肝性腦病患者外周血Th17/Treg平衡變化及其與預(yù)后的關(guān)系

楊君寅 計鈺亮 朱婷婷

肝性腦?。℉E）是由于肝炎相關(guān)肝硬化引起機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂，從而導(dǎo)致的神經(jīng)失調(diào)綜合征[1-2]。有研究報道，全球每年有50～120萬人死于肝硬化及其并發(fā)癥，其中并發(fā)HE的患者有30%～45%，其3年生存率低于25%，嚴(yán)重影響人們的生命安全[3-4]。既往研究表明，HE的發(fā)病機(jī)制主要是氨基酸比例失衡、血氨升高等，近年來有學(xué)者指出免疫功能和炎性反應(yīng)在HE的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[5-6]。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞屬于CD4＋T細(xì)胞亞群，其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答在多種肝臟疾病的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[7-8]。目前機(jī)體內(nèi)Th17/Treg平衡變化在HE進(jìn)展過程中的作用尚未明確。本文探究了HE患者外周血Th17/Treg平衡變化及其與預(yù)后的關(guān)系，以期為HE的臨床診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年2月至2020年2月中國人民武裝警察部隊海警總隊醫(yī)院收治的50例HE患者作為研究對象，參照West-Haven分級標(biāo)準(zhǔn)將患者分為HE 0～Ⅱ級組（n＝25）和HE Ⅲ～Ⅳ級組（n＝25）；另選擇同期在該院就診的25例慢性肝病患者（設(shè)為慢性肝病組），以及在該院體檢的25名健康者（設(shè)為健康對照組）納入研究。HE 0～Ⅱ級組中，男13例，女12例；年齡39～78歲，平均年齡為（56.96±8.75）歲。HE Ⅲ～Ⅳ級組中，男15例，女10例；年齡38～76歲，平均年齡為（56.47±8.69）歲。慢性肝病組中，男11例，女14例；年齡40～79歲，平均年齡為（57.10±8.81）歲。健康對照組中，男12例，女13例；年齡37～79歲，平均年齡為（56.81±8.72）歲。4組的上述基本資料相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號 202021）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國肝性腦病診治共識意見（2013年，重慶）》[9]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）經(jīng)彩超或CT檢查確診為肝硬化合并HE；（3）慢性肝病組患者的病程均超過6個月且無肝硬化及HE；（4）健康對照組的體檢結(jié)果均顯示無心、肺、腎等重要臟器疾病，無慢性肝病史；（5）簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肝癌或其他惡性腫瘤；（2）嚴(yán)重的心、肺、腎等重要臟器功能障礙；（3）中毒性腦病或代謝性腦?。唬?）腦血管疾病、顱腦損傷或感染；（5）癲癇、精神分裂癥等所致精神行為異常，無法配合檢查、治療；（6）合并自身免疫病或嚴(yán)重過敏性疾病。

1.3 方法

（1）外周血Th17/Treg比值測定。所有受試者在入院或體檢時采集3 mL空腹靜脈血，經(jīng)肝素抗凝后，采用Ficoll密度梯度離心法提取外周血單個核細(xì)胞（PBMC），然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC中Th17細(xì)胞、CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞表達(dá)水平；取300 μL抗凝血加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)基中，并接種于培養(yǎng)板，同時加入20 μL佛波酯（1 μg/mL）＋18 μL 離 子 霉 素（40 μg/mL）＋20 μL莫 能 霉 素（0.1 mg/mL），在培養(yǎng)箱中孵育6 h；取100 μL上述培養(yǎng)液，加入10 μL抗人CD4和CD25單克隆抗體，震蕩混勻，室溫避光條件下孵育20 min，加入100 μL細(xì)胞固定液；再次于室溫避光條件下孵育20 min，以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，加入100 μL破膜液，并加入10 μL抗IL-17單克隆抗體和10 μL抗Foxp3抗體，使用流式細(xì)胞儀（購自北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司，型號DxFLEX）檢測全血中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞占比，并計算Th17/Treg比值。（2）血清IL-17、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）表達(dá)水平檢測。所有受試者在入院或體檢時采集3 mL空腹靜脈血，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，分離得到血清，采用ELISA法檢測IL-17、IL-10和TGF-β的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作（試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。（3）血清ALT、AST和血氨水平檢測。采用恩普A8020型全自動生物化學(xué)分析儀（購自上海聚慕醫(yī)療科技有限公司）檢測血清ALT、AST和血氨水平。（4）一般資料收集。收集受試者的性別、年齡、BMI、肝功能分級、HE分級、藥物使用情況（乳果糖、拉克替醇、利福昔明-α晶型、門冬氨酸鳥氨酸和益生菌）等信息。肝功能分級采用Child-Pugh分級評估，內(nèi)容包括一般狀況、血清膽紅素、腹水、血清白蛋白和凝血酶原時間，總分5～6分為A級，7～9分為B級，10～15分為C級。（5）HE的治療方案。給予HE患者去除誘因、降低血氨水平、護(hù)肝等治療方案，治療時間為1周。（6）預(yù)后評估標(biāo)準(zhǔn)。HE患者治療1周后若精神意識恢復(fù)，神經(jīng)癥狀減輕或消失，生命體征平穩(wěn)，判斷為預(yù)后良好；若精神意識不清，神經(jīng)癥狀未見好轉(zhuǎn)，生命體征不穩(wěn)定，甚至死亡，判斷為預(yù)后不良。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗。采用多因素logistic回歸法分析預(yù)后的影響因素，采用ROC曲線評估外周血Th17/Treg比值判斷HE患者預(yù)后的效能。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組外周血Th17/Treg比值及炎性因子水平比較

HE Ⅲ～Ⅳ級組、HE 0～Ⅱ級組和慢性肝病組的Th17/Treg比值、IL-17表達(dá)水平均高于健康對照組，HE Ⅲ～Ⅳ級組和HE 0～Ⅱ級組的Th17/Treg比值、IL-17表達(dá)水平均高于慢性肝病組，HE Ⅲ～Ⅳ級組的Th17/Treg比值、IL-17表達(dá)水平均高于HE 0～Ⅱ級組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。HE Ⅲ～Ⅳ級組、HE 0～Ⅱ級組和慢性肝病組的IL-10、TGF-β表達(dá)水平均低于健康對照組，HE Ⅲ～Ⅳ級組和HE 0～Ⅱ級組的IL-10、TGF-β表達(dá)水平均低于慢性肝病組，HE Ⅲ～Ⅳ級組的IL-10、TGF-β表達(dá)水平均低于HE 0～Ⅱ級組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 4組的外周血Th17/Treg比值及炎性因子水平比較

2.2 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的一般資料及外周血Th17/Treg比值的比較

50例HE患者治療1周后有14例預(yù)后不良，36例預(yù)后良好。預(yù)后不良組與預(yù)后良好組患者的性別、年齡、BMI、藥物使用情況的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組中肝功能Child-Pugh C級占比、HE Ⅲ～Ⅳ級占比、Th17/Treg比值，以及ALT、AST、血氨、IL-17的表達(dá)水平均較高，而IL-10、TGF-β的表達(dá)水平均較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的一般資料及外周血Th17/Treg比值的比較

2.3 影響HE患者預(yù)后的相關(guān)因素分析

將可能與HE患者預(yù)后有關(guān)的因素（納入標(biāo)準(zhǔn)P＜0.05），包括肝功能分級、HE分級、ALT、AST、血氨、Th17/Treg比值、IL-17、IL-10、TGF-β作為自變量，將患者預(yù)后情況作為因變量（賦值情況見表3），納入多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示肝功能分級、HE分級、AST、血氨、Th17/Treg比值、IL-17為HE患者預(yù)后不良的危險因素，而TGF-β為預(yù)后不良的保護(hù)因素（P＜0.05）。見表4。

表3 變量與賦值

表4 影響HE患者預(yù)后的多因素logistic回歸分析

2.4 外周血Th17/Treg比值與患者預(yù)后的關(guān)系

ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血Th17/Treg比值判斷患者預(yù)后的最佳截斷值為1.76，敏感度為92.86%，特異度為91.67%，AUC為0.958，95%CI為0.860～0.995。見圖1。

圖1 外周血Th17/Treg比值判斷HE患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

HE是由嚴(yán)重肝病引起的、以代謝紊亂為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)失調(diào)綜合征，臨床表現(xiàn)為智力減退、行為失常，預(yù)后較差且病死率較高，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[10]。近年來有學(xué)者指出，免疫失衡和炎性反應(yīng)會促進(jìn)神經(jīng)毒物的產(chǎn)生，并提高腦組織對毒物的敏感度，從而影響大腦功能，導(dǎo)致HE的發(fā)生和發(fā)展[11-12]。

Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的不同于Th1、Th2細(xì)胞的CD4＋T細(xì)胞亞群，其在病毒性肝炎、肝硬化等肝臟疾病患者的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[13]。本研究結(jié)果顯示，相較于慢性肝病患者和健康體檢者，HE患者的外周血Th17/Treg比值、IL-17水平升高，IL-10、TGF-β水平降低，且隨著HE病情加重，Th17/Treg比值、IL-17水平呈逐漸升高趨勢，IL-10、TGF-β水平呈逐漸降低趨勢。Th17細(xì)胞是由Th0細(xì)胞在IL-6和TGF-β共同作用下分化形成的，可分泌促炎因子IL-17，而IL-17能促進(jìn)T細(xì)胞激活，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生成多種趨化因子，參與中性粒細(xì)胞的增殖、活化和成熟，介導(dǎo)炎性反應(yīng)[14-15]。Treg細(xì)胞可抑制自身抗原或外來抗原引起的免疫反應(yīng)，可通過分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子或直接通過細(xì)胞接觸發(fā)揮免疫調(diào)控作用，減輕炎性反應(yīng)，緩解由于炎性因子表達(dá)水平過高引發(fā)的全身性病理損傷，在機(jī)體免疫耐受與自身穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用[16]。研究表明，隨著HE患者病情加重，炎性反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，而免疫調(diào)控作用減弱，導(dǎo)致患者外周血Th17/Treg比值顯著升高，且HE分級越高其比值也越高[17]。這與本研究的結(jié)果相符。

本研究中50例HE患者在治療1周后有14例預(yù)后不良，36例預(yù)后良好。結(jié)果顯示，與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組的Th17/Treg比值，以及ALT、AST、血氨、IL-17的表達(dá)水平均較高，而IL-10、TGF-β的表達(dá)水平均較低。多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，AST、血氨、Th17/Treg比值、IL-17為影響HE患者預(yù)后的危險因素，而TGF-β為影響預(yù)后的保護(hù)因素，這提示炎性因子與免疫功能是影響患者預(yù)后的重要因素。分析其原因為，HE患者體內(nèi)炎性介質(zhì)大量蓄積，通過血腦屏障后可抑制腦組織的正常生理活動，并可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，進(jìn)一步影響HE的進(jìn)展和預(yù)后[18]；Treg細(xì)胞數(shù)量增多及功能修復(fù)可以有效減少肝細(xì)胞壞死，但隨著HE預(yù)后變差，肝損傷持續(xù)加重，會導(dǎo)致機(jī)體T細(xì)胞總數(shù)減少及功能減弱，從而導(dǎo)致免疫失衡，這是影響預(yù)后的重要因素[19-20]。本研究采用ROC曲線分析外周血Th17/Treg比值對患者預(yù)后的預(yù)測價值，結(jié)果顯示AUC為0.958，敏感度為92.86%，特異度為91.67%，這提示外周血Th17/Treg比值可作為評估HE病情嚴(yán)重程度、預(yù)后的重要指標(biāo)。

綜上所述，HE患者外周血Th17/Treg比值顯著升高，其判斷患者預(yù)后的效能較高，可為探究HE的病情進(jìn)展及臨床診治提供新思路。本研究存在一定的不足之處，如樣本量較小、預(yù)后評估標(biāo)準(zhǔn)較為主觀等，可能造成結(jié)果偏倚，今后課題組將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并盡量選取客觀的預(yù)后評估指標(biāo)，以驗證本研究的結(jié)論。