炎癥性腸病患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4表達的關系及意義

楊永強 李 娟 鐘海川 符芳輝

炎癥性腸?。↖BD）是一種以慢性炎性反應為特征的腸道疾病，包括克羅恩?。–D）和潰瘍性結腸炎（UC），其癥狀主要包括直腸出血、腹痛、腹瀉和疲勞，病情具有反復性，難以治愈[1]。IBD的病因目前尚未完全明確，可能與遺傳因素、免疫系統(tǒng)受損、環(huán)境誘導、腸道共生菌群變化等有關[2]。研究顯示，西方國家的IBD發(fā)病率已趨于穩(wěn)定，但發(fā)展中國家的IBD發(fā)病率呈逐年升高趨勢，目前IBD已成為消化醫(yī)學領域的研究熱點[3]。因此，探究與IBD發(fā)病相關的分子機制具有重要意義。

多種miRNA在IBD的病理過程中發(fā)揮著關鍵作用[4-6]。楊文宏等[6]的研究顯示，miR-125b和miR-335在IBD患者的腸黏膜組織及血清中表達下調，其在血清中的表達水平與患者的疾病嚴重程度及活動度密切相關。研究表明，miR-129不僅在多種腫瘤（骨肉瘤、鼻咽癌、結腸癌和肺癌等）的發(fā)病中發(fā)揮了作用，而且在癲癇、糖尿病、椎間盤退行性變、心力衰竭和肥胖癥等非惡性腫瘤疾病中也起著作用，并有潛力作為糖尿病、癲癇等疾病的生物標志物[7]。程序性細胞死亡因子4（PDCD4）是一種抑癌基因，能夠調節(jié)細胞凋亡、蛋白質翻譯、炎性反應及信號轉導，而IL-12、IL-2和IL-15等可調控PDCD4的表達水平[8]。Kim等[9]的研究表明，PDCD4在結直腸癌中低表達，其表達水平與腫瘤分化程度及患者5年生存率有關，可以作為結直腸癌的預后預測指標。目前關于IBD患者中miR-129和PDCD4表達水平的報道較少。本研究檢測了IBD患者腸黏膜組織中miR-129和PDCD4的表達水平，并分析了兩者的相關性，以及其與患者疾病活動度的關系，以期為臨床診斷IBD提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2017年7月至2020年1月于海南省萬寧市人民醫(yī)院消化內科就診的176例活動期IBD患者設為IBD組，其中94例為UC患者（設為UC組），82例為CD患者（設為CD組）。IBD組患者中，男性97例，女性79例，年齡28～59歲，平均年齡為（40.30±7.87）歲。另選擇同期在該院就診的100例結腸息肉患者設為對照組，其中男性58例，女性42例，年齡30～58歲，平均年齡為（40.68±7.82）歲。IBD組與對照組的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），具有可比性。CD組患者中，男性45例，女性37例，平均年齡為（39.46±7.54）歲，根據(jù)CD活動指數(shù)（CDAI）將CD組患者分為輕度CD組（28例）、中度CD組（31例）和重度CD組（23例）。UC組患者中，男性52例，女性42例，平均年齡為（41.04±8.16）歲，根據(jù)改良Mayo評分將UC組患者分為輕度UC組（30例）、中度UC組（32例）和重度UC組（32例）[10]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批件號170519），所有入組者均簽署了知情同意書。

1.2 納入標準與排除標準

納入標準：（1）活動期IBD患者均符合相關診斷標準[10]，并結合活體組織病理檢查、結腸鏡檢查結果確診；（2）處于疾病活動期；（3）無精神疾病史。排除標準：（1）合并凝血功能障礙；（2）腸道穿孔者；（3）3個月內使用過免疫抑制劑、糖皮質激素等；（4）合并腸結核等感染性疾病；（5）患有類風濕關節(jié)炎等自身免疫病；（6）合并惡性腫瘤。

1.3 腸黏膜組織中miR-129和PDCD4表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測各組患者腸黏膜組織的miR-129和PDCD4表達水平。在IBD組患者入院行腸鏡檢查時取腸黏膜病變組織，在對照組患者行腸鏡下息肉切除術時取距息肉＞5 cm的回腸或結腸活體組織，活體組織均置于-80 ℃環(huán)境保存待測。取-80 ℃保存的腸黏膜組織，在低溫環(huán)境中研磨成粉末，然后使用RNA提取試劑盒[購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP419]從中抽提得到總RNA。使用微量蛋白分析儀檢測RNA質量，吸取1 μg RNA，使用反轉錄試劑盒（購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號R212-01）進行反轉錄，然后使用SYBR Green染料[購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，貨號QPS-201]配制成10 μL反應體系，在實時熒光定量PCR儀[購自樂普（北京）醫(yī)療器械股份有限公司，型號Lepgen-96]上采集信號，擴增條件為：95 ℃ 60 s預變性；之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。miR-129以U6作為內參，PDCD4以GAPDH作為內參，采用 2-??Ct法計算 miR-129和 PDCD4的相對表達量。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，2組間比較采用t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析。采用Pearson相關系數(shù)法分析IBD患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4表達水平的相關性，以及miR-129和PDCD4的表達水平分別與改良Mayo評分、CDAI評分的相關性。采用ROC曲線評估腸黏膜組織中miR-129和PDCD4表達水平診斷IBD的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IBD組與對照組的miR-129和PDCD4表達水平比較

IBD組患者腸黏膜組織中miR-129、PDCD4的相對表達量分別為0.82±0.23、0.67±0.19，均低于對照組（1.36±0.35、1.02±0.27），2組的差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

2.2 UC組與CD組的miR-129和PDCD4表達水平比較

如表2所示，UC組與CD組的miR-129和PDCD4表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

表2 UC組與CD組的miR-129和PDCD4表達水平比較

2.3 不同疾病活動度患者的miR-129和PDCD4表達水平比較

94例UC患者中，輕度UC組、中度UC組、重度UC組的miR-129和PDCD4表達水平依次降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。82例CD患者中，輕度CD組的miR-129和PDCD4表達水平均高于中度CD組和重度CD組，而中度CD組的miR-129和PDCD4表達水平均高于重度CD組，組間差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 不同疾病活動度患者的miR-129和PDCD4表達水平比較

2.4 IBD患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4表達水平的相關性分析

相關性分析結果顯示，IBD患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4的表達水平呈正相關（r＝0.735，P＝0.000）。見圖1。

圖1 IBD患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4表達水平的相關性分析

2.5 miR-129和PDCD4表達水平與疾病活動度的相關性分析

相關性分析結果顯示，UC組的miR-129和PDCD4表達水平均與改良Mayo評分呈負相關（r＝-0.580、r＝-0.595，P均＝0.000），見圖2。CD組的miR-129和PDCD4表達水平均與CDAI評分呈負相關（r＝-0.508、r＝-0.498，P均＝0.000）。見圖3。

圖2 UC組的miR-129和PDCD4表達水平與改良Mayo評分的相關性分析 A miR-129與改良Mayo評分 B PDCD4與改良Mayo評分

圖3 CD組的miR-129和PDCD4表達水平與CDAI評分的相關性分析 A miR-129與CDAI評分 B PDCD4與CDAI評分

2.6 miR-129和PDCD4表達水平診斷IBD的ROC曲線分析

ROC曲線分析結果顯示，IBD組患者腸黏膜組織中miR-129表達水平診斷IBD的ROC曲線下 面 積（AUC）為 0.759（95%CI：0.703～0.816），最佳截斷值為1.26，敏感度為71.60%，特異度為72.00%；PDCD4表達水平診斷IBD的AUC為0.867（95%CI：0.821～0.913），最佳截斷值為 0.87，敏感度為85.80%，特異度為76.00%；miR-129聯(lián)合PDCD4診斷IBD的AUC、敏感度、特異度分別為0.911（95%CI：0.874～0.947）、83.50% 和 85.00%。見圖4。

圖4 miR-129和PDCD4診斷IBD的ROC曲線

3 討論

IBD是一種消化系統(tǒng)常見疾病，包括UC和CD，UC病變主要累及結直腸，患者常出現(xiàn)腹瀉、便血；而CD常見病變部位是回腸末端，可導致腹痛、體質量減輕和排便習慣改變[11]。目前，IBD的發(fā)病機制尚未完全明確，既往研究報道IBD的發(fā)生受到環(huán)境因素、免疫系統(tǒng)缺陷、遺傳易感性及個體腸道微生物群改變的共同影響[12]。研究表明，IBD的持續(xù)時間、病變范圍和病情嚴重程度，炎性假性息肉的存在，原發(fā)性硬化性膽管炎及結直腸癌家族史是IBD相關結直腸癌的主要危險因素[13]。近年來，亞洲的IBD發(fā)病率不斷升高，嚴重影響了患者的生活質量[14]。因此，深入探究IBD的發(fā)病機制對于尋找臨床治療靶點至關重要。

miRNA參與調節(jié)人體免疫、炎性反應等生理功能，其在IBD患者中的異常表達參與了NF-κB介導的炎性反應和腸黏膜屏障功能的損傷及修復[4]。部分miRNA可作為IBD的血清學診斷標志物，并可用于鑒別CD與UC[5]。既往研究表明，miR-129-5p在多種炎性疾病中作為炎性反應和細胞凋亡的新型調節(jié)劑。Wan等[15]的研究結果顯示，miR-129-5p在脊髓損傷小鼠模型中表達下調，通過抑制高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號通路來抑制炎性反應，從而促進機體損傷修復。Meng等[16]的研究表明，與健康人相比，CD或UC患者的miR-129表達水平顯著降低，通過負向調節(jié)泛素連接酶FBW7的表達水平抑制NF-κB信號通路，從而改善IBD癥狀。本研究中IBD組miR-129的表達水平顯著低于對照組，與上述研究結果相符，這提示miR-129可能參與了IBD的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究結果還顯示，UC組與CD組患者的miR-129表達水平差異無統(tǒng)計學意義，這提示miR-129不能用于鑒別診斷UC與CD。miR-129的表達水平分別在輕度、中度、重度UC和CD患者組中依次降低，這提示miR-129的表達水平與疾病嚴重程度有關，且miR-129表達水平降低可能促進了IBD的進展。

PDCD4作為腫瘤抑制因子，可抑制腫瘤細胞的生長，并可促進腫瘤細胞凋亡[8]。研究表明，PDCD4缺失可導致急性結腸炎小鼠血清中IL-6表達上調，以及腸組織中IL-6、TNF-α表達水平升高，從而加重病情，促進急性結腸炎相關結腸癌的進展[17]。本研究結果顯示，IBD組腸黏膜組織中PDCD4表達水平顯著低于對照組，UC組與CD組的PDCD4表達水平差異無統(tǒng)計學意義，這提示PDCD4可能參與調控IBD的病理過程，但不能用于臨床鑒別UC與CD。王剛等[18]的研究顯示，隨著由呼吸道合胞病毒引發(fā)的毛細支氣管炎病情的加重，血清PDCD4表達水平下降。本研究結果顯示，在CD和UC患者中，輕度組的PDCD4表達水平均高于中度組，而中度組的PDCD4表達水平均高于重度組，這提示PDCD4的表達水平隨著疾病活動度增高而降低，PDCD4可能參與了IBD的發(fā)生和發(fā)展。

研究顯示，PDCD4在腦血管疾病機體中的異常表達受到miRNA的調控[19]。本研究結果顯示，IBD組腸黏膜組織中miR-129與PDCD4的表達水平呈正相關，這提示miR-129、PDCD4可能共同參與了IBD的病理過程。此外，本研究結果還顯示，UC組的miR-129、PDCD4表達水平與改良Mayo評分呈負相關，CD組的miR-129、PDCD4表達水平與CDAI評分呈負相關，這提示miR-129、PDCD4的表達水平與UC及CD患者的疾病活動度密切相關。ROC曲線分析結果顯示，miR-129、PDCD4單項及兩項聯(lián)合診斷IBD的AUC分別為0.759、0.867和0.911，這提示兩項聯(lián)合診斷的效能更高，可用于IBD的輔助診斷。

綜上所述，IBD患者腸黏膜組織中miR-129和PDCD4的表達水平下調，且miR-129和PDCD4的表達水平與UC及CD患者的疾病活動度有關，其有望成為早期診斷IBD的生物標志物。本研究的不足之處在于納入的病例數(shù)有限，且未對miR-129及PDCD4調控IBD的具體機制進行深入分析。今后課題組將擴大樣本量，進一步探討相關作用途徑。