透明質酸結合蛋白1和細胞周期蛋白A在子宮內膜癌組織中表達及臨床意義*

楊 琳，張金玲，王莉菲，梁秀云

深圳市人民醫(yī)院·暨南大學第二臨床醫(yī)學院·南方科技大學第一附屬醫(yī)院婦科，廣東 深圳 518020

子宮內膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。近年來，子宮內膜癌在世界范圍內的發(fā)病率有上升及年輕化趨勢，是威脅女性健康重要的疾病之一［1-4］。子宮內膜癌的病因并不十分清楚，越來越多的學者認為，所有導致腫瘤的機理是直接或間接影響了細胞周期調控因子的正常運轉，細胞周期持續(xù)演進，細胞進入自主的無約束的增殖和分裂，表現(xiàn)出旺盛的增殖活性進而產(chǎn)生惡性轉化。因此，段光明等［5］認為腫瘤是一類細胞周期病。透明質酸結合蛋白1（hyaluronan binding protein 1, HABP1）和細胞周期蛋白A（Cyclin A）都是細胞周期的正向調節(jié)因素，其表達規(guī)律的改變是細胞周期破壞的重要特征之一。HABP1是一種多功能蛋白，其獨特的晶體結構和多種生物學特性，可以與多種細胞蛋白發(fā)生作用。是線粒體凋亡信號通路的一個重要調節(jié)因子，涉及介導細胞—細胞及細胞—基質間的黏附、細胞信號的轉導等方面。近年來的研究發(fā)現(xiàn)［6-8］，HABP1 在一些腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達，同時參與某些腫瘤的轉移和侵襲過程，而且與化療藥物誘導的細胞凋亡存在著密切關系。Cyclin A 是細胞周期驅動機制中的一個重要調控因子，其異常表達可導致細胞周期調節(jié)失控，促進細胞在DNA復制不完全時即進入M 期，從而直接或間接地導致細胞的惡性轉化和腫瘤的形成。HABP1 和Cyclin A 在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達（如肝癌、食管癌、乳腺癌等），參與腫瘤的轉移和侵襲過程，并可以預示腫瘤的生物學行為和臨床結果。直到現(xiàn)在，國內外尚無關于HABP1和Cyclin A在子宮內膜癌組織表達相關性的研究報道。本研究擬通過采用免疫組織化學染色法檢測Cyclin A及HABP1在正常子宮內膜、非典型增生子宮內膜、子宮內膜腺癌中的表達，研究和探討其表達水平與子宮內膜腺癌臨床病理參數(shù)之間的關系，進一步探究二者之間有無關聯(lián)性，以期初步求證Cyclin A 及HABP1 可否成為早期預測子宮內膜癌發(fā)生和判斷子宮內膜癌預后的標志物?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015—2017年樣本醫(yī)院手術存檔的資料，采取隨機隨機抽樣的方法分為3 組：（1）正常子宮內膜組織標本20例。（2）來源于手術切除的子宮內膜非典型增生組織標本或同期宮腔鏡檢查獲得的子宮內膜非典型增生組織標本24 例。（3）子宮內膜腺癌組織56 例，組織學分級G1 組18例、G2 組20 例、G3 組18 例；有淋巴結轉移14 例，無淋巴結轉移42 例；參照FIGO（2009 年）的分類標準，Ⅰ期和Ⅱ期32 例，Ⅲ期和Ⅳ期24 例；肌層浸潤＞1/2 的21 例，肌層浸潤≤1/2 的35 例。標本來源的所有患者均未做化療或放療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 （1）切片脫蠟至水：石蠟切片依次放入二甲苯I→二甲苯II→二甲苯:無水酒精（1:1）→無水酒精I→無水酒精II→95%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→50%乙醇脫蠟至蒸餾水。（2）切片染色：①石蠟切片從蒸餾水中拿出放入PBS 中浸泡5 min。②置于90 ℃抗原修復液中進行抗原修復6～7 min。③3%過氧化氫（H2O2）（無色液體）去離子水孵育10 min，消除內源性過氧化物酶活性。緩沖液洗H2O2。④滴加5%BSA 封閉液，室溫孵育10～15 min，傾去，勿洗。封閉組織蛋白，以防止非特異性反應。⑤直接滴加200 倍稀釋的抗人Cyclin A 單抗，濕盒中37 ℃孵育2 h 后PBS 沖洗，3 min×3 次；隨后進行陰性對照組染色：用0.01 mol/L PBS 代替單抗。⑥滴加二抗，室溫孵育20 min 后PBS 沖洗，3 min×3 次。⑦滴加SABC，室溫孵育20 min 后PBS 沖洗，3 min×3 次。⑧DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色效果。陰性對照組不染色而實驗組染色之后停止顯色，放入蒸餾水中充分沖洗（3 min×3次）。⑨蘇木素染細胞核1 min→蒸餾水洗1 min→分色液分色30 s→自來水中返藍2 h。⑩梯度乙醇脫水（流程中每個環(huán)節(jié)2 min，過程與脫蠟至水相反），二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2 圖像分析 HABP1 和CyclinA 主要表達于細胞漿中，呈棕黃色。免疫組織化學染色的切片在光學顯微鏡下觀察，顯微圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)字成像，并采集圖片，計算光密度值（IOD），分析各組之間的HABP1 和Cyclin A的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)值連續(xù)變量以均數(shù)±標準差（±s）表示。用t 檢驗進行不同臨床分期和有無淋巴結轉移以及肌層浸潤深度分析。采用方差分析子宮內膜腺癌、非典型增生子宮內膜與正常子宮內膜間差異、子宮內膜腺癌不同分化程度間差異。Cyclin A 和HABP1 相互關系采用相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HABP1和Cyclin A在不同子宮內膜組織免疫組織化學染色結果

子宮內膜腺腺癌根據(jù)其分化程度分為三級，G1：高分化腺癌，腺體較規(guī)則，可見復層細胞，細胞排列緊密；G2：中等分化腺癌，腺體很不規(guī)則，部分癌組織呈實體結構。癌細胞呈單層或復層緊密排列；G3：低分化腺癌，腺體結構很少見或極不規(guī)則，癌巢多呈實性。HABP1 和Cyclin A 抗體染色的樣本陽性區(qū)主要是子宮內膜細胞漿中，可以看到對應組織學分級所具有的典型的形態(tài)特征。HABP1 和Cyclin A 在子宮內膜組織的免疫組織化學染色結果見圖1和圖2。

圖1 CyclinA在子宮內膜組織化學染色結果

圖2 HABP1在子宮內膜組織化學染色結果

2.2 HABP1和Cyclin A在不同子宮內膜組織中的表達

三組患者HABP1 和Cyclin A 的表達呈逐漸上升的趨勢。在非典型增生子宮內膜和子宮內膜癌組，二者的表達均高于在正常子宮內膜組的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。非典型增生子宮內膜和子宮內膜癌兩組間HABP1 和Cyclin A 的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 HABP1和Cyclin A在不同子宮內膜組織中的表達

2.3 HABP1和CyclinA在各子宮內膜腺癌組織中的表達

HABP1 和Cyclin A 的表達在低分化組明顯高于高分化組和中分化組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在肌層浸潤深度＞1/2 的子宮內膜腺癌中，表達明顯高于肌層浸潤深度≤1/2 的子宮內膜癌，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在有淋巴結轉移的子宮內膜腺癌中，表達也明顯高于無淋巴結轉移組的子宮內膜癌，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。由此可見，子宮內膜腺癌的組織分化越差、肌層浸潤越高。

表2 HABP1和Cyclin A在各子宮內膜腺癌組織中的表達（±s）

表2 HABP1和Cyclin A在各子宮內膜腺癌組織中的表達（±s）

a 表示與正常子宮內膜組比較，P＜0.05；b 表示與子宮內膜非典型增生組比較，P＜0.05。

組別臨床分期Ⅰ期+Ⅱ期（n=32）Ⅲ期+Ⅳ期（n=24）組織分化G1（n=18）G2（n=20）G3（n=18）肌層浸潤＞1/2（n=21）無或≤1/2（n=35）淋巴結轉移陰性（n=42）陽性（n=14）HABP1表達Cyclin A表達1 083.87±463.47 2 381.01±898.79a 737.17±294.47 2 994.01±1 142.76a 395.47±171.86 834.31±275.18a 2 149.31±923.18b 559.47±314.46 1157.31±824.09a 1 949.31±1 026.31b 2 106.31±837.62a 1 374.82±324.91 2 586.47±938.29a 984.71±424.03 879.41±355.14 2 516.31±792.65a 946.26±381.61 2 706.35±972.41a

2.4 HABP1和Cyclin A的相互關系

HABP1 和Cyclin A 間存在呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 HABP1和Cyclin A的相互關系

3 討論

子宮內膜癌的病因尚不明確，侵襲和轉移是腫瘤治療失敗、臨床預后不良的重要生物學原因。影響預后的因素較為復雜，年齡、腫瘤分期、組織學分級、肌層浸潤深度和淋巴結轉移是公認的影響其預后的獨立危險因素。

誘發(fā)惡性腫瘤有多種原因，如抑癌基因的缺失、生長因子信號轉導通路的持續(xù)和癌基因的過度擴增等。近年來越來越多的學者注意到細胞生長周期的失調在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。有研究［5］認為腫瘤是一類細胞周期病。腫瘤的本質是細胞失控性生長—增殖過度和凋亡減少。幾乎所有癌基因的功能效應，最終都會匯聚到細胞周期機制上來。

HABP1 和Cyclin A 都是細胞周期的正向調節(jié)因素，其表達規(guī)律的改變是細胞周期破壞的重要特征之一。異常表達導致細胞異常增殖不僅涉及腫瘤的起始階段，而且促進細胞癌變的發(fā)生和使腫瘤組織具有侵襲、轉移和復發(fā)的能力，其過度表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、不良預后有關。

一般情況下，細胞周期驅動機制調控異常，細胞就會進入非正常狀態(tài)，即病理狀態(tài)，從而出現(xiàn)如細胞轉化、癌變等異常情況。Cyclin A 正是細胞周期驅動機制中的一個非常重要的因子。目前研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin A 基因位于染色體4q27 上，是432 個氨基酸組成的球形結構，由12 個a 螺旋形成（它是兩段分別由90個左右的氨基酸形成的相似折疊）。相對分子質量為60×103，它在DNA 開始合成前即出現(xiàn)。有證據(jù)證實，如果把Cyclin A抗體或反義質粒注入G1期培養(yǎng)的組織細胞中，可以阻止細胞進入S 期［7］。Cyclin A 在G1→S 轉換中起著非常重要的作用。在哺乳動物組織細胞培養(yǎng)中，Cyclin A 與p33cdk2 結合形成復合體，在G1晚期開始增多，調節(jié)細胞增殖并進入S 期，于S 期和G2 期達到峰值，Cyclin A/p33cdk2 激酶在G1→S 轉換過程中被活化且存在于S 期的細胞核中［7］，具有促進有絲分裂的作用。Cyclin A 異常表達可導致細胞周期調節(jié)失控，促進細胞在DNA 復制不完全時即進入M 期，從而直接或間接地導致細胞的惡性轉化和腫瘤的形成［8］。

近年來的研究表明，很多腫瘤組織中HABP1 和Cyclin A 都表達過度，而且參與了腫瘤的侵襲和轉移過程，故它可以預示腫瘤的臨床結果及生物學行為。例如：在肝癌組織的細胞中，低分化肝癌組中Cyclin A 陽性表達比高分化肝癌組明顯升高。所以，細胞分化越差，Cyclin A 的表達越高［9］。在星形細胞瘤中，Cyclin A表達與腫瘤病理分級顯著相關［10］。Cyclin A 陽性表達與喉鱗癌病理組織學分級呈負相關［11］。

HABP1是透明質酸黏素家族中的一個特殊成員，它能夠特異性的與透明質酸結合［12］。生理條件下，HABP1 主要以一種非共價鍵連接的三聚體形式存在，在氧化環(huán)境中，以六聚體的形式存在，這一六聚體形式使HABP1 與其配體結合的能力大大提高［13］。不同類型的細胞在不同的生理條件下，HABP1可存在于不同的細胞器中，除了線粒體外，還可出現(xiàn)在細胞核、細胞漿及細胞膜上。根據(jù)HABP1的結構特點及這種生物學特性，推測它是一種多功能蛋白，參與細胞內的分子運輸，以連接不同細胞器間的信號轉導記憶連接細胞器和細胞膜之間的信號轉導。HABP1與細胞凋亡之間的關系是近年來的研究熱點。有研究［14-16］發(fā)現(xiàn)，HABP1 可以通過多條通路誘導細胞凋亡。HABP1與透明質酸具有很高的親和力， HABP1通過與HA結合介導細胞內和細胞間的信號轉導，具有促進細胞黏附的特性。透明質酸是構成細胞外基質和細胞間質的主要成分，不僅對維持組織結構、促進細胞黏附、活化和遷移以及細胞信號的轉導有著重要作用，而且還是促進腫瘤細胞的侵襲和轉移、引發(fā)腫瘤細胞抗藥反應的主要物質。盡管在腫瘤細胞的HABP1 基因中并未發(fā)現(xiàn)有腫瘤特異性的突變位點，但是HABP1 蛋白在許多惡性腫瘤組織中呈高表達。Rozanov等［17］研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞株中有HABP1蛋白的過度表達。用抗HABP1 的單抗對甲狀腺癌、卵巢癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、食管癌以及肺腺癌組織中進行免疫組化染色，與各自的非惡變組織進行對照，結果顯示，HABP1蛋白在這些癌組織中呈高表達，同時發(fā)現(xiàn)，HABP1高表達的腫瘤中HA 的含量也是升高的，說明HABP1 與HA 間的相互作用可能與腫瘤有關［18］。由此可見，根據(jù)HABP1 所介導的各種功能來看，HABP1 可能是惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移過程中一個重要的調節(jié)因子。盡管已有研究證實在多種腺癌組織中HABP1 蛋白呈高表達，但是在子宮內膜癌中的表達情況及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，國內無報道，國外報道也較少。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)， HABP1 和Cyclin A 的表達呈逐漸上升的趨勢。在非典型增生子宮內膜和子宮內膜腺癌組，二者的表達均高于在正常子宮內膜組的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義。從前文的分析可見，子宮內膜癌的組織分化越差、肌層浸潤越深、臨床分期越晚，HABP1 和Cyclin A的表達越高。這提示了HABP1和Cyclin A不僅參與子宮內膜癌的發(fā)生，而且與子宮內膜癌進展有關，還參與了子宮內膜癌腫瘤的轉移和侵襲過程。

綜上所述，本實驗結果表明，HABP1 和Cyclin A 參與子宮內膜腺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉移，異常高表達可作為子宮內膜癌的早期預測和子宮內膜病變不同階段的診斷的參考指標。