與細(xì)胞促進(jìn)復(fù)合物的相互作用來(lái)驅(qū)動(dòng)有絲分裂的后期轉(zhuǎn)換[5]。已有研究表明，UbcH10參與了非小細(xì)胞肺癌、腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展的過(guò)程[6-7]。目前，miR-7-5p及UbcH10與原發(fā)性肝癌的相關(guān)研究較少，本研究通過(guò)測(cè)定該兩種生物標(biāo)記物在肝癌組織中的表達(dá)情況，分析其與肝癌病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年12月至2018年12月間在邯鄲市人民醫(yī)院(下稱本院)行肝癌切除手術(shù)治療的57例患者臨床資料，術(shù)中分別采集肝癌組織和癌旁組織(距離癌灶>5 cm)57份。男34例，女23例；年齡53～68歲，平均(59.3±3.7)歲；腫瘤最大徑>5 cm者30例，≤5 cm者27例；分化程度：高分化11例、中分化32例、低分化14例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期26例；包膜形成：有包膜37例、無(wú)包膜20例；門靜脈侵犯：侵犯25例，未侵犯32例；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測(cè)結(jié)果：陽(yáng)性47例，陰性10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均行手術(shù)治療，術(shù)后病理診斷為肝癌；(2)臨床及術(shù)后隨訪資料真實(shí)完整；(3)預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；(4)所有患者及家屬對(duì)試驗(yàn)知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位惡性腫瘤；(2)伴原發(fā)性腎功能障礙者；(3)伴不穩(wěn)定系統(tǒng)性疾病者；(4)行放化療治療者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器 miR-7-5p與陰性對(duì)照(miR-NC)購(gòu)自上海吉瑪公司；Trizol試劑、脂質(zhì)體 Lipo2000購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；PCR引物及RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；UbcH10引物由上海生工公司提供，UbcH10多克隆體購(gòu)自Santa Crus公司。

1.3方法 取術(shù)中采集的新鮮肝癌組織及癌旁組織各100 mg，加入1 mL Trizol至樣本中裂解，提取總RNA，使用超微兩紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA水平、純度，再以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板PCR擴(kuò)增，分別以U6、GAPDH為內(nèi)參。miR-7-5p及UbcH10引物序列分別由TAKARA、Santa Crus公司設(shè)計(jì)合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-7-5p、UbcH10行qPCR檢測(cè)的引物序列

PCR檢測(cè)反應(yīng)體系：按照說(shuō)明書配置反應(yīng)液20 μL，模板cDNA 1 μL，dNTPmix 12.5 μL，dH2O 9.5 uL，上下游引物各1 μL。miR-7-5p PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s受熱變性，再以每2 s遞增0.5 ℃，65～85 ℃行溫度梯度退火。UbcH10 PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算組織標(biāo)本中miR-7-5p，UbcH10表達(dá)水平。

1.4隨訪 所有患者術(shù)后通過(guò)門診復(fù)查、電話等方式隨訪，隨訪頻率為3個(gè)月1次，隨訪終點(diǎn)時(shí)間為2021年10月或患者死亡。復(fù)發(fā)：治療后血清甲胎蛋白水平明顯升高，且影像學(xué)檢查顯示有新的腫瘤灶；進(jìn)展：影像學(xué)檢查顯示腫瘤兩個(gè)最大相互垂直直徑乘積>25.00%；本研究未出現(xiàn)失訪情況，隨訪率為100.00%。

2 結(jié) 果

2.1miR-7-5p、UbcH10在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平 肝癌組織中miR-7-5p表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.125,P<0.001)，而UbcH10表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(t=26.812,P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 miR-7-5p、UbcH10在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2肝癌組織中miR-7-5p及UbcH10表達(dá)水平與病理特征的相關(guān)性 以miR-7-5p>0.474為高表達(dá)，反之為低表達(dá)；以肝癌組織中UbcH10>0.711為高表達(dá)，反之則為低表達(dá)。分析57例肝癌患者性別、年齡、腫瘤最大徑、TNM分期、分化程度、包膜形成、門靜脈侵犯、HBsAg等病理特征與該兩種生物標(biāo)記物的相關(guān)性。結(jié)果顯示，miR-7-5p表達(dá)水平與分化程度、包膜形成、門靜脈侵犯等特征相關(guān)(P<0.05);UbcH10相對(duì)表達(dá)與腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期、門靜脈侵犯相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 UbcH10及miR-7-5p表達(dá)水平與肝癌病理特征的相關(guān)性[n(%)]

續(xù)表2 UbcH10及miR-7-5p表達(dá)水平與肝癌病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.3miR-7-5p及UbcH10不同表達(dá)水平與患者生存率的關(guān)系

2.3.1癌組織中miR-7-5p表達(dá)水平與患者無(wú)進(jìn)展生存率的關(guān)系 肝癌隨訪期無(wú)進(jìn)展生存率為38.60%(22/57)，miR-7-5p高表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存率為88.89%(8/9)，無(wú)進(jìn)展生存期34.5個(gè)月；miR-7-5p低表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存率為29.17%(14/48),無(wú)進(jìn)展生存期26.7個(gè)月。兩組隨訪期無(wú)進(jìn)展生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.390，P<0.001),見(jiàn)圖2。

圖2 癌組織中miR-7-5p表達(dá)水平與肝癌無(wú)進(jìn)展生存率的關(guān)系

2.3.2癌組織中UbcH10表達(dá)水平與患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率(RFS)的關(guān)系 UbcH10高表達(dá)患者RFS為52.50%(21/40)，無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間28.8個(gè)月；UbcH10低表達(dá)患者RFS為82.35%(14/17),無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間32.8個(gè)月。兩組隨訪期RFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.196，P=0.041),見(jiàn)圖3。

圖3 癌組織中UbcH10表達(dá)水平與肝癌RFS的關(guān)系

3 討 論

全球范圍內(nèi)每年新發(fā)現(xiàn)的肝癌患者人數(shù)約900萬(wàn)，其中尤以中老年人群發(fā)病率最高[8-9]。肝癌的發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制尚未完全明確，多認(rèn)為是一個(gè)由多種基因參與的多節(jié)段的病理過(guò)程，整個(gè)病理過(guò)程涉及多種原癌基因激活及抑癌基因的失活或作用衰減[10]。肝癌患者早期無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，中后期表現(xiàn)為肝區(qū)疼痛、腹脹、消瘦、進(jìn)行性肝組織肥大等，部分患者會(huì)出現(xiàn)低熱、上消化道出血現(xiàn)象，在肝癌組織破裂后會(huì)出現(xiàn)急腹癥，亦有僅表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶的癥狀[11-12]。生物分子標(biāo)志物是腫瘤發(fā)生、增殖過(guò)程中由癌細(xì)胞合成、釋放或宿主對(duì)癌細(xì)胞的反應(yīng)性物質(zhì)，尋找高靈敏度和高特異度的分子標(biāo)志物對(duì)肝癌早期診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估均有重要的意義。

MiR-7的基因序列在人類有3個(gè)不同的基因位點(diǎn)編碼，其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在細(xì)胞和種經(jīng)核酸內(nèi)切酶Ⅲ Drosha剪切變?yōu)榍绑wmiR-7，在經(jīng)Exportin 5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，再次剪切變?yōu)槌墒斓膍iRNA，再形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體以靶向調(diào)節(jié)特定mRNA的基因表達(dá)[13]。近年來(lái)，研究者們對(duì)MiR-7與惡性腫瘤生物學(xué)關(guān)系的研究日益增多，發(fā)現(xiàn)其參與了腫瘤細(xì)胞增殖分化及凋亡等過(guò)程[13-14]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-7能夠經(jīng)靶向激活表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、胰島素受體底物1(IRS1)等參與到直腸癌、乳腺癌的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中。本研究結(jié)果顯示，MiR-7-5p在肝癌組織及癌旁組織中表達(dá)水平有明顯差異，提示其在肝癌中扮演重要角色。肝癌組織中MiR-7-5p表達(dá)顯著下調(diào)，可能是MiR-7-5p可抑制IRS2、EGFR表達(dá)活化抑制癌細(xì)胞遷移、侵襲所致[15-16]。為了進(jìn)一步確認(rèn)PCR的結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)miR-7-5p的表達(dá)水平與分化程度、包膜形成、門靜脈侵犯等特征密切相關(guān)(P<0.05)。而張曉紅等[13]的研究表示，miR-7-5p在結(jié)直腸癌的表達(dá)水平也與腫瘤位置、TNM分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，出現(xiàn)差異的原因可能因?yàn)楸驹囼?yàn)納入樣本較少，miR-7-5p高表達(dá)的數(shù)量較少導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏倚。

UbcH10基因?qū)儆谌朔核嘏悸?lián)酶E2基因家族成員，細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中UbcH10可于APC相互作用影響有絲分裂紡錘體裝配檢測(cè)點(diǎn)，起到驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展[17]。E2在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解活動(dòng)中的職能主要是經(jīng)硫酯鍵連接E1活化酶的泛素和E2活性位點(diǎn)的半胱氨酸，形成Ub-E2中間體，再經(jīng)E3連接酶轉(zhuǎn)移泛素至靶蛋白，靶蛋白經(jīng)泛素化后很容易被26s蛋白酶識(shí)別并快速降解[18]。泛素蛋白酶系統(tǒng)(UP-S)有多重生理調(diào)控能力，一旦系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)失常則會(huì)引發(fā)諸如炎癥反應(yīng)、腫瘤等多種病理性變化[19]。UbcH10作為腫瘤相關(guān)性泛素結(jié)合酶，已被證實(shí)參與到了腦膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌等發(fā)生和進(jìn)展中[7,20]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，UbcH10高表達(dá)會(huì)促使APC/C過(guò)早降解cyclin B等細(xì)胞周期蛋白，增加了細(xì)胞染色體組的不穩(wěn)定性，而該種狀態(tài)與惡性腫瘤的發(fā)生于進(jìn)展生理變化高度吻合[21]。HAN等[20]的試驗(yàn)表明，NSCLC細(xì)胞UbcH10調(diào)節(jié)各種S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAC)成分過(guò)早降解，促使SAC功能障礙加劇，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，在UbcH10表達(dá)質(zhì)粒后癌細(xì)胞增殖及侵襲能力顯著增強(qiáng)，而在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒以沉默UbcH10表達(dá)后，細(xì)胞侵襲力下降，凋亡速率加快，提示UbcH10 參與了惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，UbcH10在肝癌組織及癌旁組織中表達(dá)水平有明顯差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織UbcH10的表達(dá)水平與腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期、門靜脈侵犯相關(guān)(P<0.05)，與以往相關(guān)研究[6,7，20]結(jié)果一致。

肝癌腫瘤最大徑、組織分化程度、TNM分期及門靜脈侵犯等病理特征與腫瘤進(jìn)展速度、惡性程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切，是肝癌患者預(yù)后質(zhì)量的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[22-23]。由此說(shuō)明，miR-7-5p及UbcH10在肝癌組織中的異常表達(dá)與癌灶的惡性生物學(xué)特性相關(guān)聯(lián)，均有其重要的病理學(xué)價(jià)值。通過(guò)Kaplan Meier生存分析顯示，miR-7-5p高表達(dá)及UbcH10低表達(dá)患者隨訪期FRS明顯較高，提示肝癌組織中miR-7-5p高表達(dá)及UbcH10低表達(dá)的患者預(yù)后質(zhì)量更好。原因在于miR-7-5p的高表達(dá)能夠降低IRS2、EGFR基因的活性從而阻斷了癌細(xì)胞分化、增殖及轉(zhuǎn)移的路徑；同理，UbcH10低表達(dá)患者體內(nèi)UP-S不會(huì)被識(shí)別和降解，充分發(fā)揮其多重生理調(diào)控職能，減緩了癌灶的進(jìn)展過(guò)程，改善患者的預(yù)后狀況。

綜上所述，miR-7-5p及UbcH10在肝癌組織中呈異常表達(dá)，兩者均與腫瘤的進(jìn)展速度、惡性程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且對(duì)患者復(fù)發(fā)有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，可以作為肝癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估的潛在分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但是對(duì)于該兩種物質(zhì)的作用途徑、分子機(jī)制還應(yīng)該進(jìn)行深入研究。