基于外泌體中基因序列構(gòu)建miRNA-mRNA預(yù)測(cè)復(fù)治肺結(jié)核特異的關(guān)鍵基因

徐振華，李奇鳳，王 泉

1.北京兒童醫(yī)院新疆醫(yī)院/新疆維吾爾自治區(qū)兒童醫(yī)院/新疆兒科研究所，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊 830049

外泌體是從體內(nèi)細(xì)胞釋放的直徑為40～160 nm源于內(nèi)吞體的囊泡，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA及非編碼RNA和DNA等。外泌體可以將其內(nèi)含物(尤其是miRNA)釋放到鄰近和遠(yuǎn)端細(xì)胞中，參與體內(nèi)很多生物反應(yīng)，如細(xì)胞與細(xì)胞之間信號(hào)通信，基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控，免疫反應(yīng)平衡和中樞、外周免疫調(diào)節(jié)，受體配體信號(hào)，細(xì)胞分化和腫瘤，宿主-微生物群的相互作用和病毒免疫等。然而，本文通過對(duì)初治肺結(jié)核(ATB)和復(fù)治肺結(jié)核(RTB)外泌體進(jìn)行富集提取、建庫測(cè)序和生物信息分析來預(yù)測(cè)相關(guān)靶向調(diào)控，借助生物信息學(xué)構(gòu)建miRNA-mRNA的關(guān)系，在分子水平上把控復(fù)治肺結(jié)核特異表達(dá)的關(guān)鍵基因，為新的藥物研發(fā)提供思路和理論支撐。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集ATB和RTB患者和健康對(duì)照者(HC)的新鮮外周血，離心后取血漿，行血漿外泌體檢測(cè)、建庫、測(cè)序，每份標(biāo)本形成相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。根據(jù)所建外周血外泌體數(shù)據(jù)庫獲取相應(yīng)的差異表達(dá)miRNA和mRNA。使用R語言“edgeR”包對(duì)所建肺結(jié)核外泌體數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，以|log2FC|≥2，F(xiàn)DR<0.05為條件篩選差異miRNA，調(diào)用enhancedvolcano R包繪圖，使用DESeq2進(jìn)行差異表達(dá)分析。

1.2外泌體RTB特異性差異表達(dá)miRNA和mRNA篩選 miRNA差異表達(dá)的數(shù)據(jù)輸入為miRNA表達(dá)水平分析中得到的readcount數(shù)據(jù)。對(duì)于有生物學(xué)重復(fù)的樣品，采用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2進(jìn)行分析；對(duì)于無生物學(xué)重復(fù)的樣品，DEGseq會(huì)采用TMM算法對(duì)readcount數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后進(jìn)行差異分析，篩選RTB特異性差異表達(dá)miRNA和mRNA，用韋恩圖來表示。

1.3差異表達(dá) miRNA下游靶基因的預(yù)測(cè) 通過miRNet數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA在RTB特異性下游靶基因。

1.4功能富集分析和蛋白-蛋白相互作用(PPI) 網(wǎng)絡(luò) 使用可視化軟件Cytoscape繪制miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。利用在線網(wǎng)站 STRING 11.0(https:// string-db.org/)構(gòu)建靶基因之間相互作用，并使用Cytoscape核心插件cytohubba篩選Degree數(shù)最高的前20個(gè)靶基因進(jìn)行后續(xù)分析。

2 結(jié) 果

2.1從外泌體所建數(shù)據(jù)庫中篩選出ATB和RTB差異表達(dá)miRNA共1 408個(gè)基因(如圖1A)。

2.2ATB和RTB差異表達(dá) miRNA的韋恩圖 ATB和RTB差異表達(dá)miRNA的以log10值進(jìn)行聚類，ATB的差異表達(dá)miRNA和RTB的差異表達(dá)miRNA取交集得到19個(gè)共表達(dá)差異表達(dá)miRNA，ATB中有92個(gè)獨(dú)立差異表達(dá)miRNA，RTB中有11個(gè)獨(dú)立差異表達(dá)miRNA(圖1B)。

2.3RTB特異的差異表達(dá)miRNA下游靶基因預(yù)測(cè) 通過miTarbare和miRanda數(shù)據(jù)庫共篩選出RTB特異的差異表達(dá)miRNA下游靶基因預(yù)測(cè)為375個(gè)(圖1C)。

2.4RTB特異的差異表達(dá)miRNA下游靶基因進(jìn)行功能富集分析(GO)和信號(hào)通路富集分析(KEGG) 為了明確篩選出RTB特異的差異表達(dá)miRNA下游靶基因的生物學(xué)作用，使用GOSeq、topGO、hmmscan軟件對(duì) 375個(gè)RTB特異的差異表達(dá)miRNA下游靶基因進(jìn)行GO和KEGG途徑富集分析。在 GO 功能注釋中，由于基因較多對(duì)GO中前10位基因進(jìn)行功能注釋，生物過程分析揭示目標(biāo)基因在三酰甘油生物合成和代謝過程中的正調(diào)控、腸道膽固醇吸收、膜組織等較多富集；分子功能分析目標(biāo)基因在RNA聚合酶Ⅲ復(fù)合物、U2型催化步驟1剪接體、PRC1復(fù)合物、在線粒體外層的整體膜蛋白等富集；細(xì)胞成分分析表明目標(biāo)基因明顯富集于雙鏈端粒DNA結(jié)合蛋白、蛋白酶結(jié)合、小GTP酶結(jié)合蛋白、端粒DNA結(jié)合蛋白等富集(圖1D)。KEGG 途徑富集分析結(jié)果顯示：目標(biāo)基因在mRNA監(jiān)測(cè)通路、單純皰疹病毒1型感染、非同源端連接、色氨酸代謝、脂肪消化和吸收等富集(圖1E)。

圖1 RTB特異的差異表達(dá)miRNA獲得及下游靶基因的富集過程注：A為ATB和RTB所篩選差異表達(dá)miRNA的火山圖；B為ATB和RTB差異表達(dá)miRNA的韋恩圖；C為RTB特異的差異表達(dá)miRNA下游靶基因預(yù)測(cè)；D為RTB特異的差異表達(dá)miRNA下游靶基因GO富集柱狀圖；E為RTB特異的差異表達(dá)miRNA下游靶基因KEGG富集散點(diǎn)圖。

2.5從外泌體所建數(shù)據(jù)庫中篩選出ATB和RTB差異表達(dá)mRNA共4 432個(gè)基因(圖 2A)。

2.6ATB和RTB差異表達(dá)mRNA的韋恩圖 ATB和RTB差異表達(dá)mRNA的以log10值進(jìn)行聚類；ATB的差異表達(dá)miRNA和RTB的差異表達(dá)mRNA取交集得到94個(gè)共表達(dá)差異表達(dá)mRNA，ATB中有201個(gè)獨(dú)立差異表達(dá)mRNA，RTB中有308個(gè)獨(dú)立差異表達(dá)mRNA(圖2B)。

2.7RTB特異的差異基因mRNA的功能富集分析和信號(hào)通路富集分析 為了明確篩選出目標(biāo)基因的生物學(xué)作用，使用GOSeq、topGO、hmmscan軟件對(duì) 308個(gè)RTB特異的差異表達(dá)mRNA靶基因進(jìn)行 GO功能注釋和 KEGG 途徑富集分析。在 GO 功能注釋中，由于基因較多對(duì)GO中前10位基因進(jìn)行功能注釋，生物過程分析揭示目標(biāo)基因在蛋白質(zhì)去磷酸化的負(fù)調(diào)控、對(duì)線粒體上蛋白質(zhì)定位建立的正調(diào)控、中性粒細(xì)胞脫顆粒、中性粒細(xì)胞的激活涉及免疫應(yīng)答等富集；分子功能分析目標(biāo)基因在細(xì)胞核、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞-底物連接、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等富集；細(xì)胞成分分析表明目標(biāo)基因明顯富集于RNA結(jié)合蛋白、單鏈端粒DNA結(jié)合蛋白、核苷—三磷酸酶活性、激酶結(jié)合等(圖2C)。KEGG 途徑富集分析結(jié)果顯示：目標(biāo)基因在人類T細(xì)胞白血病病毒1型感染、細(xì)胞衰老、血小板活化、神經(jīng)變性通路肌萎縮性側(cè)索硬化癥等富集(圖2D)。

2.8RTB特異的差異表達(dá)miRNA的靶基因韋恩圖 對(duì)RTB特異的差異表達(dá)mRNA與RTB特異的差異表達(dá) miRNA 預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行綜合分析后取交集，共有8個(gè)靶向目標(biāo)基因(圖2E)。

2.9PPI網(wǎng)絡(luò)的建立與分析 將所有目標(biāo)基因?qū)?String 數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建目標(biāo)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，再將數(shù)據(jù)輸入到BLAST軟件建立一個(gè)更直觀的 PPI 網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅贸銮?0個(gè)關(guān)鍵基因，包括高表達(dá)RTB特異的差異表達(dá)基因 miRNA 的靶基因：PABPC1、EEF1A1、VCP、HNRNPA1；低表達(dá)RTB特異的差異表達(dá)基因 miRNA 的靶基因：DDX17、MAPK14、FLNA、TPT1、POLR2E(圖2F)。

圖2 RTB特異差異表達(dá)mRNA獲得及富集和目標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)注：A為ATB和RTB差異表達(dá)mRNA加強(qiáng)火山圖；B為ATB和RTB差異表達(dá)mRNA的韋恩圖；C為RTB特異的差異蛋白基因mRNA的GO富集圖；D為RTB特異的差異基因mRNA的KEGG富集圖；E為RTB特異的差異表達(dá)imRNA的靶基因韋恩圖；F為RTB特異的PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3 討 論

RTB指既往不規(guī)律抗結(jié)核治療≥1個(gè)月以及初治失敗和復(fù)發(fā)的肺結(jié)核患者[1]，是耐藥肺結(jié)核傳播的重要來源。尋找RTB的病因、發(fā)病機(jī)制對(duì)解決耐藥肺結(jié)核顯得尤為重要，同時(shí)也為治療RTB提供新型的方案。本研究中通過構(gòu)建外泌體基因序列中miRNA-mRNA的關(guān)系揭示RTB在分子水平上調(diào)控機(jī)制。

在耐藥情況、影像學(xué)改變和免疫功能檢查等方面，RTB和ATB患者有不同程度的區(qū)別。有研究報(bào)道，與ATB相比，RTB患者對(duì)利福平耐藥率更高[2]。曹盼等[3]報(bào)道，利福平耐藥RTB比ATB患者空洞數(shù)量多、最大內(nèi)徑大。同時(shí)，空洞壁鈣化、肺實(shí)變、毀損肺等CT表現(xiàn)也比初治患者嚴(yán)重。ATB和RTB患者體內(nèi)存在不同程度的淋巴細(xì)胞亞群改變[4]，其中T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞比例與肺結(jié)核患者所處不同感染階段有一定的關(guān)聯(lián)性。RTB和ATB不僅在以上情況有不同，而且在基因表達(dá)數(shù)量上不一樣。本研究通過ATB和RTB差異表達(dá)miRNA的聚類分析顯示RTB中有11個(gè)獨(dú)立差異表達(dá)miRNA，ATB中有92個(gè)獨(dú)立差異表達(dá)miRNA。進(jìn)一步預(yù)測(cè)RTB特異性差異表達(dá)miRNA下游靶基因有375個(gè)，并對(duì)此基因進(jìn)行GO和KEGG，富集分析揭示目標(biāo)基因在三酰甘油生物合成、代謝過程中的正調(diào)控、腸道膽固醇吸收等脂質(zhì)代謝改變；RNA聚合酶Ⅲ復(fù)合物、U2型催化步驟1剪接體、小GTP酶結(jié)合蛋白、端粒DNA結(jié)合蛋白、在線粒體外層的整體膜蛋白等參與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯方面調(diào)節(jié)。有研究結(jié)果顯示，在Mtb休眠和重新激活期間，參與不同階段能量代謝的蛋白質(zhì)相對(duì)數(shù)量是不同的，例如不同的酸度、滲透壓和營(yíng)養(yǎng)缺乏等微環(huán)境[5]。結(jié)核分枝桿菌為能夠在復(fù)治和初治狀態(tài)之間切換，通過改變其代謝網(wǎng)絡(luò)的路線，以響應(yīng)不同的感染階段。結(jié)核分枝桿菌為了其生存和在限制條件下的宿主體內(nèi)保持持久性必然要表現(xiàn)出代謝功能的多面性。作為異養(yǎng)生物，Mtb能夠代謝多種碳源，這些碳源可由細(xì)菌合成或從宿主細(xì)胞獲得[6-8]。

本研究對(duì)RTB特異性差異表達(dá)miRNA下游靶基因預(yù)測(cè)并進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示在脂質(zhì)代謝和基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等方面進(jìn)行調(diào)控，說明RTB患者通過在能量代謝和基因表達(dá)等方面做出改變迎合所處環(huán)境。對(duì)目標(biāo)基因mRNA的富集分析提示目標(biāo)基因mRNA和差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)的下游基因的富集分析互相適用、相互補(bǔ)充功能調(diào)控RTB發(fā)生和發(fā)展，這為以后研發(fā)治療RTB新型的抗結(jié)核藥物提供了靶點(diǎn)。

在本研究構(gòu)建的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型中，得到9個(gè)顯著高低表達(dá)靶基因，可能在RTB中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。PABPC1參與mRNA翻譯[9-10]，高腺苷酸化[11]，無義介導(dǎo)的衰變[12]和替代多腺苷酸化[13]等多種體內(nèi)調(diào)節(jié)。有研究報(bào)道PABPC1將hnRNPLL招募到RNA的3′末端，并通過mRNA替代多腺苷酸化調(diào)節(jié)并調(diào)節(jié)漿細(xì)胞中從mIg到sIg的轉(zhuǎn)變，證實(shí)漿細(xì)胞特異性RBP和普遍表達(dá)的RBP(PABPC1)之間的相互作用共同調(diào)節(jié)B細(xì)胞中免疫球蛋白分泌，其高表達(dá)可增強(qiáng)RTB中免疫球蛋白對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷[14]。真核翻譯伸長(zhǎng)因子-1α1(eEF1A1)負(fù)責(zé)核糖體蛋白合成[15]，與伴侶介導(dǎo)的自噬[16]和細(xì)胞凋亡[17]有關(guān)，eEF1A1與PARP1和TXK形成復(fù)合物可作為Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合IFN-γ的啟動(dòng)子以直接調(diào)節(jié)IFN-γ轉(zhuǎn)錄，因此其與Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生密切相關(guān)[18]。有研究提出eEF1A1與FadD13結(jié)合對(duì)于巨噬細(xì)胞中的Mtb增殖和在Mtb感染期間促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用[19]，敲低eEF1A1可消除由FadD13誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子。DDX17是一種RNA依賴性ATP酶，與病毒感染和免疫應(yīng)答密切相關(guān)[20-22]。而本研究顯示DDX17在RTB低表達(dá)，其參與RTB發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控。眾所周知，MAPK包括MAPK1-MAPK3、JNK和p38 MAPK，均與自噬調(diào)節(jié)有關(guān)。MAPK14直接磷酸化蘇氨酸75的ATG5激活導(dǎo)致自噬體-溶酶體融合損傷，從而損害了自噬[23]。這和本研究相符，通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析MAPK14在RTB中低表達(dá)，從而有利于自噬參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，發(fā)育和免疫等代謝機(jī)制，促進(jìn)RTB的發(fā)生、發(fā)展。更有研究進(jìn)一步證實(shí)，氧化應(yīng)激在自噬抑制后介導(dǎo)MAPK14信號(hào)傳導(dǎo)和DNA損傷標(biāo)志物方面可能起作用[24]。

綜上所述，通過外泌體構(gòu)建miRNA-mRNA預(yù)測(cè)RTB特異性關(guān)鍵基因，這為今后探尋RTB分子機(jī)制、研發(fā)新型基因藥物提供靶點(diǎn)和思路，但本研究不足之處在于沒有驗(yàn)證關(guān)鍵基因在RTB組織中的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)該基因是否存在組織中，下一步研究完善相關(guān)驗(yàn)證。