草珊瑚不同提取物抗氧化活性比較研究

楊云成 武文豪 唐守春 王 慶 肖逸飛 李丹丹，3* 王華磊，3

（1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)農(nóng)業(yè)科技園區(qū)建設(shè)服務(wù)中心，貴州貴陽(yáng) 550018；3貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025）

自由基是人體組織中一類(lèi)中間代謝產(chǎn)物，過(guò)量時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和組織氧化損傷，影響其代謝功能，加速衰老并引發(fā)疾病?？寡趸瘎┲饕ㄟ^(guò)清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，防止氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞的損害[1]。作為天然抗氧化劑的植株提取物，因具有毒副作用小、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究熱點(diǎn)之一[2]。

草珊瑚又名腫節(jié)風(fēng)，屬金粟蘭科（Chloranthaceae）植物草珊瑚（Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai）干燥全草，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)。草珊瑚始載于《本草拾遺》，自1977年以來(lái)一直被《中國(guó)藥典》收錄，具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，主治血熱發(fā)斑發(fā)疹、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等癥[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，草珊瑚具有抗菌、消炎、抗腫瘤、抗病毒及促進(jìn)骨折愈合等作用[4-6]。經(jīng)化學(xué)成分研究，草珊瑚中主要含有黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、酚酸類(lèi)、香豆素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等活性成分[7]。黃明菊等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地草珊瑚藥材均有較好的抗氧化活性，但不同產(chǎn)地間抗氧化活性存在較大差異。針對(duì)草珊瑚不同提取物抗氧化活性研究尚未報(bào)道。本試驗(yàn)采用不同溶劑提取草珊瑚，并對(duì)不同草珊瑚提取物抗氧化活性進(jìn)行比較，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用草珊瑚提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用草珊瑚為2020年采收于貴州省榕江縣水尾鄉(xiāng)。將草珊瑚莖和葉片分離，然后烘干至恒重，粉碎成粉樣，過(guò)3號(hào)篩，備用。

主要試驗(yàn)儀器有101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、FW-100型粉樣機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、CP224S型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）、Multiskan GO型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

主要試劑有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2′-聯(lián)胺-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2，4，6-三吡啶基三嗪 （TPTZ）（美國(guó) Sigma 公司）；乙醇、乙酸乙酯、VC等均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同提取物樣品制備。分別稱(chēng)取草珊瑚莖、葉片干燥粉末樣品50 g于1 L圓底燒瓶中，按照料液比1∶10分別加入45%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯和水進(jìn)行回流提取2 h，重復(fù)提取3次。待冷卻至室溫后過(guò)濾，合并濾液并濃縮，分別用圓底燒瓶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，4℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí)，用各提取溶劑復(fù)溶配制成不同濃度的溶液。

1.2.2 抗氧化活性測(cè)定。①DPPH自由基清除。參照文獻(xiàn)[9]方法，用無(wú)水乙醇配制成0.1 mg/mL DPPH溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別吸取100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和100 μL DPPH溶液于96孔酶標(biāo)板中，37℃條件下避光孵育30 min，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，平行操作3次，在517 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，平均值記作A；以 75%乙醇 100 μL和 100 μL DPPH溶液混勻后在517 nm處測(cè)定的吸光度作對(duì)照，記作A0；空白為各樣品溶液100 μL和75%乙醇 100 μL均勻混合后在517 nm處測(cè)定的吸光度，記作B。DPPH自由基清除率（%）=[1-（A-B）/A0]×100。 將不同濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，下同。②ABTS自由基清除。參照文獻(xiàn)[10]配制ABTS工作液。參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行ABTS的清除活性測(cè)定。分別吸取40 μL樣品溶液和160 μL ABTS工作液于96孔酶標(biāo)板中，混勻后在37℃下孵育6 min，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，平行操作3次，于734 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度，取平均值記作A1?？瞻滋幚硪?5%乙醇代替供試樣品溶液加入ABTS工作液，測(cè)得吸光度，記作A0。ABTS自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100。③FRAP 鐵離子還原能力。參照文獻(xiàn)[12]配制FRAP工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。參照文獻(xiàn)[13]繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。鐵離子還原能力測(cè)定：分別吸取30 μL不同質(zhì)量濃度的草珊瑚提取物溶液和180 μL FRAP工作液于96孔酶標(biāo)板中，搖勻后37℃反應(yīng)30 min，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，平行操作3次，用酶標(biāo)儀在593 nm測(cè)定其吸光度。將75%乙醇代替供試樣品溶液加入FRAP工作液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到相應(yīng)FeSO4當(dāng)量（μmol/L）為 FRAP 值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，用Excel 2007進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除活性

由圖1可知，草珊瑚莖和葉的不同提取物與VC溶液的DPPH自由基清除活性存在較大差異。在一定濃度范圍內(nèi)，草珊瑚不同提取物對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)出隨提取物濃度升高而升高的趨勢(shì)，且存在一定的線(xiàn)性關(guān)系（表1、2）。經(jīng)計(jì)算，草珊瑚莖45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的IC50分別為0.288、0.113、0.116、0.474、1.900 mg/mL，草珊瑚葉 45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的IC50分別為0.141、0.263、0.248、0.453、0.741 mg/mL，不同提取物IC50差異均顯著。VC溶液的DPPH自由基清除率的IC50為0.021 mg/mL。由于IC50值越小，各提取物對(duì)DPPH自由基清除率越高。因此，在各提取物中，草珊瑚莖提取物對(duì)DPPH自由基清除率表現(xiàn)為75%乙醇提取物＞95%乙醇提取物＞45%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物；草珊瑚葉提取物對(duì)DPPH自由基清除率表現(xiàn)為45%乙醇提取物＞95%乙醇提取物＞75%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物。草珊瑚不同組織的提取物中，莖以75%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除率最高，活性最強(qiáng)，其次是95%乙醇提取物；葉以45%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除率最高，活性最強(qiáng)，其次是95%乙醇提取物。

表1 草珊瑚莖不同提取物DPPH自由基清除率的IC50

表2 草珊瑚葉不同提取物DPPH自由基清除率的IC50

2.2 ABTS自由基清除活性

如圖2所示，草珊瑚不同提取物均表現(xiàn)出良好的ABTS自由基清除活性，在一定濃度范圍內(nèi)有明顯的量-效關(guān)系（表3、4）。草珊瑚莖45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的 IC50分別為 0.281、0.235、0.254、0.530、0.219 mg/mL，草珊瑚葉45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的 IC50分別為 0.283、0.200、0.057、0.184、0.124 mg/mL，VC溶液ABTS自由基清除率的IC50為0.035 mg/mL?？梢?jiàn)，在ABTS抗氧化評(píng)價(jià)體系中，草珊瑚莖提取物活性順序是水提取物＞75%乙醇提取物＞95%乙醇提取物＞45%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物；草珊瑚葉提取物活性順序是95%乙醇提取物＞水提取物＞乙酸乙酯提取物＞75%乙醇提取物＞45%乙醇提取物。

表3 草珊瑚莖不同提取物ABTS自由基清除率的IC50

表4 草珊瑚葉不同提取物ABTS自由基清除率的IC50

2.3 FRAP鐵離子還原能力

從圖3可以看出，各提取物的Fe3+還原能力均低于同濃度的陽(yáng)性對(duì)照。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各提取物Fe3+還原能力隨各提取物濃度的升高而增大，且呈現(xiàn)一定線(xiàn)性關(guān)系，所有線(xiàn)性回歸方程R2值均＞0.9，表明方程的擬合度很高（表5、6）。通過(guò)計(jì)算各回歸方程斜率k，其中草珊瑚莖45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的斜率 k分別為 195.53、459.26、209.76、150.30、195.95 mg/mL，草珊瑚葉45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的斜率k分別為204.13、134.23、207.81、125.30、388.76 mg/mL，VC溶液對(duì)照品的還原線(xiàn)性方程斜率k為1 633.70。朱萱萱等[14]研究結(jié)果表明，k值越大，鐵離子還原能力越強(qiáng)，即抗氧化活性越強(qiáng)。因此，通過(guò)k值可以判斷，草珊瑚莖提取物活性順序是75%乙醇提取物＞95%乙醇提取物＞水提取物＞45%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物；草珊瑚葉提取物活性順序是水提取物＞95%乙醇提取物＞45%乙醇提取物＞75%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物。

表5 草珊瑚莖不同提取物鐵離子還原能力

表6 草珊瑚葉不同提取物鐵離子還原能力

2.4 草珊瑚不同提取物抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)

不同抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的反應(yīng)原理和條件存在差異，所以使用不同方法測(cè)定得到的抗氧化活性結(jié)果并不完全一致。參照馬艷芝[15]研究方法，使用隸屬函數(shù)法對(duì)草珊瑚不同提取物的抗氧化活性進(jìn)行綜合比較。從表7、8可以看出，草珊瑚莖不同提取物中，抗氧化隸屬函數(shù)均值以75%乙醇提取物最高，為0.977，抗氧化活性最強(qiáng)，乙酸乙酯提取物隸屬函數(shù)均值最低，為0.326，抗氧化活性最弱；草珊瑚葉不同提取物中，抗氧化隸屬函數(shù)均值以95%乙醇提取物最高（0.701），抗氧化活性最強(qiáng)，乙酸乙酯提取物隸屬函數(shù)均值為最低（0.314），抗氧化活性最弱。

表7 草珊瑚莖不同提取物抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)值

表8 草珊瑚葉不同提取物抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)值

3 討論

因呼吸、環(huán)境污染、射線(xiàn)等因素，人體內(nèi)必定不斷產(chǎn)生自由基，大量的氧自由基會(huì)引起氧化損傷。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，生物體衰老、免疫性疾病，甚至癌變等都與自由基過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)。抗氧化主要是指抗氧化自由基[16]。天然抗氧化劑由于自身的優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。已有研究表明，秋葵[17]、石斛[18]、桔梗[19]等許多天然植物材料均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

黃明菊等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地草珊瑚藥材均有較好的抗氧化活性，在研究中通過(guò)不同溶劑提取草珊瑚不同組織，并采用DPPH和ABTS自由基清除活性測(cè)定、鐵離子還原能力測(cè)定等3種方式對(duì)草珊瑚不同提取物進(jìn)行抗氧化活性比較，均顯示草珊瑚不同提取物具有抗氧化活性，該結(jié)果也證實(shí)草珊瑚具有抗氧化活性。在各抗氧化評(píng)價(jià)方法中，DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果顯示，草珊瑚莖75%乙醇提取物活性最強(qiáng)，葉45%乙醇提取物活性最強(qiáng)；ABTS自由基清除率測(cè)定結(jié)果顯示，草珊瑚莖水提取物活性最強(qiáng)，葉95%乙醇提取物活性最強(qiáng)；FRAP法測(cè)定結(jié)果顯示，草珊瑚莖75%乙醇提取物活性最強(qiáng)，葉水提取物活性最強(qiáng)?？梢园l(fā)現(xiàn)，在對(duì)草珊瑚不同提取物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)中，因采用評(píng)價(jià)方式不同，最終得到的抗氧化活性結(jié)果并不完全一致。馬艷芝[15]用不同測(cè)定方法測(cè)定同種柴胡抗氧化活性時(shí)，最終也表現(xiàn)出不同測(cè)定方法間柴胡的抗氧化能力存在一定差異。

為綜合比較草珊瑚不同提取物抗氧化活性，在研究中采用了隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示草珊瑚不同組織提取物均以乙酸乙酯提取物抗氧化活性最弱。然而，在天然植物或微生物提取物抗氧化研究中，常發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物抗氧化活性較高，如朱萱萱等[14]發(fā)現(xiàn)金櫻根部位提取物的乙酸乙酯抗氧化活性最強(qiáng)，蘇天驕等[20]在瓦布貝母內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性研究中，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的抗氧化活性較強(qiáng)。研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物抗氧化活性弱，推測(cè)可能在采用乙酸乙酯對(duì)草珊瑚進(jìn)行提取時(shí)，主要提取得到揮發(fā)油類(lèi)成分，而試驗(yàn)過(guò)程中旋干濃縮步驟造成大量具有抗氧化活性的揮發(fā)油類(lèi)成分揮發(fā)掉。黃酮類(lèi)化合物是草珊瑚中最主要的活性成分之一。徐 耀等[21]采用75%乙醇提取草珊瑚并經(jīng)純化得到黃酮類(lèi)提取物，且研究發(fā)現(xiàn)該類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，采用DPPH自由基清除法測(cè)定，20 μg/mL草珊瑚黃酮提取物清除率達(dá)到39.2%，并強(qiáng)于VC。郁建生等[22]采用沸水提取及乙醇浸提2種工藝開(kāi)展草珊瑚總黃酮提取研究發(fā)現(xiàn)，乙醇提取法草珊瑚總黃酮得率高，是沸水提取法的3.25倍[22]。在研究中同樣也用到了乙醇溶液和水對(duì)草珊瑚進(jìn)行提取，在抗氧化活性綜合表現(xiàn)方面，草珊瑚莖75%乙醇提取物抗氧化活性最強(qiáng)，葉95%乙醇提取物抗氧化活性最強(qiáng)，均高于草珊瑚水提取物，該結(jié)果也間接證明采用乙醇溶液進(jìn)行草珊瑚提取有利于提取黃酮類(lèi)成分并增強(qiáng)提取物的抗氧化活性。此外，莖和葉提取物的抗氧化活性存在差異，推測(cè)應(yīng)該與不同組織間有效成分含量存在差異有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究采用45%乙醇溶液、75%乙醇溶液、95%乙醇溶液、乙酸乙酯及水等溶劑分別對(duì)草珊瑚莖和葉進(jìn)行提取，并對(duì)各提取物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，草珊瑚不同提取物均有一定的抗氧化活性，且在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的量—效關(guān)系。DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果顯示，草珊瑚莖75%乙醇提取物活性最強(qiáng)，葉45%乙醇提取物活性最強(qiáng)；ABTS自由基清除率測(cè)定結(jié)果顯示，草珊瑚莖水提取物活性最強(qiáng)，葉95%乙醇提取物活性最強(qiáng)；FRAP法測(cè)定結(jié)果顯示，草珊瑚莖75%乙醇提取物活性最強(qiáng)，葉水提取物活性最強(qiáng)。隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)結(jié)果表明，草珊瑚莖75%乙醇提取物抗氧化活性最強(qiáng)，草珊瑚葉95%乙醇提取物抗氧化活性最強(qiáng)，可作為天然抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。在下一步研究中可針對(duì)乙醇溶液提取草珊瑚結(jié)合抗氧化活性測(cè)定進(jìn)行優(yōu)化，研究草珊瑚抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。