UPLC法測定消炎止痛膏巴布膏劑中咖啡酸的含量

李 祥，安雅婷，周 淼

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

消炎止痛膏（津藥制字Z20070286號）是天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院院內制劑，其處方組成包括木瓜、大黃、醋乳香、醋沒藥、蒲公英等7味中藥。消炎止痛膏為外用軟膏劑，涂敷于跌打損傷及瘡瘍腫毒處，可發(fā)揮活血散瘀、清熱消腫止痛的功效［1-2］。蒲公英被譽為“天然抗生素”，有廣譜殺菌和抑菌作用，與酚酸類物質有一定關系［3］?？Х人崾瞧压⒌闹饕煞种?，是一種酚酸類化合物，為黃色晶體，微溶于冷水，易溶于熱水及冷乙醇，能吸收紫外線?？Х人嵊休^廣泛的抑菌和抗病毒活性，也是消炎止痛膏發(fā)揮藥效的主要活性成分。消炎止痛膏雖然臨床上已取得較好的治療效果，但該劑型使用不方便。消炎止痛膏巴布膏劑將消炎止痛膏原劑型的缺點進行改進，不僅能使藥物有效成分透皮快速吸收，提高生物利用度，增強療效，而且攜帶方便，更有利于患者的使用，可提高用藥依從性。為使消炎止痛膏在臨床上發(fā)揮更好療效，延長釋藥時間，控制藥物進入體內的速率，維持平穩(wěn)的血藥濃度，減少皮膚的刺激，根據中醫(yī)藥特色理論，結合現(xiàn)代制劑手段，可將傳統(tǒng)中藥膏劑消炎止痛膏制備成巴布膏劑。本文對消炎止痛膏巴布膏劑中咖啡酸含量測定方法進行研究。

1 儀器與試劑

1.1 設備儀器ACQUITY UPLCTM I-Class System超高效相色譜儀（美國Waters公司），HWS-150B恒溫恒濕培養(yǎng)箱（中國北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），Smart2Pure超純水儀（美國賽默飛公司），WGLL-125BE鼓風干燥箱（中國天津泰斯特公司），Sorvall Legend Micro 21微量離心機（美國賽默飛公司），AS62.R2十萬分之一天平（波蘭RADWAG公司），渦旋儀（中國江蘇天翎儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 大黃（批號121200401，產地：青海，購于北京宏濟藥業(yè)有限公司），蒲公英（批號21051511，產地：甘肅省天水市，購于安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司），木瓜（批號388210401，產地：安徽，購于北京宏濟藥業(yè)有限公司），梔子［4］（批號585210401，產地：浙江，購于北京宏濟藥業(yè)有限公司），土鱉蟲（批號2101012-01，產地：江蘇，購于天津中藥飲片廠有限公司），乳香（批號201203207，產地：埃塞俄比亞，購于天津市中藥飲片廠有限公司），沒藥（批號2012068-03，產地：索馬里，購于天津市中藥飲片廠有限公司），上述藥材經天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院孫浩主任中藥師鑒定、藥檢室檢測均符合《中國藥典》2020年版［5］及《天津市中藥炮制規(guī)范》2018版［5］的要求；咖啡酸對照品（批號110885-201703，中國食品藥品檢定研究院）；酒石酸（批號150722）、甘羥鋁（批號150514）、EDTA（批號150616）均為藥用（上海森磊化工有限公司）；二氯甲烷、鹽酸、甲醇、甲酸等均為分析純，乙腈為色譜純（天津康科德科技有限公司），水為超純水（自制）。消炎止痛膏巴布膏劑樣品為本院制劑室提供（批號001、002、003）。

2 處方組成及制法

2.1 處方組成 本制劑由大黃、土鱉蟲、蒲公英、梔子、木瓜、醋乳香、醋沒藥7味飲片提取液及酒石酸、甘油、AP-800、甘羥鋁、EDTA等組成。

2.2 制法 上述7味飲片1 647 g，加適量水浸泡，分別加8倍量的水，煎煮3次，每次煎煮2 h，合并煎液，過濾，濃縮至規(guī)定相對密度，冷卻。加入酒石酸等5種輔料約310 g至溶，攪拌至糊狀，制成1 000 g膏體。傾至背襯上，并覆蓋上壓花膜，滾壓至約1.5~2 mm厚，固化，剪切成每塊為5 cm×10 cm的成品。每貼含膏量為20 g。

3 含量測定方法研究

3.1 溶液的制備

3.1.1 供試品溶液制備 取樣品1片，除去蓋襯，置于錐形瓶中，加入25 ml 8%鹽酸，超聲10 min，二氯甲烷萃取3次，每次25 ml，合并二氯甲烷層，水浴蒸干，甲醇溶解殘渣并轉移至50 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，用0.22 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液備用。

3.1.2 對照品溶液制備 精密量取咖啡酸對照品，加甲醇定容至5 ml量瓶中，制得對照品溶液濃度為1.02 mg/ml。

3.1.3 陰性樣品溶液制備 取不含蒲公英的巴布膏劑，按“3.1.1”項下方法制備。

3.2 色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫：45℃；樣品室溫度：4℃；進樣體積：2 μl；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序如表1所示；流速：0.3 ml/min；檢測波長：320 nm。

表1 梯度洗脫程序

3.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密量取對照品、供試品和陰性樣品溶液各2 μl，按“3.2”項下色譜條件進行測定，對照品的理論塔板數不低于5 000。在此色譜條件下，咖啡酸色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度大于1.5，對稱因子在0.95~1.05之間，咖啡酸與其他成分可以有效地進行分離，陰性樣品對測定無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）UPLC色譜圖

3.4 線性試驗 精密量取“3.1.2”項下對照品溶液，將其稀釋為不同濃度梯度的標準溶液。吸取各2 μl注入色譜柱，按“3.2”項下色譜條件進行測定，以濃度為X軸，峰面積為Y軸繪制標準曲線。線性回歸方程為Y=36 652.543 1 X-5 463.025 4（r=0.999 9）。在0~70 μg/ml濃度范圍內線性關系良好。

3.5 精密度試驗 精密吸取“3.1.2”項下對照品溶液，按“3.2”項下色譜條件重復進樣6次，每次1 μl，峰面積RSD值為0.2%，表明精密度良好。

3.6 重復性試驗 精密吸取同一批樣品（批號003），制備供試品溶液，平行6份，處理后分別進樣5 μl測定，RSD值為1.02%，表明該方法重復性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗 將供試品溶液及對照品溶液分別于室溫下放置0、6、12、18和24 h時進行檢測，記錄峰面積。結果顯示供試品溶液中咖啡酸色譜峰面積的RSD為1.24%，對照品溶液中咖啡酸色譜峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液及對照品溶液于室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

3.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的樣品（批號003）共6份，精密加入對照品溶液（156.4 μg/ml）1 ml，制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，平均回收率為88.04%，RSD值為2.95%，見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

3.9 含量測定 取3批樣品各1貼按“3.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“3.2”項下色譜條件分別進樣分析，記錄咖啡酸色譜峰面積，將峰面積代入標準曲線計算各批次樣品含量，咖啡酸含量見表3。

表3 消炎止痛膏巴布膏劑含量

3.10 檢測限度 根據前期研究及轉移率的試驗結果，按測定平均含量的80%計算，每貼含咖啡酸不得少于0.62 mg。

4 討論

4.1 測定方法 本文對消炎止痛膏巴布膏劑中咖啡酸含量測定方法進行研究。UPLC方法與傳統(tǒng)的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）相比，具有高分離度、高速度以及高靈敏度的優(yōu)勢，其色譜柱填料粒徑更?。?.7 μm）、檢測器采樣速度更快。在本試驗中，使用UPLC可提高分離度、改善峰形，且能夠提高樣品分析效率。

4.2 色譜條件篩選 本研究采用UPLC方法建立咖啡酸含量測定方法，經過優(yōu)化不同色譜柱型號（BEH C18、BEH shield RP18、CSH C18）、不同流動相體系（甲醇-水、乙腈-水）、不同柱溫（30、35和40℃）、不同流速（0.3和0.4 ml/min）等色譜條件，結果顯示前文所述條件為最佳色譜條件，可以滿足咖啡酸含量測定的分離檢測要求。

4.3 樣品提取 巴布貼劑中由于基質具有一定的黏性，對樣品的提取方法具有一定要求，經文獻調研發(fā)現(xiàn)，目前采用的提取方法有以甲醇等有機試劑進行加熱回流提取或超聲提取?？Х人崾且环N有機酸，屬于酚酸類化合物，有較廣泛的抑菌和抗病毒活性，微溶于冷水，易溶于熱水及冷乙醇。本項目綜合考慮咖啡酸理化性質，最終采用的是甲醇超聲方法提取巴布膏劑中指標成分，加樣回收率結果顯示該方法滿足相關要求。

4.4 回收率試驗 研究結果顯示平均回收率為88.04%，按照《中國藥典》2020年版［6］四部分析方法指導原則中數據要求規(guī)定，樣品中待測定成分含量和回收率限度關系，在基質復雜組分含量低于0.01%及多成分等分析中，可適當放寬回收率限度?；|處方中AP-800、甘羥鋁、EDTA、甘油對處方的影響較大。AP-800是構成巴布膏劑親水性凝膠骨架形體的基本物質，是一種優(yōu)質的巴布膏劑骨架材料，其聚丙烯酸和聚丙烯酸鈉的比例相等，黏度、分子鏈長度、交聯(lián)程度和pH等適中。研究表明，甘羥鋁中的Al3+與AP-800中的羧基交聯(lián)形成交聯(lián)型基質，交聯(lián)速度適中，有利于巴布膏劑的制備和涂布。甘油為保濕劑。螯合劑EDTA可控制交聯(lián)反應程度，增強巴布膏劑的保濕性及黏附性。因為提取物中化學成分復雜，含有倍半萜內酯、糖類、三萜類、有機酸、生物堿類、黃酮等，其復雜的化學成分與空白基質中的Al3+、羧基、螯合劑EDTA等產生反應，導致膏體黏性變大，內聚力減小。本制劑為中藥制劑，組分多且基質成分具有吸附性及不易洗脫等因素，同時實際樣品測定中每克膏體中含咖啡酸約38 μg/g，因此按照《中國藥典》規(guī)定要求回收率可在80%~115%之間。