高效液相色譜法測(cè)定西咪替丁片中的有關(guān)物質(zhì)和含量

劉振麗，徐 麗

駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所食品藥品檢驗(yàn)科，河南 駐馬店 463000

西咪替丁片屬于H2 受體拮抗劑，具有較強(qiáng)的抑酸作用，是臨床治療胃酸過(guò)多、胃潰瘍等胃部疾病的常用藥物［1-2］。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，西咪替丁片還具有治療病毒所致的哮喘、黏膜出血和抗癌等功效［3］。故準(zhǔn)確檢測(cè)西咪替丁片中的有關(guān)物質(zhì)和含量對(duì)后續(xù)臨床治療具有積極意義。紫外-可見(jiàn)分光光度法是檢測(cè)西咪替丁含量的重要方式，但難以檢測(cè)西咪替丁片中的有關(guān)物質(zhì)。高效液相色譜法（HPLC）為色譜法重要分支，具有靈敏度高、可靠性高等優(yōu)點(diǎn)，以液體為流動(dòng)相，借助高壓輸液系統(tǒng)，能夠?qū)⒉煌瑯O性單一溶劑或不同比例混合溶劑等流動(dòng)相泵入色譜柱內(nèi)，從而分離各種成分，并進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)，故被廣泛應(yīng)用于多種藥物的測(cè)定中［4-5］。本研究分析高效液相色譜法測(cè)定西咪替丁片中的有關(guān)物質(zhì)和含量，為臨床用藥提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與材料

（1）儀器。高效液相色譜儀（Agilent LC1260 型，美國(guó)安捷倫）；Hypersil C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；sartorius MSA225S 電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)品）；PHS-3C 型酸度計(jì)（上海精密科技雷磁）；紫外燈254（上?？扑嚬鈱W(xué)儀器廠(chǎng)）。（2）材料。西咪替丁片（一力制藥股份有限公司，規(guī)格：0.2 g，國(guó)藥準(zhǔn)字：H44023079，批號(hào)：20191208）；西咪替丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度為99.8%，批號(hào)：20191115）。乙腈、甲醇（色譜純）。過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、鹽酸、己烷磺酸鈉、磷酸（分析純）。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以Kromasil C18 作為色譜柱，以甲醇—水—乙腈（250∶680∶70，每1 000 mL中含0.5 mL 磷酸和1.081 g 己烷磺酸鈉） 作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量調(diào)整為10 μL，以室溫為柱溫度。精密稱(chēng)取適量西咪替丁對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解、稀釋制成每1 mL中含有100 μg西咪替丁的溶液，取10 mL，滴加0.2 mL 的3%過(guò)氧化氫，置入水浴中加熱，時(shí)間為20 min，待其冷卻，即可獲得系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。取上述溶液10 μL，加入液相色譜儀實(shí)施檢測(cè)，記錄色譜圖，按西咪替丁峰計(jì)算≥6 000為理論板數(shù)，與西咪替丁相鄰有關(guān)物質(zhì)峰和西咪替丁峰間的分離度≥6。

1.2.2 流動(dòng)相優(yōu)選 用240∶760 比例的甲醇—水（每1 000 mL 中含0.3 mL 磷酸和0.94 g 己烷磺酸鈉）作為流動(dòng)相測(cè)定時(shí)，前3 min 噪音值偏大，基線(xiàn)不易走穩(wěn)，峰形拖尾、變鈍，甚至有峰裂現(xiàn)象出現(xiàn)。當(dāng)用200:760:40 比例的甲醇—水—乙腈（每1 000 mL 中含0.5 mL 磷酸和1.081 g己烷磺酸鈉）作為流動(dòng)相測(cè)定時(shí)，分離度變小，出峰時(shí)間變長(zhǎng)，無(wú)峰裂和拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)。用250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈（每1 000 mL 中含0.5 mL 磷酸和1.081 g 己烷磺酸鈉）作為流動(dòng)相測(cè)定時(shí)，峰形完美，峰形對(duì)稱(chēng)、變銳，無(wú)拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)，可更好的分離有關(guān)物質(zhì)中某些成分，最終以250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈作為流動(dòng)相。

1.2.3 測(cè)定方法 （1）含量測(cè)定。取20 片西咪替丁，研成細(xì)粉，取約200 mg 西咪替丁，加入量瓶（200 mL）中，滴加150 mL 鹽酸，振搖，使其充分溶解，再使用鹽酸稀釋至刻度，充分混勻后，濾過(guò)，取10 mL 續(xù)濾液，用250:680:70比例的甲醇—水—乙腈稀釋至100 mL，混勻后作為供試品溶液，取10 μL，根據(jù)1.2.1 色譜條件，加入高效液相色譜儀，對(duì)色譜圖紀(jì)錄。另外取適量西咪替丁對(duì)照品，加入之前獲取的溶液，稀釋呈等同于供試品溶液濃度，作為對(duì)照組溶液，測(cè)定方法同上。以峰面積計(jì)算含量，檢測(cè)含量為RSD 為0.6%，標(biāo)識(shí)量為99.7%。（2）有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。取之前獲取的供試品溶液1 mL，加入刻度為200 mL量瓶中，滴加250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈至刻度，充分混勻后作為對(duì)照溶液，取10 mL 加入高效液相色譜儀，對(duì)檢測(cè)敏感度調(diào)節(jié)，確保主成分色譜峰的峰值高度為滿(mǎn)量程的20%～25%。在兩區(qū)10 μL對(duì)照溶液和10 μL供試品溶液，按照1.2.1色譜條件，加入高效液相色譜儀，對(duì)色譜圖記錄。若供試品溶液有有關(guān)物質(zhì)峰顯現(xiàn)，各有關(guān)物質(zhì)峰的峰面積之和≤對(duì)照溶液主峰的面積，單個(gè)有關(guān)物質(zhì)峰的峰面積≤對(duì)照溶液主峰面積的40%。

1.2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取配置好的對(duì)照品溶液50 mL，分為5 份，1 份用紫外燈（254 nm）照射1 d，2 份分別加入0.2 mL 的2 mol/L 鹽酸溶液和0.2 mL 的2 mol/L 氫氧化鈉，水浴加熱20 min，待其冷卻后加入氫氧化鈉溶液1 mol/L和鹽酸溶液1 mol/L，將pH值調(diào)節(jié)成中性。1份加入0.2 mL的3%過(guò)氧化氫溶液，水浴加熱20 min后冷卻，另外1份水浴加熱3 h后冷卻。量去上述處理后的溶液各10 μL，根據(jù)

1.2.1色譜條件，對(duì)降解產(chǎn)物實(shí)施試驗(yàn)。本色譜條件能滿(mǎn)足有關(guān)物質(zhì)檢查的系統(tǒng)適用性要求：經(jīng)氧化、酸、堿、光照、高溫條件破壞的溶液的色譜圖中均產(chǎn)生程度不一的有關(guān)物質(zhì)峰，均與主成分峰分離良好。

1.2.5 線(xiàn)性回歸試驗(yàn) 在100 mL 量瓶中加入0.012 32g 西咪替丁對(duì)照品，加入250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈溶解，稀釋成對(duì)照品溶液，其含有123.2 μg/mL 西咪替丁，取上述對(duì)照液20 mL、15 mL、10 mL、5 mL、2 mL、1 mL，分別用上述流動(dòng)相稀釋、定容，獲取7個(gè)梯度不一的溶液，范圍4.928～123.2 μg/mL，各取10 μL，按照1.2.1色譜條件進(jìn)樣，對(duì)色譜圖紀(jì)錄。線(xiàn)性回歸以峰面積A 對(duì)濃度C 作為條件檢測(cè)，線(xiàn)性關(guān)系良好，r=0.999 8，Y =31.841 3X-3.877 30。

1.2.6 定量限、檢測(cè)限試驗(yàn) （1）定量限。精密稱(chēng)取適量西咪替丁對(duì)照品，加250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈，稀釋、溶解制成含5.136 μg/mL 西咪替丁的溶液，根據(jù)1.2.1 色譜條件取10 μL 進(jìn)樣，定量限為5 136 ng，結(jié)果（S/N）為10∶1。（2）檢測(cè)限。精密稱(chēng)取適量西咪替丁對(duì)照品，加250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈，稀釋、溶解制成含1.035 μg/mL 西咪替丁的溶液，根據(jù)1.2.1 色譜條件取10 μL 進(jìn)樣，對(duì)色譜圖紀(jì)錄，檢測(cè)限為1 035 ng，結(jié)果（S/N）為2∶1。

1.2.7 系統(tǒng)精密度、溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 取10 mL 1.2.3下獲取的對(duì)照品溶液，根據(jù)1.2.1 色譜條件實(shí)施6 次重復(fù)進(jìn)樣，對(duì)液相色譜圖紀(jì)錄，RSD為0.4%，以峰面積計(jì)算，結(jié)果顯示精密度良好。取上述供試品溶液，室溫下放置，分別與0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h測(cè)定，有關(guān)物質(zhì)和主成分峰面積的RSD 分別為0.5%、0.3%，提示24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別在25 mL量瓶中加入1.2.3下獲取的對(duì)照品溶液3 mL、2 mL、1 mL，分別加入1.2.3 制備的10 mL供試品溶液，加入250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈稀釋至刻度，根據(jù)1.2.1 色譜條件進(jìn)樣10 μL，對(duì)色譜圖紀(jì)錄，結(jié)果顯示3 個(gè)濃度的回收率為100.2%、99.7%、99.8%，RSD 分別為0.3%、0.5%、0.4%，平均回收率為99.9%。

2 討論

西咪替丁能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合壁細(xì)胞上分布的H2 受體，抑制組胺，拮抗胃酸分泌，與其他H2 受體拮抗劑相比，抑酸作用較強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于胃潰瘍、上消化道出血、十二指腸潰瘍等疾病治療［6-7］。西咪替丁還能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，使T 淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率提高，增強(qiáng)抗組胺作用，使毛細(xì)血管的通透性提高，減少前列腺素縮放，降低發(fā)熱反應(yīng)所需的介質(zhì)，起到降溫作用，能夠使病毒對(duì)皮膚的損傷減小，還能減輕因組胺所致的水腫、出血等癥狀［7-8］。另外，西咪替丁的主要吸收部位為消化道上端，藥物并未完全釋放，降低生物利用度。故準(zhǔn)確檢測(cè)西咪替丁片含量及其有關(guān)物質(zhì)和含量對(duì)于臨床治療方案的制定至關(guān)重要。

紫外-可見(jiàn)分光光度法、色譜-質(zhì)譜法、流動(dòng)注射-抑制化學(xué)發(fā)光法等常用的藥物含量檢測(cè)方式，均存在一定局限性，如紫外-可見(jiàn)分光光度法敏感度低。色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)設(shè)備昂貴，難以在基層醫(yī)院推廣。流動(dòng)注射-抑制化學(xué)發(fā)光法操作繁瑣等［9-10］。HPLC 法是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，用高壓輸液系統(tǒng)將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的緩沖液、混合溶劑等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，分離柱內(nèi)各成分后置入檢測(cè)器實(shí)施檢測(cè)，最終分析試樣，已成為工業(yè)、農(nóng)學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)［11-13］。HPLC 法系統(tǒng)的組成主要包括高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱及檢測(cè)器，其中高壓輸液系統(tǒng)是由脫氣裝置、貯液罐、過(guò)濾器、高壓輸液泵及梯度洗脫裝置組成，貯液罐位置需高于泵體，維持良好輸液靜壓差，且使用過(guò)程中需密閉，避免蒸發(fā)所致流動(dòng)相組成變化，且能阻止氣體進(jìn)入。脫氣裝置則能夠幫助流動(dòng)相使用前唾棄，避免進(jìn)入系統(tǒng)低壓部分后逸出氣泡，從而確保柱分離效率，降低對(duì)檢測(cè)器靈敏度的影響。高壓輸液泵則為關(guān)鍵部件，能夠完成流動(dòng)相輸送，此外進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器均具有重要作用，多部件組成的高效液相色譜儀方可獲得選擇性好、分離效能高、分析速度快、適用范圍廣等特點(diǎn)，且兼具分離及分析功能，可實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)檢測(cè)。本研究中，西咪替丁與有關(guān)物質(zhì)分離好，其與周?chē)挠嘘P(guān)物質(zhì)峰分離度＞9。濃度范圍在4.928～123.2 μg/mL，線(xiàn)性關(guān)系良好，r=0.999 8。加樣平均回收率為99.9%。測(cè)定西咪替丁檢測(cè)限與定量限分別為1.035 μg/mL、5.136 μg/mL，提示HPLC 法檢測(cè)敏感度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于檢測(cè)西咪替丁片的含量與有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。HPLC 法分析原理在于能夠改變流動(dòng)相極性，使得樣品各組成在最佳條件下分離，且分離過(guò)程與其他色譜一樣，也需溶質(zhì)在固定相、流動(dòng)相間進(jìn)行多次連續(xù)交換，借助溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、吸附力、親和力或分子大小不同引起的排阻作用差來(lái)分離不同溶質(zhì)［15-16］。HPLC 法檢測(cè)具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：分析速度快、載液流速快，一般分析一個(gè)樣本所需15～30 min，部分樣本可在5 min 內(nèi)完成，速度明顯高于經(jīng)典液體色譜法速度。分離效能高，可經(jīng)選擇流動(dòng)相、固定相，以達(dá)到最佳分離效果，遠(yuǎn)高于氣相色譜及工業(yè)精餾塔的分離效能［17］。紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01 ng，進(jìn)樣量在μL 數(shù)量級(jí)，敏感度較高?？煞治?0%以上的有機(jī)化合物，尤其能夠分離大分子、高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、強(qiáng)極性等化合物的分離，應(yīng)用范圍廣。色譜柱可反復(fù)使用、樣品量少、容易回收。

綜上所述，HPLC 法檢測(cè)具有快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測(cè)西咪替丁片的含量與有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。