脫落細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HPV-DNA檢測(cè)在宮頸癌前病變?cè)\斷中的應(yīng)用

張秀芳

寶坻婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，天津 301800

宮頸癌是一種常見(jiàn)婦科腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年因?qū)m頸癌死亡人數(shù)超過(guò)27.5 萬(wàn)，特別是在在發(fā)展中國(guó)家，因?qū)m頸病變的篩查診斷技術(shù)的層次不齊，導(dǎo)致早期診斷很難發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重威脅婦女生命健康［1-3］。宮頸癌在早期無(wú)明顯體征和臨床癥狀，隨病情發(fā)展可出現(xiàn)陰道排出白色米泔狀液體、陰道流血等［4-5］。研究表明［6-7］，宮頸癌病變病情進(jìn)展較為緩慢，早期診斷來(lái)預(yù)防宮頸癌發(fā)生癌前病變可明顯降低死亡率。目前，在臨床上主要通過(guò)聯(lián)合人乳頭瘤病毒（HPV）檢測(cè)、液基薄層細(xì)胞（TCT）檢測(cè)等手段篩查［8］。其中，宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查常用于篩查宮頸癌前病變，主要利用宮頸刮板進(jìn)行宮頸細(xì)胞的取樣，是一種無(wú)創(chuàng)傷并且有效的檢查方法［9］。宮頸癌前病變的主要致病因子是HPV 的持續(xù)感染，并在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10］。檢測(cè)HPV-DNA 能夠?qū)⒑Y選感染高危型HPV 女性患者，能夠?yàn)榧皶r(shí)診治提供依據(jù)。本研究選取HPV-DNA檢測(cè)和宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查進(jìn)行篩查宮頸癌前病變的100 例患者，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年3 月—2018 年3 月寶坻婦產(chǎn)醫(yī)院婦科門診收治的100 例采用HPV-DNA 檢測(cè)和宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查進(jìn)行篩查宮頸癌前病變的患者作為研究對(duì)象，年齡26～64 歲，平均年齡（48.69 ± 6.48）歲。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：患者沒(méi)有宮頸手術(shù)病史以及子宮切除手術(shù)史；患者目前沒(méi)有妊娠；沒(méi)有細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常病史。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、感染、自身免疫疾病、器質(zhì)性病變等疾病者；依從性不好，未完成本研究者；哺乳期、妊娠期患者；結(jié)蹄組織相關(guān)疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查：避開(kāi)經(jīng)期，檢查前2 d未進(jìn)行性生活、陰道沖洗或者上藥等，患者取膀胱截石，暴露宮頸；采用液基薄層細(xì)胞試劑盒中的子宮頸刷采集子宮頸脫落細(xì)胞樣本置入裝有細(xì)胞保存液的小瓶進(jìn)行漂洗，采用全自動(dòng)制片機(jī)處理，分離標(biāo)本中的黏液、上皮細(xì)胞、血液及炎性細(xì)胞。細(xì)胞通過(guò)膜式過(guò)濾器負(fù)壓吸轉(zhuǎn)到膜上，將其轉(zhuǎn)移到經(jīng)靜電處理的載玻片上，混勻細(xì)胞制定到的薄層細(xì)胞涂片（直徑2 cm 左右）2 張，并采用95%濃乙醇進(jìn)行固定，采用巴氏染色，之后在雙盲下讓兩名病理師采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行閱片檢查，細(xì)胞學(xué)診斷采用國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)分級(jí)系統(tǒng)分為良性炎癥改變、正常細(xì)胞、意義不明確的低度鱗狀上皮內(nèi)病變、非典型鱗狀細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞癌及高度鱗狀上皮內(nèi)病變。TCT檢測(cè)異常指的是ASCUS及以上病變。

HPV-DAN檢測(cè)：采用美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的7500型核酸擴(kuò)增儀實(shí)施PCR 擴(kuò)增、雜交、洗膜及顯色，采用原裝的配套試劑HR-HPV 核酸定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4 共18 個(gè)亞型。用無(wú)菌棉簽蘸取無(wú)菌生理鹽水，插入女性的宮頸口，沿內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)5圈，以獲取足量的脫落細(xì)胞和分泌物，然后將其放入裝有洗脫液（1 mL）的洗脫管中待測(cè)。將宮頸刷放在洗脫管內(nèi)漂洗，將洗脫液轉(zhuǎn)移到微量離心管（1.5 mL），10 000 rpm/min 離心10 mim，丟棄上清液，留下管底全部的細(xì)胞塊。向其中加入50 μL左右裂解液懸浮沉淀，100℃的水浴加熱10 min，10 000 rpm/min 離心10 min，保留上清液待用。HPV 的基因擴(kuò)增：取1 μL 的DNA 抽提液，向其中加入HPV 的PCR 擴(kuò)增體系，用試劑盒的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；最后給予72℃延伸5 min。之后采用導(dǎo)流雜交法HPV 的基因給與分型：將20 μL 有生物素標(biāo)記的PCR 產(chǎn)物通過(guò)變性，和1 mL 預(yù)熱到45 ℃的雜交緩沖液混合，放置于導(dǎo)流雜交儀上經(jīng)過(guò)5 min孵育然后實(shí)施導(dǎo)流雜交。雜交結(jié)束再用0.8 mL 雜交緩沖液3 次沖洗。在25 ℃下用封阻液封阻5 min 孵育。封阻結(jié)束之后加入0.5 mL 酶標(biāo)液孵育3.5 min。用沖洗緩沖液A 沖洗雜交膜，去除沒(méi)有結(jié)合的酶標(biāo)液，顯色期間加入0.5 mL 的四唑硝基藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物在36 ℃條件下保持5 min 或顯色完成結(jié)束。在顯色后1 h內(nèi)察看分析結(jié)果。

病理學(xué)檢測(cè)：將以上異常結(jié)果的患者進(jìn)行病理學(xué)活檢，并以病理學(xué)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。在受檢者月經(jīng)干凈后1周由經(jīng)驗(yàn)豐富的陰道鏡專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行檢查，把陰道窺器放入陰道后將宮頸表面分泌物擦凈，然后用3%冰醋酸棉球?qū)m頸浸濕，采用陰道鏡對(duì)可疑部位多點(diǎn)取材，組織標(biāo)本常用1%甲醛溶液固定，然后進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。觀察柱狀上皮、鱗狀上皮及轉(zhuǎn)化區(qū)的形態(tài)及顏色變化，當(dāng)發(fā)現(xiàn)異常陰道鏡圖像后，用盧戈碘液涂抹宮頸，多點(diǎn)活檢點(diǎn)狀血管、白色上皮等組織。結(jié)果分別為宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）及炎癥反應(yīng)，根據(jù)病變程度分為Ⅰ～Ⅲ級(jí)及浸潤(rùn)癌3類。

1.3 分析方法

以組織活檢診斷為標(biāo)準(zhǔn)，HPV-DNA 檢測(cè)和宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果與組織活檢診斷結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，計(jì)算出兩者聯(lián)用篩查宮頸癌前病變的敏感度和準(zhǔn)確性以及陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值。

2 結(jié)果

2.1 宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)、HPV-DNA 檢測(cè)和活組織病理檢查結(jié)果

宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果：正常范圍者71 例，未明確意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞者14 例（14.00%）。低度鱗上皮內(nèi)病變者10 例（10.00%），低度鱗狀上皮內(nèi)病變者4例（4.00%），鱗狀上皮浸潤(rùn)癌者1 例（1.00%）。高危型HPV-DNA 檢測(cè)結(jié)果：陽(yáng)性29 例，陽(yáng)性率29.00%。病理檢查確診為宮頸病變的患者高危型HPV DNA 陽(yáng)性率：CIN I 44.44%（12/27），CINⅡ88.46%（23/26），CIN III 91.67%（22/24），官頸浸潤(rùn)癌90.48%（19/21）。

2.2 宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HPV-DNA 檢測(cè)的特異度、敏感度以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值

以組織活檢診斷為確診標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算了宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HPV-DNA檢測(cè)的敏感度和準(zhǔn)確性以及陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值。兩組方法聯(lián)合檢查組的特異度和敏感度顯著高于宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查組和HPV-DNA 檢測(cè)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組方法聯(lián)合檢查組的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值顯著高于宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查組和HPV-DNA檢測(cè)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且聯(lián)用組陰性預(yù)測(cè)值比顯著低，見(jiàn)表1。表明聯(lián)用組的確診能力和排除疾病能力均強(qiáng)于單用組。

表1 宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HPV-DNA檢測(cè)的特異度、敏感度以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 %

3 討論

宮頸癌婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)干預(yù)可以有效降低其發(fā)病率和病死率，而及時(shí)預(yù)防和控制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是提高宮頸癌患者存活幾率的關(guān)鍵［11］。上世紀(jì)80年代有學(xué)者提出HPV 有可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，基于此進(jìn)行了相關(guān)研究［12］。收集宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢查也是宮頸癌早期篩查的重要手段［13］。目前臨床上常采用宮頸脫落細(xì)胞行TCT 檢測(cè)，認(rèn)為優(yōu)于宮頸刮片取材［14］。在TCT檢測(cè)時(shí)，用軟刷使宮頸脫落的細(xì)胞粘附在刷毛，然后放在保存液中振蕩漂洗，使大部分細(xì)胞溶在保存液［15］。因?yàn)門CT 技術(shù)可用于檢出滴蟲(chóng)、念珠菌等，其細(xì)胞取材較為廣泛，并且在癌前病變及宮頸癌的檢測(cè)中具有較高的檢出率［16-17］。但是TCT 檢測(cè)具有價(jià)格較高及步驟復(fù)雜等，在HPV感染診斷中易漏診［18］。

宮頸癌前病變的重要病因是HPV 感染，特別是年輕患者的病毒自然清除期需8～10個(gè)月，不易引起病變，而宮頸病變的前提條件是持續(xù)性HPV 感染［19］。目前，HPV 的感染與宮頸癌的直接關(guān)聯(lián)已被證實(shí)，并且HPV 與宮頸癌癌前病變密切相關(guān)，并且高于99%的宮頸癌患者體內(nèi)均可檢出HPV，而在健康人群中這一比例僅為4%，因此HPV 的檢測(cè)在評(píng)估子宮頸病變的進(jìn)展中具有重要地位［20］。

相關(guān)研究表明［21］，宮頸癌的發(fā)生與HPV 聯(lián)系密切，病毒對(duì)機(jī)體侵染階段，HPV 病毒對(duì)機(jī)體的感染可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體炎性反應(yīng)及免疫微環(huán)境發(fā)生改變，從而間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生進(jìn)展和增殖。在侵染早期，機(jī)體能夠通過(guò)對(duì)病毒的免疫抑制將病毒消除，少數(shù)者因?yàn)椴《景l(fā)生持續(xù)性增殖，可能會(huì)導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生癌變［22］。本研究中，100 例樣本行宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查，結(jié)果表明，兩種檢查方法聯(lián)合檢查的特異度和敏感度顯著高于宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查組和HPV-DNA檢測(cè)組，兩組方法聯(lián)合檢查組的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值顯著高于宮頸刮片脫落細(xì)胞學(xué)檢查組和HPV-DNA檢測(cè)組，并且聯(lián)用組陰性預(yù)測(cè)值比顯著低。表明聯(lián)用組的確診能力和排除疾病能力均強(qiáng)于單用組。但針對(duì)不同級(jí)別的患者的檢出率不一致，因此，針對(duì)特殊患者應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行病理檢測(cè)，不應(yīng)抱有僥幸心理，如細(xì)胞學(xué)診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變和鱗狀上皮浸潤(rùn)癌級(jí)別以上的患者應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行HPV-DNA的檢測(cè)，陽(yáng)性者應(yīng)進(jìn)一步行陰道鏡檢測(cè)，有必要時(shí)進(jìn)行病理活檢［23］。

綜上所述，宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HPV-DNA檢測(cè)對(duì)宮頸癌前病變的篩查和診斷有積極的臨床價(jià)值。