玉米ZmICS1和ZmSARD1的原核表達及多克隆抗體制備

上官曉慶，張春霞，趙天永

(西北農林科技大學 生命科學學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

水楊酸(salicylic acid，SA)是植物抵抗細菌、真菌、病毒，誘導防御相關基因表達，建立局部和系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)所必需的一種防御激素[1-3]。擬南芥90%防御相關的SA來源于異分支酸途徑[4-5]。作為異分支酸途徑的限速酶，異分支酸合成酶1(isochorismate synthase 1，ICS1)是一個定位于質體的基質蛋白，負責催化分支酸轉化為異分支酸，在免疫反應中起重要作用[6]。擬南芥ICS1(sid2)突變后，內源SA含量顯著降低，感染部位及遠端葉片的免疫反應受到抑制，植株對白粉病菌和丁香假單胞桿菌敏感[5]。低溫處理可通過水楊酸依賴途徑激活擬南芥的抗病性[7]。16 ℃時野生型病原體的生長量較22 ℃明顯減少，出現(xiàn)了抗病性增強的表型，而在SA突變體pad4和ICS1突變體sid2中，則未表現(xiàn)出低溫增強植物免疫力的現(xiàn)象[8]。ICS1也在非生物脅迫中發(fā)揮一定作用。在大麥中過表達HvICS1，植株的耐旱性增強，具體表現(xiàn)為內源ABA含量及抗氧化酶活力升高[9]。同樣，大麥HvICS1過表達植株也由于根系鈉、鉀離子通量增加及抗氧化酶活性升高表現(xiàn)出更強的耐鹽性[10]。但也有研究表明，在高溫和干旱的共同作用下sid2反而呈現(xiàn)出抗逆性增強的表型，這可能是由于sid2植株在高溫和干旱條件下可通過維持光合、關閉氣孔和積累可溶性糖來阻止水分的過量流失[11]。

SAR 缺陷1(SAR deficient 1，SARD1)是植物防御反應的主要調節(jié)因子。在病原菌侵染時，擬南芥SARD1受誘導合成后結合到ICS1啟動子區(qū)激活ICS1轉錄，啟動局部抗性[12]。同時，SARD1還調控SAR移動信號(N-hydroxypipecolic acid，NHP)的合成， NHP可在葉片中積累以抵御局部微生物侵染，并誘導遠端葉片SAR反應，從而抵御多種病原菌[13]。研究表明，敲除SARD1會降低基礎抗性及系統(tǒng)獲得性抗性，過表達SARD1則會積累更多SA，激活防御反應[1]。

為研究ICS1和SARD1在玉米中的生物學功能，本研究對ZmICS1、ZmSARD1進行誘導表達，以His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重組蛋白為抗原，分別制備ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗體，并檢測玉米過表達ZmICS1、ZmSARD1原生質體中ZmICS1、ZmSARD1蛋白的表達水平，驗證抗體特異性，以期為玉米抵抗生物脅迫機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株、載體及動物 三葉期B73葉片cDNA、大腸桿菌克隆菌株2984和表達菌株Rosett-gami2(DE3)、原核表達載體pET-28a和真核表達載體pTF101.1-ZmICS1、pTF101.1-ZmSARD1、pTF101.1-GFP，均為本實驗室保存。制備抗體所用家兔由西北農林科技大學動物飼養(yǎng)場提供。

1.1.2 試 劑 Phanta Max高保真DNA聚合酶、TaqDNA 聚合酶、膠回收試劑盒、限制性內切酶、蛋白免疫印跡化學發(fā)光試劑盒(ELC)及HRP標記的羊抗兔抗體IgG，均購自康為世紀生物科技有限公司；弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨及四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine，TEMED)，均購自Biotopped；透析袋MD25(YA1071)，購自Solarbio。

1.1.3 主要溶液 (1)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS，pH 7.4)：磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.24 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)1.44 g，氯化鈉(NaCl)8 g，氯化鉀(KCl)0.2 g，加蒸餾水約800 mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH至7.4，最后定容到1 L。

(2)0.25 mol/L KCl：稱取18.6 g KCl，加蒸餾水溶解并定容到1 L，4 ℃保存。

(3)5×Tris-Gly：稱取15.1 g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，94 g甘氨酸(Gly)，5 g十二烷基硫酸鈉(SDS)，以800 mL蒸餾水溶解，最后定容至1 L。室溫保存，用前稀釋為1×Tris-Gly。

(4)轉移緩沖液：稱取Tris-base 5.8 g，Gly 2.9 g，SDS 0.37 g，以600 mL水溶解，溶解后加入200 mL無水乙醇，蒸餾水定容至1 L。

(5)TBST(TBS+Tween)：首先配制10×Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)，12.1 g Tris-base，40 g NaCl，以300 mL蒸餾水溶解，濃HCl調 pH至7.6，定容至500 mL。用前稀釋為1×TBS，加入1‰～2‰ Tween-20，混勻即為TBST。

1.2 方 法

1.2.1 原核表達載體的構建 從NCBI搜索玉米ZmICS1及ZmSARD1的CDS序列，根據pET-28a載體多克隆位點分別設計克隆引物。引物序列為ZmICS1-F：5′-ATGGGTCGCGGATCCATGCCGC-CACCGTCTTCCTCGC-3′，ZmICS1-R：5′-TGCGGCCGCAAGCTTGATCACCGTTCCCAGATTT-TC-3′；ZmSARD1-F：5′-ATGGGTCGCGGATCCATGGCGGCGAAGCGTCTGTACAAC-3′和ZmSAR-D1-R：5′-TGCGGCCGCAAGCTTACCTGGCATGT-GGAACGCTTGG-3′(下劃實線部分為BamH Ⅰ的酶切位點，下劃虛線部分為Hind Ⅲ的酶切位點)。

以B73葉片cDNA為模板進行ZmICS1、ZmSARD1片段擴增，反應體系(50 μL)為：Phanta Max緩沖液(2×)25 μL、Phanta Max高保真DNA聚合酶1 μL、dNTP(10 mmol/L) 1 μL、50%二甲基亞砜4 μL、正反向引物(10 μmol/L)各2 μL、模板cDNA 3 μL、無菌雙蒸水12 μL。 擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸8 min。用1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物，割取目的條帶并用膠回收試劑盒回收。再用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切pET-28a載體，使之線性化。隨后將回收的目的片段與線性化的pET-28a載體于37 ℃連接30 min，連接產物用KCM法轉化大腸桿菌2984感受態(tài)細胞，并挑取陽性菌落提取質粒進行酶切，驗證片段與載體是否連接成功。最后將酶切驗證正確的質粒分別命名為pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1,并送生工生物有限公司測序，測序正確后即可進行重組蛋白His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1的誘導表達。

1.2.2 重組蛋白的誘導及純化 將原核表達載體pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1載體分別轉化大腸桿菌Rosett-gami2(DE3)，分別挑取陽性克隆菌株至含50 mg/mL卡那霉素的30 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min培養(yǎng)5 h至OD600為0.6，然后加入0.84 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37 ℃，160 r/min誘導12 h。收集誘導前后的菌液并離心，用PBS重懸誘導前后的菌體，并用SDS-PAGE電泳檢測蛋白是否誘導成功。

成功檢測到誘導的目的蛋白后，以相同的條件大量誘導，收集誘導后菌液，在冰浴條件下超聲破碎30 min(功率30%，工作3 s，休息4 s)后，4 ℃、12 000×g離心20 min，分別收集上清液和沉淀，用SDS-PAGE檢測誘導前菌體及誘導后上清液和沉淀中目的蛋白的表達情況。對收集的誘導后蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，電泳結束后用預冷的0.25 mol/L KCl對膠進行負染，割取目標蛋白所在膠條，放入透析袋中，加入少量1×Tris-Gly，100 V電泳純化2 h。將獲得的純化蛋白分別命名為His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1。用不同質量濃度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL)牛血清蛋白(BSA)檢測純化蛋白的質量濃度和純度。

1.2.3 多克隆抗體的制備及驗證 將純化的His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重組蛋白分別作為抗原，免疫4次家兔制備抗體(皮下注射6個點，脊椎兩側各3個點)。初次免疫抗原量200 μg/只兔子，抗原與完全弗氏佐劑按照1∶1體積比(500 μL蛋白+ 500 μL完全弗氏佐劑)混勻，振蕩乳化2 h，對家兔脊椎兩側皮下多點注射。之后每隔2周加強免疫1次，抗原量為100 μg/只兔子；抗原與不完全弗氏佐劑按照1∶1體積比混勻，振蕩乳化2 h，對家兔脊椎兩側皮下多點注射。4次免疫結束后7 d內抽取家兔心臟血，37 ℃靜置1 h，凝血后4 ℃靜置過夜，次日離心收集上清液(4 ℃，1 000×g離心5 min)，存于-20 ℃，每管分裝200 μL。

將純化的抗原分別進行梯度稀釋，各取30，3，0.3 ng蛋白進行SDS-PAGE。電泳結束后按負極、海綿墊、濾紙2張、膠、PVDF膜、濾紙2張、海綿墊、正極的順序放入裝滿轉移緩沖液的電泳槽中進行轉膜。轉膜結束后取出PVDF膜，用50 g/L的封閉液(即0.5 g脫脂奶粉于10 mL TBST)室溫封閉2 h后，用相應一抗Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1(將一抗與封閉液按照1∶5 000體積比稀釋)孵育過夜， TBST洗膜3次，每次5 min，再用HRP標記的羊抗兔抗體IgG(稀釋比例1∶20 000)孵育2 h，TBST洗膜3次，最后用化學發(fā)光試劑盒(ECL)處理后拍照觀察。 用Image J對膠圖進行灰度分析，確定His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1質量濃度。

1.2.4 多克隆抗體的檢測 (1)玉米過表達原生質體的制備。PEG介導的玉米原生質體轉化法參考Lei等[14]的方法。取10片三葉期B73葉片酶解，離心并洗脫，加1 mL MMg溶液(15 mmol/L MgCl2，質量分數0.1% MES，0.4 mol/L mannitol)重懸細胞，各取300 μL細胞重懸液分別轉化pTF101.1-ZmICS1、pTF101.1-ZmSARD1和pTF101.1-GFP質粒30 μg，培養(yǎng)過夜后收取原生質體細胞，各加入40 μL蛋白提取液和10 μL 5×loading，沸水煮10 min,最終所得即為分別過表達ZmICS1和ZmSARD1及GFP的原生質體蛋白。

(2)Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1的蛋白免疫印跡檢測。取純化后的His×6-ZmICS1抗原、His×6-ZmSARD1抗原各3 ng，過表達GFP原生質體蛋白、過表達ZmICS1原生質體蛋白、過表達ZmSARD1原生質體蛋白各20 μg，按ZmICS1抗原、過表達GFP原生質體蛋白、過表達ZmICS1原生質體蛋白為一組；ZmSARD1抗原、過表達GFP原生質體蛋白、過表達ZmSARD1原生質體蛋白為一組進行SDS-PAGE電泳、蛋白免疫印跡檢測。

2 結果與分析

2.1 pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1原核表達載體的構建

以B73 葉片cDNA為模板，PCR擴增ZmICS1和ZmSARD1 CDS區(qū)，如圖1-A所示，ZmICS1 CDS區(qū)為1 689 bp，ZmSARD1 CDS區(qū)為1 314 bp，電泳結果與預測一致。

A.目的片段的擴增；B.重組質粒的酶切驗證；M.DNA分子標記；1.ZmICS1片段PCR擴增結果；2.ZmSARD1片段PCR擴增結果； 3.經BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切的pET-28a-ZmICS1質粒；4.經BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切的pET-28a-ZmSARD1質粒 A.Amplification of target fragment;B.Enzyme digestion validation of recombinant plasmid;M.DNA molecular markers; 1.PCR amplification of ZmICS1 fragment;2.PCR amplification of ZmSARD1 fragment;3.Plasmid pET-28a-ZmICS1 digested by BamHⅠ and Hind Ⅲ;4.Plasmid pET-28a-ZmSARD1 digested by BamHⅠ and Hind Ⅲ圖1 pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1原核表達載體的構建Fig.1 Construction of prokaryotic expression vectors pET-28a-ZmICS1 and pET-28a-ZmSARD1

將目的片段割膠回收后連接至pET-28a載體，用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切驗證其是否連接成功。重組質粒pET-28a-ZmICS1雙酶切產物應為1 689 bp的ZmICS1和5 343 bp的載體，pET-28a-ZmSARD1雙酶切產物應為1 314 bp的ZmSARD1和5 343 bp的載體。如圖1-B所示，酶切結果與預期一致，且測序正確，表明pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1原核表達載體構建成功。

2.2 重組蛋白的誘導及純化

將原核表達載體pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1分別轉入大腸桿菌Rosett-gami2(DE3)，37 ℃、0.84 mmol/L IPTG誘導蛋白12 h，取誘導前后菌液，通過SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況，結果如圖2所示。在65 ku和50 ku分別有誘導表達的His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重組蛋白，符合其理論大小，說明His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重組蛋白誘導成功。

1.His×6-ZmICS1蛋白；2.His×6-ZmSARD1蛋白 M.蛋白分子標記；-.誘導前的全菌蛋白；+.誘導后的全菌蛋白 1.His×6-ZmICS1 protein;2.His×6-ZmSARD1 protein;M.Protein molecular markers;-.Whole mycoprotein before induction;+.Induced whole mycoprotein

將誘導后的菌體進行超聲破碎，收集破碎后的上清液及沉淀，用SAD-PAGE檢測蛋白的可溶性，結果(圖3)表明，His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重組蛋白均以包涵體的形式存在。

1.His×6-ZmICS1蛋白；2.His×6-ZmSARD1蛋白;M.蛋白分子 標記；-.誘導前的全菌蛋白；S.誘導破碎后的上清液； P.誘導破碎后的菌體沉淀 1. His×6-ZmICS1 protein;2.His×6-ZmSARD1 protein; M.Protein molecular markers;-.Whole mycoprotein before induction;S.Supernatant after induction and fragmentation; P.Precipitate after induction and fragmentation

SDS-PAGE電泳后割取目的蛋白所在膠條并于透析袋中透析純化，以不同質量濃度BSA進行相對定量，檢測純化后目的蛋白質量濃度。經Image J 灰度分析可知，His×6-ZmICS1蛋白質量濃度為0.76mg/mL，His×6-ZmSARD1蛋白質量濃度為0.72 mg/mL，均達到免疫兔子所需質量濃度(≥0.4mg/mL)，可進行多克隆抗體制備(圖4)。

M.蛋白分子標記；1.His×6-ZmICS1蛋白；2.His×6-ZmSARD1蛋白； 3～8.0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL BSA M.Protein molecular markers;1.His×6-ZmICS1 protein;2.His×6- ZmSARD1 protein;3-8.0.1，0.2,0.4,0.6,0.8 and 1.0 mg/mL BSA圖4 His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1 純化蛋白質量濃度的檢測Fig.4 Mass concentrations of His×6-ZmICS1 and His×6-ZmSARD1 purified proteins

2.3 多克隆抗體的制備及驗證

將純化得到的His×6-ZmICS1和His×6-Zm-SARD1重組蛋白進行家兔免疫試驗，收集免疫后血清。將純化后的抗原His×6-ZmICS1、His×6-ZmSARD1進行梯度稀釋(30，3，0.3 ng)，用制備的多克隆抗體1∶5 000稀釋后進行蛋白免疫印跡檢測。結果(圖5)表明，多克隆抗體Anti-ZmICS1可檢測到3 ng His×6-ZmICS1重組蛋白，Anti-ZmSARD1則能檢測0.3 ng的His×6-ZmSARD1重組蛋白。

1～3.30，3，0.3 ng His×6-ZmICS1抗原；4～6.30，3，0.3 ng的His×6-ZmSARD1抗原 1-3.30,3,0.3 ng of His×6-ZmICS1 antigen;4-6.30,3,0.3 ng of His×6-ZmSARD1 antigen

2.4 多克隆抗體的檢測

取3 ng純化的抗原His×6-ZmICS1或His×6-ZmSARD1，20 μg過表達GFP原生質體蛋白，20 μg過表達ZmICS1或ZmSARD1原生質體蛋白，用多克隆抗體Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1分別進行免疫印跡檢測，結果(圖6)表明，Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1抗體1∶5 000稀釋后可分別檢測到3 ng的His×6-ZmICS1或His×6-ZmSARD1重組蛋白。過表達GFP的原生質體中能檢測到少量內源ZmICS1和ZmSARD1蛋白，在過表達ZmICS1、ZmSARD1原生質體中分別能檢測到ZmICS1蛋白(約62 ku)、ZmSARD1蛋白(約50 ku)大量積累，且蛋白大小均符合預期。說明多克隆抗體Anti-ZmICS1、Anti-ZmSARD1分別對玉米內源的ZmICS1、ZmSARD1蛋白有很好的特異性。

1.3 ng His×6-ZmICS1抗原；2，5.玉米葉肉原生質體中過表達GFP的總蛋白；3.玉米葉肉原生質體中過表達ZmICS1的總蛋白； 4.3 ng His×6-ZmSARD1抗原;6.玉米葉肉原生質體中過表達ZmSARD1的總蛋白 1.3 ng His×6-ZmICS1 antigen;2,5.Total protein of maize mesophyll protoplasm overexpressing GFP;3.Total protein of maize mesophyll protoplasm overexpressing ZmICS1;4.3 ng His×6-ZmSARD1 antigen;6.Total protein of maize mesophyll protoplasm overexpressing ZmSARD1圖6 ZmICS1(A)和ZmSARD1(B)多克隆抗體的特異性檢測Fig.6 Specific detection of ZmICS1(A) and ZmSARD1(B) proteins by Anti-ZmICS1 and Anti-ZmSARD1 polyclonal antibodies

3 討 論

SA信號途徑在雙子葉植物抗病中起著非常關鍵的作用[15-16]。研究表明，在病原菌侵染時，通過誘導SARD1上調ICS1表達，增加SA的積累和抗病相關基因的表達,可增強煙草對番茄花葉病毒[16-17]、擬南芥對紫丁香葉枯病菌[18]、丁香假單胞菌[19]以及蘋果對白僵菌[20]、灰霉病菌[21]的抗性。然而ICS1和SARD1在單子葉作物玉米中的功能尚有待研究。

為探究ZmICS1和ZmSARD1在玉米生物脅迫中的作用，本研究純化了His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重組蛋白，并免疫家兔制備了多克隆抗體，用不同質量濃度抗原檢測抗體效價時，多克隆抗體Anti-ZmICS1可檢測到3 ng重組蛋白，而Anti-ZmSARD1則能檢測到0.3 ng重組蛋白，可知Anti-ZmSARD1靈敏度更高，這是由于抗原不同，其免疫原性不同所致。為明確抗體特異性，本研究檢測了內源ZmICS1和ZmSARD1表達情況，正常條件下ZmICS1和ZmSARD1有著較低的積累量，維持著SA本底水平，與Sun等[22]的研究結果一致。在葉肉原生質體細胞中過表達ZmICS1和ZmSARD1后可檢測到較高積累量。這些結果表明，制備的Anti-ZmICS1和Anti-ZmSARD1多克隆抗體對玉米內源的目的蛋白有較好的特異性。

本研究制備ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗體，旨在檢測內源ZmICS1、ZmSARD1的表達水平、組織定位，闡明ZmICS1、ZmSARD1的生理功能，為玉米抵御生物脅迫作用機制的研究奠定了基礎。