一種國(guó)產(chǎn)全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)性能評(píng)價(jià)

李世榮，田月如，王鈺婷，林怡箐，關(guān) 明，蔣浩琴

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040

傳統(tǒng)對(duì)病原菌鑒定的方法需要觀察細(xì)菌在各種培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)、顏色、氣味、是否溶血等，還需借助革蘭染色、氧化酶和觸酶等一系列生化反應(yīng)，不僅操作煩瑣，所需時(shí)間較長(zhǎng)，而且靈敏度和特異度較低，致使臨床治療方案難以及時(shí)制訂而極大地影響了患者的生存率和病死率[1]。近些年發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是一項(xiàng)包括微生物在內(nèi)眾多物質(zhì)的快速鑒定新技術(shù)，除了能對(duì)不同細(xì)菌的種、屬準(zhǔn)確的鑒定外，還具有快速、方便和成本較低的優(yōu)勢(shì)[2]，甚至一度被認(rèn)為是可替代基因測(cè)序的方法[3]。MALDI-TOF MS的原理是將標(biāo)本和基質(zhì)混合涂抹于金屬靶板上，形成的共結(jié)晶薄膜，經(jīng)激光照射后，標(biāo)本分子獲得能量解吸附，基質(zhì)和標(biāo)本之間發(fā)生了電荷的轉(zhuǎn)移,標(biāo)本分子獲得了質(zhì)子并成為離子，后者在電場(chǎng)中飛速運(yùn)動(dòng)、聚焦，并進(jìn)入飛行時(shí)間探測(cè)器。由于離子質(zhì)荷比與飛行時(shí)長(zhǎng)的平方比為常數(shù)，不同質(zhì)荷比的離子具有不同的飛行時(shí)長(zhǎng)，因此可依據(jù)獲得的質(zhì)譜圖與圖譜庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，從而對(duì)不同的物質(zhì)進(jìn)行鑒別[4]。CMI-3800 MS是國(guó)內(nèi)研發(fā)的一款質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)，對(duì)細(xì)菌鑒定性能目前還缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)評(píng)估。本文旨在通過(guò)利用該檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)臨床常見(jiàn)302株非重復(fù)病原菌進(jìn)行鑒定，客觀評(píng)估其對(duì)臨床病原菌鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集本院2021年3-5月來(lái)自臨床不同標(biāo)本(血液、腦脊液、腹腔積液、 尿液、膿液、傷口分泌物和痰等) 分離的常見(jiàn)非重復(fù)菌株共302株，其中革蘭陽(yáng)性菌88株，包括葡萄球菌35株，腸球菌21株，鏈球菌24株，其他8株；革蘭陰性菌157株，包括腸桿菌86株，非發(fā)酵菌45株，其他26株；念珠菌57株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，購(gòu)自上海市臨床檢驗(yàn)中心。

1.2儀器與試劑 CMI-3800 MS及配套試劑、菌種數(shù)據(jù)庫(kù)均購(gòu)自廣州禾信康源醫(yī)療科技有限公司； VITEK 2 Compact鑒定儀；GP革蘭陽(yáng)性菌鑒定卡、GN革蘭陰性菌鑒定卡、YST念珠菌鑒定卡、NH苛氧菌鑒定卡、ANC厭氧菌棒狀桿菌鑒定卡購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；沙保弱培養(yǎng)基和血培養(yǎng)瓊脂平板均購(gòu)自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司； 35 ℃ CO2孵箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；厭氧發(fā)生袋購(gòu)自O(shè)XOID公司。

1.3方法

1.3.1病原菌培養(yǎng) 將收集的菌株從-70 ℃低溫冰箱中取出，用1 μL一次性接種環(huán)以四區(qū)劃線的方式接種于血瓊脂平板。革蘭陽(yáng)性或陰性需氧菌和兼性厭氧菌、念珠菌采用35 ℃ CO2孵箱培養(yǎng)18～24 h，難以生長(zhǎng)的細(xì)菌可延遲至2～3 d；厭氧菌放入?yún)捬醢l(fā)生袋中密封后放入35 ℃ CO2孵箱培養(yǎng)中培養(yǎng)2～3 d，得到菌落后，為保證菌落必須為純菌落，再純分一次，以相同條件培養(yǎng)。

1.3.2VITEK 2 Compac鑒定儀鑒定 根據(jù)純菌落形態(tài)、革蘭染色結(jié)果以及簡(jiǎn)單的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇相對(duì)應(yīng)的細(xì)菌鑒定卡上機(jī)鑒定。革蘭陽(yáng)性需氧菌采用GP細(xì)菌鑒定卡、革蘭陰性需氧菌采用GN細(xì)菌鑒定卡、念珠菌采用YST細(xì)菌鑒定卡、奈瑟菌等苛氧菌采用NH細(xì)菌鑒定卡、厭氧菌和棒狀桿菌采用ANC細(xì)菌鑒定卡。使用前將卡片和0.45%氯化鈉(NaCl)溶液從4 ℃冰箱取出，放室溫15～20 min，充分復(fù)溫。每根試管中加入3 mL 0.45% NaCl溶液配制菌懸液，并用比濁儀測(cè)定菌液濃度。將革蘭陽(yáng)性或陰性需氧菌配制成0.50～0.63 McF的菌懸液濃度，念珠菌配制成1.8～2.2 McF的菌懸液濃度，奈瑟菌等苛氧菌、厭氧菌、棒狀桿菌配制成2.7～3.3 McF的菌懸液濃度。將配制好的菌懸液依次放在載卡架上，按照操作說(shuō)明完成上機(jī)鑒定。

1.3.3CMI-3800 MS鑒定 35 ℃ CO2孵箱培養(yǎng)18～24 h得到純菌落后，用1 μL一次性接種環(huán)將校準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922均勻涂在靶板的校準(zhǔn)點(diǎn)位上，將待測(cè)純菌落均勻涂在測(cè)試點(diǎn)位上，涂菌后添加1 μL甲酸溶液(FA)，干燥后加1 μL α-腈基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質(zhì)液，再次干燥后將樣品靶放入靶板槽中蓋好換樣蓋板，進(jìn)靶，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本和盲樣，開(kāi)始鑒定。病原菌的納入標(biāo)準(zhǔn)： CMI-3800 MS鑒定到種的得分>8.00分，鑒定屬的得分>6.00分；VITEK 2 Compact鑒定置信度≥89.00%。

1.3.4鑒定結(jié)果不一致標(biāo)本處理 對(duì)于兩種方法鑒定不一致的菌株，重新接種平板復(fù)測(cè)確認(rèn)，確認(rèn)不一致的菌株送上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行16SrDNA測(cè)序。擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 500 bp，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S的全長(zhǎng)序列。細(xì)菌16S PCR的引物為：27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG；1492R：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T。測(cè)序完成后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里比對(duì)，得到菌株的最終鑒定結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact對(duì)286株菌的鑒定 對(duì)302例菌株標(biāo)本進(jìn)行分析，CMI-3800 MS鑒定到屬水平有297株，占98.34%，鑒定到種水平有288株，占95.36%；VITEK 2 Compact鑒定到屬水平有296株，占98.01%，鑒定到種水平有277株，占91.72%。兩種儀器檢測(cè)到屬水平一致的為296株，占98.01%，種水平一致的為277株，占91.72%； 6株鑒定結(jié)果屬不一致，占1.99%，25株鑒定結(jié)果種不一致，占8.28%。

2.2CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性菌的鑒定 表1與表2分別為革蘭陽(yáng)性菌與革蘭陰性菌的詳情。如表1所示，在88株革蘭陽(yáng)性菌中，CMI-3800 MS鑒定到屬的為88株(100.00%)，鑒定到種的為84株(95.45%)。

表1 革蘭陽(yáng)性菌株(n=88)

表2 革蘭陰性菌株(n=157)

VITEK 2 Compact鑒定到屬的為86株(97.73%)，鑒定到種的為79株(89.77%)。兩種方法在屬水平一致性為97.73%，在種水平一致性為89.77%。

在157株革蘭陰性菌中，CMI-3800 MS鑒定到屬的為154株(98.09%)，鑒定到種的為148株(94.27%)；VITEK 2 Compact鑒定到屬的為153株(97.45%)，鑒定到種的為142株(90.45%)。兩種方法在屬水平上一致性為96.82%，在種水平上一致性為90.45%。見(jiàn)表3。

表3 CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性菌株的鑒定(%)

2.3念珠菌鑒定結(jié)果 57株念珠菌，CMI-3800 MS可將57 株(100.00%)鑒定到屬，57株(100.00%)鑒定到種；VITEK 2 Compact可將57株(100.00%)鑒定到屬，56株(98.25%)鑒定到種，兩種方法在種的一致性為98.25%，在屬的一致性為100.00%。見(jiàn)表4。

表4 念珠菌菌株明細(xì)(n=57)

2.416SrDNA 基因測(cè)序 25株種不一致的標(biāo)本中(其中包括屬不一致6株)，有7株細(xì)菌蛋白質(zhì)指紋圖譜相似，屬于質(zhì)譜方法學(xué)難以區(qū)分菌株，故對(duì)其余18株屬或種不一致的菌株進(jìn)行16SrDNA 基因測(cè)序鑒定。18株標(biāo)本的16SrDNA 基因測(cè)序鑒定結(jié)果中有12例標(biāo)本與CMI-3800 MS鑒定的種水平完全一致，4株樣本屬水平一致，其余2例種屬均不一致； 16SrDNA 基因測(cè)序鑒定結(jié)果與VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果相比較，13株屬一致，4株種屬均不一致，有1例VITEK 2 Compact鑒定儀未鑒定出來(lái)，見(jiàn)表5、6。

表5 7株質(zhì)譜方法學(xué)難以區(qū)分菌株

表6 18株菌3種方法鑒定結(jié)果比較

3 討 論

MALDI-TOF MS技術(shù)已被證實(shí)在耐藥性分析和感染控制方面具有廣闊的應(yīng)用前景[5]，不僅可實(shí)現(xiàn)快速的耐藥分析，而且可精確地對(duì)傳染疾病的病原菌進(jìn)行診斷[6]。最近周淑燕等[7]用法國(guó)生物梅里埃MALDI-TOF-MS和VITEK 2 Compact對(duì)300 株臨床分離的病原菌進(jìn)行了鑒定，法國(guó)生物梅里埃MALDI-TOF-MS鑒定到種水平的菌株有268 株(89.33%)，屬水平的菌株有297 株(99.00%)；VITEK 2 Compact鑒定到種水平有266 株(88.67%)； 屬水平的菌株有297 株(99.00%)。本研究用CMI-3800 MS與VITEK 2 Compact對(duì)302株菌株進(jìn)行了分析，CMI-3800 MS鑒定到屬水平有297株(98.34%)，鑒定到種水平有288株(95.36%)；VITEK 2 Compact鑒定到屬水平有296株(98.01%)，鑒定到種水平有277株(91.72%)。比較MALDI-TOF MS系統(tǒng)檢測(cè)能力，CMI-3800 MS檢測(cè)屬水平(98.34%)與法國(guó)生物梅里埃MALDI-TOF MS(99.00%)相仿，但前者檢測(cè)種水平(95.36%)明顯高于后者(88.67%)。另外，周淑燕等[7]用兩種方法鑒定的種屬一致性分別為82.67%與98.33%。由此可見(jiàn)，CMI-3800 MS對(duì)細(xì)菌檢測(cè)能力和梅里埃MALDI-TOF-MS相當(dāng)。另外，本研究?jī)煞N方法檢測(cè)種不一致的25株(其中包括屬不一致6株)中，由于有7株細(xì)菌的蛋白質(zhì)指紋圖譜十分相似而難以用質(zhì)譜方法學(xué)區(qū)分，為此本文用16SrDNA 基因測(cè)序?qū)?8株屬或種不一致的菌株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，16SrDNA 基因測(cè)序確認(rèn)與CMI-3800 MS鑒定種、屬水平一致的分別為12株(66.67%)和16株(88.89%)； 16SrDNA 基因測(cè)序與VITEK 2 Compact鑒定細(xì)菌為屬一致的有13株(72.22%)，4株種、屬均不一致，有1例菌株為惰性乳桿菌，其生長(zhǎng)速度緩慢，故VITEK 2 Compact未能鑒定出結(jié)果。顯然，對(duì)少見(jiàn)菌鑒定的成功率和準(zhǔn)確程度，CMI-3800 MS無(wú)疑比VITEK 2 Compact更勝一籌，更符合臨床對(duì)菌株樣本檢測(cè)的需求。

革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌為臨床常見(jiàn)的細(xì)菌。王冰等[8]用Biotyper MS和 Vitek-MS對(duì)63株革蘭陽(yáng)性菌和83株革蘭陰性菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示兩種MS系統(tǒng)對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的種屬鑒定率均達(dá)95.00%，表明MALDI-TOF MS質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)可對(duì)它們的種屬進(jìn)行有效的鑒定。在本研究收集的302株菌株中，81.13%(245/302)的菌株為革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌。CMI-3800 MS對(duì)革蘭陽(yáng)性菌種屬的鑒定率分別為95.45%(84/88)和100.00%(88/88)，對(duì)革蘭陰性菌種屬的鑒定率分別為94.27%(148/157)和98.09%(154/157)；VITEK 2 Compact對(duì)革蘭陽(yáng)性菌種屬的鑒定率分別為89.77%(79/88)和97.73%(86/88)，對(duì)革蘭陰性菌種屬的鑒定率分別為90.45%(142/157)和97.45%(153/157)。顯然CMI-3800 MS對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌鑒定種的能力均高于VITEK 2 Compact。 然而，CMI-3800 MS對(duì)革蘭陰性菌中包括大腸埃希菌與志賀菌屬、沙門(mén)菌群、陰溝桿菌復(fù)合群、不動(dòng)桿菌復(fù)合群等未能很好鑒定，除了可能與這些革蘭陰性細(xì)菌蛋白質(zhì)指紋圖譜相似而難以區(qū)分外，亦與MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏某些菌屬如志賀菌屬[9]的數(shù)據(jù)有關(guān)，因此,在對(duì)沙門(mén)志賀菌進(jìn)行鑒定時(shí)，一定要輔以血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果作為最終的鑒定結(jié)果[10]。此外，在本研究中有1株人金黃桿菌和1株金色金色微菌也未能被CMI-3800 MS檢測(cè)系統(tǒng)鑒定，其原因可能是數(shù)據(jù)庫(kù)里菌株數(shù)量過(guò)少而無(wú)法達(dá)到質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的要求，或是細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)里未儲(chǔ)存該菌種。

分析CMI-3800 MS對(duì)革蘭陽(yáng)性菌中不同菌屬的鑒定能力，對(duì)腸球菌屬和葡萄球菌屬的種屬鑒定率均為100.00%，對(duì)鏈球菌的種屬鑒定率則分別為83.33%(20/24)和100.00%(24/24)，表明CMI-3800 MS對(duì)鏈球菌種的鑒定能力相對(duì)較弱，這與木尼熱·馬合蘇提等[11]用VITEK-MS對(duì)鏈球菌種的鑒定率(84.80%)十分接近，該文作者認(rèn)為MS對(duì)鏈球菌種的鑒定率之所以比較低的原因可能是與鏈球菌之間的親緣關(guān)系比較相近或蛋白指紋圖譜峰的特征不明顯有關(guān)，陸丹等[12]建議，在鏈球菌的鑒定中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況結(jié)合其他輔助方法做出正確判斷，如進(jìn)行奧普托欣敏感試驗(yàn)。

王琦琦等[13]研究表明，MALDI-TOF MS可準(zhǔn)確鑒定98.30%的念珠菌，對(duì)常見(jiàn)念珠菌鑒定的準(zhǔn)確率為100.00%，而對(duì)少見(jiàn)念珠菌的鑒定準(zhǔn)確率為95.70%。本研究CMI-3800 MS對(duì)57株念珠菌種屬鑒定率均為100.00%；而VITEK 2 Compact對(duì)它們屬的鑒定率為100.00%(57株)，種的鑒定率為98.25%(56株)。盡管耳念珠菌與希木龍念珠菌有較近的親緣關(guān)系[13]，但研究表明MALDI-TOF MS仍能夠準(zhǔn)確地區(qū)分這兩種念珠菌[14-16]，并且MURO等[17]研究還認(rèn)為，MALDI-TOF MS對(duì)希木龍念珠菌的鑒定比VITEK 2 Compact鑒定儀更為精準(zhǔn)。在本研究中VITEK 2 Compact鑒定儀就是將1株希木龍念珠菌鑒定為耳念珠菌，而CMI-3800 MS則準(zhǔn)確地把這1株念珠菌區(qū)分了出來(lái)。

綜上所述，CMI-3800 MS具有對(duì)臨床菌株檢測(cè)準(zhǔn)確率高、通量大、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單和菌種數(shù)據(jù)庫(kù)完善等優(yōu)勢(shì)，鑒定每株細(xì)菌的耗材成本較低，每日可鑒定微生物高達(dá)3 500株，可以滿足臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)微生物鑒定的需求。