大花黃牡丹二次枝對(duì)結(jié)實(shí)率的影響及胚珠敗育生理機(jī)制研究

陳庭巧,袁 濤,喬紅雍,徐 珂

(北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心,城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室, 園林環(huán)境教育部工程研究中心,林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

大花黃牡丹(Paeonialudlowii(Stern & G.Taylor)D.Y.Hong)為芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)肉質(zhì)花盤亞組(Subsect.Delavayanae)灌木，花黃色，一枝多花，觀賞價(jià)值和育種價(jià)值高[1-2]，其異交、自交親和，但結(jié)實(shí)率低[3]。芍藥屬牡丹組所有種均列入國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄，其中大花黃牡丹被列為二級(jí)[4]。

植物的花朵、果實(shí)與種子之間關(guān)系密切。花朵和果實(shí)的數(shù)量以及它們?cè)跁r(shí)間和空間上的聚集方式會(huì)影響傳粉者的吸引力和資源分配，從而影響生殖的成功率[5]。已有研究指出，過多的花會(huì)影響種子和果實(shí)形成[6-7]。如在盛花期對(duì)黃花草木樨(Melilotusofficinalis)進(jìn)行疏花處理能明顯降低資源競(jìng)爭(zhēng)，增加子房中的胚珠數(shù)[8]。另外，果實(shí)在花序上的位置對(duì)熱帶低地半落葉林中7種自交不親和樹種敗育有顯著影響，某些位置果實(shí)和種子敗育的概率高于其他位置[9]。大花黃牡丹一枝多花，在當(dāng)年花枝/果枝上形成二次枝，二次枝的形成是其下一個(gè)年周期形成側(cè)枝和開花結(jié)實(shí)的前提與保證[10]。與牡丹組其他類群相比，大花黃牡丹果實(shí)發(fā)育與二次枝生長(zhǎng)及頂芽分化重合，三者間營(yíng)養(yǎng)和調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化會(huì)影響引種后的結(jié)果率和結(jié)實(shí)率。因此，研究大花黃牡丹果實(shí)和二次枝及側(cè)蕾之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系有重要意義。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、抗氧化酶活性和激素在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育、果實(shí)成熟等階段均具有重要作用[6]。有關(guān)植物胚胎發(fā)育和敗育生理生化特性的研究主要集中在經(jīng)濟(jì)物種上，如杉木(Cunninghamialanceolata)[11-12]、西瓜(Citrulluslanatus)[13]、油松(Pinustabuliformis)[14]、玉米(Zeamays)[15-16]、荔枝(Litchichinensis)[17-18]、葡萄(Vitisvinifera)[19-21]和棗(Ziziphusjujuba)[22]等。而關(guān)于牡丹胚胎發(fā)育和敗育，特別是胚胎發(fā)育和敗育過程中生理生化特性及其變化規(guī)律尚鮮見報(bào)道。

本研究以河南省洛陽(yáng)市欒川縣芍藥科遷地保護(hù)中心引種栽培的大花黃牡丹為對(duì)象，于2019年及2020年觀測(cè)了果實(shí)及種子發(fā)育規(guī)律，并于2019―2021年進(jìn)行田間控制試驗(yàn)，驗(yàn)證二次枝生長(zhǎng)和果實(shí)發(fā)育過程中的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，比較正常胚珠與敗育胚珠的形態(tài)、生理生化指標(biāo)及內(nèi)源激素含量的變化，分析大花黃牡丹果實(shí)發(fā)育的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系、胚珠敗育的時(shí)間及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素的變化，以期為大花黃牡丹引種栽培及人工調(diào)控結(jié)實(shí)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在河南省洛陽(yáng)市欒川縣芍藥科遷地保護(hù)中心(海拔1 245 m，33°56′05″N，111°21′36″E)，以露地栽培、正常開花結(jié)實(shí)的大花黃牡丹為試驗(yàn)材料。2002年秋播種(采自西藏林芝野生居群)，2003年起陸續(xù)出苗，2008年首次開花[23]。

1.2 開花特性觀察

大花黃牡丹每花枝一般有2～5朵花，花枝最上方的一朵稱為頂花(TF)，位于頂花下方的均稱為側(cè)花(LF)，側(cè)花從下往上按照1～4進(jìn)行排序，分別記為L(zhǎng)F1、LF2、LF3和LF4(圖1)。在5月花期，隨機(jī)選取50個(gè)花枝作為觀測(cè)枝，掛上吊牌，做好標(biāo)記，定期對(duì)觀測(cè)枝進(jìn)行開花物候觀測(cè)拍照，記錄單個(gè)花枝上的花蕾數(shù)、開花數(shù)；當(dāng)單個(gè)花枝上的花蕾數(shù)為3朵時(shí)，記錄花朵的開花次序，分為5個(gè)類別，分別為TF→LF1→LF2、TF→LF2→LF1、LF1→TF→LF2、LF1→LF2→TF、LF2→TF→LF1，計(jì)算各類別占比。

A.不同花朵數(shù)的花枝示意圖；B.開放3花/枝的植株。TF為頂花，LF為側(cè)花。下同 A.Schematic diagram of flowering branches with different numbers of flowers;B.Image of 3 flowers/flowering branches. TF is top flower,LF is side flower.The same below圖1 大花黃牡丹花枝示意圖及實(shí)觀圖Fig.1 Flowering branches of Paeonia ludlowii

1.3 果實(shí)與胚珠發(fā)育及結(jié)果率調(diào)查

1.3.1 果實(shí)發(fā)育 在2019-2021年花果期(5-9月)，選擇開花時(shí)間基本一致的心皮，定期觀察其發(fā)育情況以反映果實(shí)發(fā)育進(jìn)程(開花第1天即默認(rèn)授粉，視為果期第1天)，并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量其縱、橫徑(果實(shí)兩個(gè)頂點(diǎn)的直線距離為縱徑，果實(shí)最寬處為橫徑)，花后10～40 d每10 d觀測(cè) 1 次，之后分別在花后60和90 d時(shí)各觀測(cè)1次。由于大花黃牡丹心皮多為1個(gè)，少為2或3個(gè)，因此觀察時(shí)以1心皮果實(shí)為主，具1個(gè)以上心皮的果實(shí)，則計(jì)算縱、橫徑的平均值。

1.3.2 胚珠發(fā)育 花后1～90 d，采集自然授粉后的果實(shí)，沿腹縫線從中間剖開，觀察胚珠發(fā)育情況。此外，于花后0～90 d,每隔10 d使用游標(biāo)卡尺測(cè)量1 次其縱、橫徑。

1.3.3 胚珠顯微結(jié)構(gòu)觀察 根據(jù)1.3.2觀察結(jié)果，分別采集花后20 d體積正常和異常的胚珠，置于卡諾氏固定液(體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、冰醋酸，二者體積比為3∶1)中。真空處理12 h后，轉(zhuǎn)移到體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中，4 ℃低溫保存。采用常規(guī)石蠟切片方法將固定好的材料進(jìn)行包埋，切片機(jī)(Leica RM2235)切片(切片厚度 9～12 μm)后，用番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封片，生物顯微鏡(SDPTOP CX40RFL)觀察并拍照、記錄。

1.3.4 結(jié)果率 花期隨機(jī)選取50個(gè)花枝，觀測(cè)并標(biāo)記單個(gè)花枝上的開花數(shù)，果期時(shí)記錄每個(gè)花枝上的結(jié)果數(shù)，計(jì)算結(jié)果率，拍照記錄果實(shí)和結(jié)果枝枯萎情況。結(jié)果率=結(jié)果數(shù)/開花數(shù)×100%。

1.4 大花黃牡丹二次枝生長(zhǎng)與果實(shí)發(fā)育田間控制試驗(yàn)

2019-2021年春季，選擇3花/枝的花枝，分成A處理(保留不同花蕾，去除所有二次枝)、B處理(保留所有二次枝，去除不同花蕾)和對(duì)照(CK，保留所有花蕾、二次枝及腋芽)，其中A處理又分為7個(gè)處理，分別為CYA1～CYA7；B處理又分為6個(gè)處理，分別為CYB1～CYB6，具體處理方法見表1。每處理5個(gè)重復(fù)。由于去除二次枝可能會(huì)使花枝上的腋芽萌發(fā)形成新的二次枝，因此A處理去除所有花枝上的腋芽；B處理則保留所有花枝上的腋芽。待種子成熟時(shí)，統(tǒng)計(jì)各處理的結(jié)果率、每朵花的飽滿種子數(shù)、敗育種子數(shù)，計(jì)算每個(gè)果實(shí)的結(jié)實(shí)率，結(jié)實(shí)率=飽滿種子數(shù)/(飽滿種子數(shù)+敗育種子數(shù))×100%。

表1 大花黃牡丹二次枝田間控制試驗(yàn)Table 1 Field control experiment of secondary branches of Paeonia ludlowii

1.5 生理生化指標(biāo)及內(nèi)源激素含量的測(cè)定

分別在2019年和2020年的5-9月觀察果實(shí)發(fā)育，同時(shí)于花后12，13，14，15，20，30，50 d定期采集胚珠，當(dāng)果莢內(nèi)出現(xiàn)明顯敗育胚珠時(shí)，將正常胚珠和敗育胚珠分別取樣(敗育胚珠通過解剖觀察確定)，錫箔紙包裹后用液氮處理2～5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)果實(shí)發(fā)育及顯微觀察結(jié)果[24]，選擇相應(yīng)時(shí)期的樣品進(jìn)行生理生化指標(biāo)及內(nèi)源激素含量測(cè)定。用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖和淀粉含量，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量，用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性[25]。用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)測(cè)定脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)及生長(zhǎng)素(IAA)等內(nèi)源激素的含量[26]。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Adobe Photoshop 2020軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理，使用WPS Office 2019及SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花黃牡丹開花特性觀察

由表2可知，大花黃牡丹3花蕾/枝占比最高(65.96%)，4花蕾/枝次之(23.40%)。因部分花蕾不能正常開放，每花枝上2朵或3朵占比最高，分別為38.30%和36.17%。大花黃牡丹的TF和LF開放順序并不固定，以3花/枝為例，TF先開放，LF1隨后開放，LF2最后開放(即TF→LF1→LF2)的花枝最多。

2.2 大花黃牡丹果實(shí)及胚珠的形態(tài)變化

2.2.1 果實(shí)發(fā)育過程中的形態(tài)變化 觀察發(fā)現(xiàn)，大花黃牡丹單花花期8～9 d，柱頭露出時(shí)即有訪花昆蟲。隨著果實(shí)的生長(zhǎng)，柱頭顏色逐漸加深，由黃變?yōu)榧t色，最后黑褐色；花期時(shí)果實(shí)外表皮較平滑，在發(fā)育過程中逐漸凹凸不平，并由黃綠色變?yōu)榫G色，隨后變紅、變黑(圖2)。

表2 大花黃牡丹的開花特性Table 2 Flowering characteristics of Paeonia ludlowii

A.花后1～80 d；B.花后100 d A.1―80 d after flowering;B.100 d after flowering圖2 大花黃牡丹果實(shí)發(fā)育過程中的形態(tài)變化Fig.2 Changes in fruit morphology of Paeonia ludlowii

大花黃牡丹果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)見圖3。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同時(shí)期差異 顯著(P<0.05)。下同 Different lowercase letters indicate significant differences among periods(P<0.05).The same below圖3 大花黃牡丹果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)Fig.3 Growth of Paeonia ludlowii fruit in different stages

圖3顯示，大花黃牡丹果實(shí)發(fā)育過程中，縱徑和橫徑均在花后10～30 d快速增長(zhǎng)，之后趨于平緩。其中縱徑在花后10～20 d增長(zhǎng)最快，平均日增長(zhǎng)量為1.394 mm，花后20～30 d增長(zhǎng)稍慢，平均日增長(zhǎng)量為0.795 mm。橫徑則在花后20～30 d增長(zhǎng)最快，平均日增長(zhǎng)量為0.434 mm，花后10～20 d增長(zhǎng)稍慢，平均日增長(zhǎng)量為0.385 mm。成熟時(shí)(90 d)果實(shí)的縱橫徑比為2.762。

2.2.2 胚珠的形態(tài)變化 花后1～10 d，大花黃牡丹胚珠增大明顯，但總體積變化不明顯(圖4-A～C)。花后13 d，胚珠間體積差別明顯(圖4-D)。之后正常胚珠體積快速增大，表面分泌黏液；部分胚珠停止增長(zhǎng)，與正常胚珠差異逐漸明顯(圖4-E～F)?；ê?0～50 d，正常胚珠體積繼續(xù)增大，胚珠表面光滑并有黏液，敗育胚珠停止增長(zhǎng)，變干，種皮變皺，二者之間的體積及外部形態(tài)差異明顯(圖4-G～J)。之后正常胚珠種皮逐漸變得結(jié)實(shí)堅(jiān)硬，并慢慢褐化變黑，直至成熟(圖4-K)。從花后13 d起，每個(gè)果實(shí)內(nèi)可清楚地看到體積小的胚珠發(fā)生敗育。其中部分?jǐn)∮呐咧樵诤笃隗w積雖然有一定程度膨大，但仍不能形成可育的種子。值得注意的是，花后20 d，部分果實(shí)中的一些胚珠體積出現(xiàn)異常，它們比早期明顯敗育的胚珠體積大，但比正常胚珠體積小(圖4-G)。切片觀察發(fā)現(xiàn)，正常胚珠的胚囊內(nèi)胚乳與內(nèi)珠被毗鄰，胚乳游離核數(shù)量多且明顯(圖5-A)；而體積異常的胚珠，胚囊內(nèi)的胚及胚乳游離核與正常胚珠相比有退化趨勢(shì)(圖5-B)，說明花后20 d可能存在新一輪敗育。

不同發(fā)育時(shí)期大花黃牡丹正常胚珠的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)見圖6。

大花黃牡丹正常胚珠縱徑和橫徑的生長(zhǎng)趨勢(shì)為慢-快-慢-快-慢，花后10～30 d及40～50 d出現(xiàn)2個(gè)生長(zhǎng)高峰，成熟時(shí)生長(zhǎng)逐漸平緩(圖6)。成熟期(花后90 d)種子縱橫徑比為1.281。

2.2.3 結(jié)果率 50個(gè)花枝開花數(shù)為215朵，收獲果實(shí)148個(gè)，結(jié)果率為68.84%。自然授粉后40～80 d可見果實(shí)枯萎(圖7-A、B)及結(jié)果枝枯萎(圖7-C、D)現(xiàn)象。

2.3 大花黃牡丹二次枝生長(zhǎng)與果實(shí)發(fā)育的關(guān)系

各試驗(yàn)組大花黃牡丹3年內(nèi)均有不能正常開花、雄蕊脫落或果實(shí)、結(jié)果枝枯萎等現(xiàn)象，各年結(jié)果率及結(jié)實(shí)差異較大，且相同年份不同處理的結(jié)果率及結(jié)實(shí)情況差異也較大(表3)。

圖7 大花黃牡丹自然授粉后枯萎果實(shí)(A、B)和結(jié)果枝(C、D)Fig.7 Withered fruits (A,B) and fruiting branches (C,D) of Paeonia ludlowii after being pollinated naturally

由表3可見，2019年，在A組大花黃牡丹中，每朵花的平均飽滿種子數(shù)和每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率均以CYA1最高，CYA6最低?？梢奀YA1綜合表現(xiàn)最佳，且高于對(duì)照組(CK)。CYA2、CYA3和CYA4均僅保留了1個(gè)花蕾，但因花蕾位置不同，結(jié)實(shí)差異較大，其中CYA2每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率僅次于CYA1，以CYA3最低。在B組中，除CYB1及CYB2外，其他處理組每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率均高于CK，其中CYB6表現(xiàn)最佳，其次為CYB3。CYB2、CYB3、CYB4均僅保留1個(gè)花蕾，但以CYB3每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率最高，CYB2最低。

表3 大花黃牡丹二次枝的田間控制試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of field control experiment of secondary branches of Paeonia ludlowii

表3(續(xù)) ContinuedTable 3

由表3還可見，2020年，大花黃牡丹結(jié)果率及結(jié)實(shí)率雖低于2019年，但結(jié)實(shí)率表現(xiàn)最佳的處理與2019年相同，即A組CYA1和B組CYB6，其每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率均高于CK。CYA2、CYA3及CYA4的平均結(jié)實(shí)率從高到低依次為CYA3>CYA4>CYA2，均低于CK；CYB2、CYB3及CYB4每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率則與2019年一樣，其中以CYB3最高，CYB2最低。

表3表明，2021年A組大花黃牡丹結(jié)實(shí)率以CYA1表現(xiàn)最佳，每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率高于CK。僅保留1個(gè)花蕾的CYA2、CYA3和CYA4每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率與前2年不同，依次為CYA4>CYA2>CYA3。B組所有處理每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率均高于CK，其中CYB3最高，其次為CYB5，之后依次為CYB1、CYB6、CYB4；同前2年一樣，B組僅保留1個(gè)花蕾的所有處理中，CYB2每個(gè)果實(shí)的平均結(jié)實(shí)率最低，說明保留二次枝時(shí)，花枝最下方的側(cè)花結(jié)實(shí)能力在所有花朵中最弱。

2.4 大花黃牡丹胚珠敗育過程中生理生化指標(biāo)的變化

2.4.1 可溶性糖和淀粉含量 觀察發(fā)現(xiàn)，花后13 d開始，大花黃牡丹胚胎敗育過程中正常胚珠與敗育胚珠明顯可辨。如圖8所示，花后12～14 d，正常胚珠中可溶性糖含量升高，而敗育胚珠中可溶性糖含量則先升高后降低，之后二者變化平緩。花后12～13 d，敗育胚珠中淀粉含量顯著低于其他時(shí)期，之后持續(xù)上升，20 d時(shí)達(dá)到最高；花后14 d，正常胚珠中的淀粉含量最高，之后迅速下降。這可能是因?yàn)?3 d后正常胚珠體積持續(xù)增大，消耗能量多，而胚珠開始敗育后逐漸縮小，代謝趨緩，淀粉不再大量地轉(zhuǎn)化為可溶性糖，淀粉積累大于消耗，故其含量持續(xù)上升。

2.4.2 可溶性蛋白含量 圖9顯示，花后13～15 d，即當(dāng)敗育胚珠明顯可辨時(shí)，大花黃牡丹正常胚珠的可溶性蛋白含量先降低后升高，而敗育胚珠的變化趨勢(shì)與之相反。敗育胚珠可溶性蛋白含量在花后13 d時(shí)最低，為(0.424±0.003) mg/g；14 d時(shí)升高，達(dá)到最大(1.218±0.003) mg/g，之后又急劇降低。正常胚珠可溶性蛋白含量在花后13 d最高，為(1.138±0.003) mg/g；14 d時(shí)下降達(dá)到最低值，為(0.532±0.023) mg/g；之后又緩慢升高。花后15～20 d正常胚珠與敗育胚珠的可溶性蛋白含量均上升。20～50 d敗育胚珠的可溶性蛋白含量先升高后大幅降低，正常胚珠則緩慢下降，但降幅不明顯。

圖8 大花黃牡丹果實(shí)胚珠中可溶性糖(A)和淀粉(B)含量變化Fig.8 Variation of soluble sugar (A) and starch (B) contents in ovules of Paeonia ludlowii

2.4.3 SOD活性 從圖10可見，花后13～50 d，大花黃牡丹正常胚珠和敗育胚珠的SOD活性變化幅度較大，但總體呈上升趨勢(shì)，且正常胚珠的SOD活性始終高于敗育胚珠。

圖9 大花黃牡丹果實(shí)內(nèi)胚珠中可溶性蛋白含量的變化 圖10 大花黃牡丹果實(shí)胚珠中SOD活性的變化Fig.9 Variation of soluble protein contents in ovules of Paeonia ludlowii Fig.10 Variation of SOD activity in ovules of Paeonia ludlowii

2.5 大花黃牡丹胚珠敗育過程中內(nèi)源激素含量的變化

如圖11所示，大花黃牡丹胚珠不同發(fā)育時(shí)期各類內(nèi)源激素含量變化較復(fù)雜?；ê?2 d，即正常胚珠與敗育胚珠形態(tài)明顯可辨前，胚珠中IAA含量較高，隨后急劇下降；13～20 d時(shí)，正常胚珠與敗育胚珠的IAA含量總體上均先升高后降低，且正常胚珠IAA含量總體高于敗育胚珠?；ê?0～50 d，正常胚珠的IAA 含量先降低后升高，敗育胚珠則連續(xù)升高，花后30～50 d明顯高于正常胚珠(圖11-A)。

花后12～13 d，正常胚珠中的ABA含量降低，敗育胚珠中的ABA含量升高。花后13～20 d，正常胚珠與敗育胚珠ABA含量變化一致，均呈現(xiàn)降低-升高-降低的趨勢(shì)，且敗育胚珠ABA含量始終高于正常胚珠。花后20 d，敗育胚珠的ABA含量繼續(xù)降低，并在30 d時(shí)達(dá)到最小值((35.101±0.196) ng/g)，50 d后急劇上升達(dá)到最大值((159.134±3.526) ng/g)；花后20～50 d，正常胚珠ABA含量持續(xù)升高，并在花后30～50 d高于敗育胚珠(圖11-B)。

花后12～13 d，正常胚珠中的GA3含量升高，敗育胚珠則降低?；ê?3～20 d，敗育胚珠GA3含量呈升高-降低-升高的趨勢(shì)，且總體低于正常胚珠；正常胚珠則在花后13 d后升高，并在花后14 d時(shí)達(dá)到最高值 ((13.568±0.161) ng/g)，之后持續(xù)降低。花后20～50 d，正常胚珠與敗育胚珠中的GA3含量變化趨勢(shì)一致，均呈先升高后降低趨勢(shì)，但敗育胚珠中的GA3含量一直高于正常胚珠(圖11-C)。

花后13～20 d，敗育胚珠的ZR含量先急劇下降，隨后上升；正常胚珠ZR含量則先上升后下降。花后20～50 d，正常胚珠與敗育胚珠中的ZR含量均呈先升高后降低趨勢(shì)，但正常胚珠的ZR含量變幅較敗育胚珠大(圖11-D)。

內(nèi)源激素的平衡關(guān)系分析(圖12)顯示，花后13～20 d，敗育胚珠中(GA3+IAA+ZR)/ABA、GA3/ABA和IAA/ABA小于正常胚珠，而ABA/(GA3+IAA)大于正常胚珠。花后20～50 d，以上指標(biāo)的變化趨勢(shì)與之前相反。

圖11 大花黃牡丹果實(shí)胚珠中內(nèi)源激素含量的變化Fig.11 Variation of endogenous hormones contents in ovules of Paeonia ludlowii

圖12 大花黃牡丹果實(shí)胚珠中內(nèi)源激素比值的變化Fig.12 Variation of endogenous hormones ratios in ovules of Paeonia ludlowii

3 討論與結(jié)論

3.1 二次枝生長(zhǎng)對(duì)胚珠敗育的影響

二次枝的生長(zhǎng)發(fā)育是大花黃牡丹開花結(jié)實(shí)的基礎(chǔ)，是其年發(fā)育周期的重要階段。與牡丹組其他類群相比，大花黃牡丹種子成熟過程伴隨著二次枝發(fā)育。本研究的田間控制試驗(yàn)結(jié)果反映了二次枝生長(zhǎng)及頂芽分化與大花黃牡丹果實(shí)發(fā)育相互影響的特點(diǎn)。大花黃牡丹花期在5月中旬至6月中旬[3]。開花第1天即默認(rèn)為果期開始，5月上旬至6月上旬也是二次枝生長(zhǎng)高峰。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，花后1～12 d胚珠外觀無(wú)明顯差異，10～30 d為胚珠和果實(shí)生長(zhǎng)高峰期，從花后13 d起，正常胚珠與敗育胚珠明顯可辨。大花黃牡丹的果實(shí)發(fā)育高峰期、二次枝發(fā)育高峰期及胚珠敗育時(shí)期重合。

早期人們認(rèn)為授粉不足會(huì)導(dǎo)致敗育，但后來(lái)證明敗育的出現(xiàn)還涉及如資源限制等因素[27-29]。大花黃牡丹自交、異交結(jié)實(shí)，花粉活力和花粉胚珠比高[3]。授粉不足尚不足以導(dǎo)致大花黃牡丹胚珠敗育，特別是花后20 d可能發(fā)生的新一輪敗育與授粉不足關(guān)系不大。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累是二次枝生長(zhǎng)和果實(shí)發(fā)育的限制因子之一。本研究中，保留花蕾、去除二次枝時(shí)結(jié)實(shí)率均較高，證明了二次枝生長(zhǎng)與胚珠發(fā)育之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，因此應(yīng)加強(qiáng)大花黃牡丹植株的營(yíng)養(yǎng)管理，摘除部分二次枝，調(diào)控二次枝和果枝比例，以減少營(yíng)養(yǎng)消耗從而增加結(jié)實(shí)。

一枝多花可延長(zhǎng)牡丹的群體花期，側(cè)蕾雖可增加結(jié)果數(shù)量但消耗資源也多;二次枝和果實(shí)之間、同一枝上不同果實(shí)間資源的競(jìng)爭(zhēng)與分配，都會(huì)降低結(jié)果率、結(jié)實(shí)率，甚至導(dǎo)致枝條枯萎等。本研究中，保留大花黃牡丹二次枝去除不同花蕾的處理組的結(jié)實(shí)率雖有差異，但大多高于對(duì)照組。結(jié)合開花次序，即3個(gè)花蕾的花枝上，先開的花朵結(jié)實(shí)時(shí)同一枝條上的其余花蕾才次第開放，花、果爭(zhēng)奪資源必然影響果實(shí)內(nèi)胚珠及后開花朵的發(fā)育和結(jié)實(shí)，這也是部分花蕾不開放或花后胚珠發(fā)育不良、敗育種子多的原因。因此，引種栽培時(shí)可適當(dāng)去除部分過早或過晚開放的花蕾并追施營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以促進(jìn)花果正常發(fā)育。

本研究中，大花黃牡丹的二次枝發(fā)育與果實(shí)之間及果實(shí)與果實(shí)之間的資源分配限制，導(dǎo)致結(jié)果率及結(jié)實(shí)率降低甚至枝條枯萎等，這與王芳等[30]的觀察結(jié)果相似。此外，本研究中，在保留花枝上所有腋芽及二次枝的情況下，僅保留花枝上最下方的花朵(即側(cè)花1)時(shí)結(jié)實(shí)率最低，說明最下方的花朵在同一花枝上結(jié)實(shí)能力最弱，雜交時(shí)可避免給此處花朵授粉或去除此花減少營(yíng)養(yǎng)消耗，在保證結(jié)實(shí)率的同時(shí)促進(jìn)二次枝發(fā)育。

3.2 胚珠敗育過程中的生理生化指標(biāo)變化

在胚珠發(fā)育過程中，可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、酶活性及內(nèi)源激素等的變化與細(xì)胞的生物功能和生理活動(dòng)密切相關(guān)，糖類物質(zhì)在胚珠發(fā)育過程中除作為能量物質(zhì)外，還具有滲透調(diào)節(jié)、催化活性等作用[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米敗育籽粒中可溶性糖和淀粉含量均低于正常籽粒，這是由于有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，幾乎所有營(yíng)養(yǎng)都處于“下流”，導(dǎo)致玉米果穗頂部種子嚴(yán)重?cái)∮齕33]。本研究中，花后12～14 d，大花黃牡丹正常胚珠中可溶性糖含量持續(xù)升高，而敗育胚珠則先升高后降低，推測(cè)大花黃牡丹胚珠早期敗育(受精結(jié)束，胚、胚乳處于游離核時(shí)期)可能與胚珠內(nèi)可溶性糖含量降低有關(guān)。前人發(fā)現(xiàn)，除了有機(jī)物質(zhì)的積累，有機(jī)物質(zhì)合成能力弱也是引起玉米籽粒敗育的重要生理原因[33]。本研究中，花后13～14 d，大花黃牡丹敗育胚珠的淀粉含量雖有升高但仍較正常胚珠低，說明敗育胚珠中淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖的能力較正常胚珠弱，大花黃牡丹敗育胚珠合成淀粉的能力也比正常胚珠弱。

可溶性蛋白是胚胎發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它能激活細(xì)胞代謝過程，促進(jìn)胚胎的形態(tài)形成。大核荔枝品種的可溶性蛋白含量普遍高于焦核品種[18]。本研究中，大花黃牡丹花后13 d時(shí)，敗育胚珠可溶性蛋白含量降到最低，而此時(shí)正常胚珠的可溶性蛋白含量最高，表明胚珠內(nèi)可溶性蛋白含量降低也可能導(dǎo)致其敗育。

王飛等[19]認(rèn)為，有核葡萄品種胚珠發(fā)育過程中有活性氧產(chǎn)生，但SOD活性持續(xù)升高迅速消除了活性氧的脅迫，而無(wú)核品種SOD活性雖升高但不能持續(xù)保持高水平，導(dǎo)致活性氧與膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)積累、可溶性蛋白和糖減少，最終導(dǎo)致無(wú)核葡萄胚的敗育。潘學(xué)軍等[34]也認(rèn)為，胚珠中SOD活性增強(qiáng)可消除活性氧毒害，保護(hù)胚珠，而SOD活性一旦下降，活性氧產(chǎn)生與清除的平衡被破壞，從而使胚珠敗育。紀(jì)薇等[35]證實(shí)了SOD活性與無(wú)核葡萄胚敗育的關(guān)聯(lián)度最高。與前人研究結(jié)果相似，本研究中，花后13～50 d，大花黃牡丹正常胚珠的SOD活性始終高于敗育胚珠，表明SOD活性低可能是胚珠敗育的原因之一。

3.3 胚珠敗育過程中的內(nèi)源激素變化

有關(guān)植物胚珠發(fā)育與內(nèi)源激素關(guān)系的研究表明，胚珠發(fā)育期間內(nèi)源激素含量動(dòng)態(tài)變化及它們之間的比例平衡與胚珠敗育有著密切的聯(lián)系。在雄性不育棗發(fā)育后期的敗育種子中，IAA、GA3和ABA虧缺，Z異常累積[36]。四倍體刺槐(Robiniapseudoacacia)花冠展開 15 d之后的敗育胚珠內(nèi)生長(zhǎng)促進(jìn)類內(nèi)源激素(GA3、IAA)含量低于正常胚珠，生長(zhǎng)抑制類內(nèi)源激素(ABA)含量明顯高于正常胚珠[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，花后13～20 d，大花黃牡丹正常胚珠中的IAA、GA3和ZR含量高于敗育胚珠，而ABA含量低于敗育胚珠，與上述研究結(jié)果相似?？芍蠡S牡丹胚珠內(nèi)低含量的IAA、GA3和ZR、高含量的ABA可能不利于胚珠的正常發(fā)育。

值得注意的是，Reed等[38]研究了玉米籽粒敗育前后內(nèi)源激素的變化與胚胎敗育的關(guān)系，認(rèn)為單一的內(nèi)源激素變化不足以解釋敗育的成因。生長(zhǎng)抑制類(CTK、ABA)和生長(zhǎng)類激素(GA3、IAA)的比值與荔枝胚胎發(fā)育相關(guān)[17]。本研究中，花后13～20 d，大花黃牡丹正常胚珠中的(GA3+IAA+ZR)/ABA、GA3/ABA和IAA/ABA高于敗育胚珠，而ABA/(GA3+IAA)低于敗育胚珠。這與姜金仲等[37]、李建國(guó)等[39]、潘學(xué)軍等[21]和賀軍虎等[40]的研究結(jié)果相似，說明胚珠內(nèi)較低的(GA3+IAA+ZR)/ABA、GA3/ABA、IAA/ABA，以及較高的ABA/(GA3+IAA)不利于大花黃牡丹胚珠的正常發(fā)育。

本研究形態(tài)觀察結(jié)果表明，花后13 d出現(xiàn)了首輪敗育，20 d時(shí)又出現(xiàn)了部分胚珠體積異于正常胚珠，切片觀察發(fā)現(xiàn)這部分胚珠胚囊內(nèi)的胚和胚乳有退化趨勢(shì)，敗育胚珠的生理指標(biāo)及內(nèi)源激素含量及比值也均在花后20 d時(shí)發(fā)生了明顯變化，說明大花黃牡丹花后20 d存在新一輪胚珠敗育，相關(guān)調(diào)控機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，大花黃牡丹胚珠敗育的過程受多種因素影響，比如營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足、有機(jī)物合成能力弱及內(nèi)源激素代謝變化等都可能是引起胚珠敗育的生理原因。在發(fā)育早期，胚珠生理活性較低時(shí)，應(yīng)及時(shí)減少結(jié)果枝的營(yíng)養(yǎng)消耗，如去除部分花蕾或二次枝。有研究表明，追肥有助于提高植株的結(jié)實(shí)率，Song等[41]給羊草追施氮肥使單株種子數(shù)增加40%；李嘉玨等[42]對(duì)引種栽培4年的大花黃牡丹植株每年人工噴施磷酸二氫鉀3次后，其自交結(jié)實(shí)率為66.7%。因此，在大花黃牡丹胚珠明顯敗育前(即花后12 d)，施用外源營(yíng)養(yǎng)素可能有助于提高其結(jié)實(shí)率，但處理前需結(jié)合胚珠發(fā)育的狀態(tài)確定，如何提高胚珠早期發(fā)育的生理活性將是今后大花黃牡丹引種、繁殖，特別是提高雜交結(jié)實(shí)率的重要研究?jī)?nèi)容。