抑制TGF-β/Smads通路對(duì)Hyp促進(jìn)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的影響

榮 華，楊石坤，杜有家，豆騰飛，黃 英，武祥偉，史慶超，王曉雯

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) a 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，b 云南省高校高原漁業(yè)資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)試驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2 內(nèi)江師范學(xué)院 長(zhǎng)江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)試驗(yàn)室，四川 內(nèi)江641112)

魚膠(魚鰾的干制品)富含膠原蛋白，營養(yǎng)價(jià)值極高，與燕窩、魚翅齊名，系“海洋八珍”之一，有“海洋人參”之美譽(yù)[1]。近年來，隨著人們對(duì)魚膠營養(yǎng)和保健價(jià)值的認(rèn)識(shí)，市場(chǎng)上對(duì)高品質(zhì)魚膠的需求日益旺盛，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2019 年全國魚膠產(chǎn)量7 423 t，產(chǎn)值近200 億元。淺色黃姑魚(Nibeacoibor)俗稱白奈，是我國東南沿海地區(qū)用于生產(chǎn)名貴魚膠——白花膠的重要海水養(yǎng)殖品種[2]，開展淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白代謝相關(guān)研究，對(duì)提高魚膠產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加蠶豆[3]、杜仲[4]、脯氨酸[5-7]和羥脯氨酸(Hyp)[8]可以促進(jìn)魚類膠原蛋白沉積。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，Hyp可以促進(jìn)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白的沉積[9-10]，但對(duì)其分子機(jī)理缺乏深入探討。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增殖的多功能細(xì)胞因子，對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞的主要作用是刺激細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。此外，TGF-β還可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化，上調(diào)Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅹ型膠原蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白沉積[11]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子細(xì)胞信號(hào)通路(TGF-β/Smads)作為調(diào)控膠原蛋白代謝的經(jīng)典途徑，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白的沉積[11-13]。然而，TGF-β/Smads信號(hào)通路在魚類膠原蛋白代謝中的作用鮮有研究報(bào)道。有研究表明，積雪草皂苷[14]、β-拉帕醌[15]和氧化苦參堿[16-18]等干擾劑可以作用于TGF-β/Smads通路中特定配體，導(dǎo)致整個(gè)信號(hào)通路效應(yīng)發(fā)生變化，致使機(jī)體合成膠原蛋白的能力發(fā)生變化。Wu等[19]發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿可通過抑制TGF-β1、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3(Smad3)等的表達(dá)，對(duì)CC4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有明顯的拮抗作用。4-(1-(2-(2-芐基吡咯烷-1-基)-5-氯煙酰胺)環(huán)丙基)苯甲酸甲酯(SIS3)是一種新型的TGF-β/Smads信號(hào)通路抑制劑，主要特異抑制Smad3，在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用廣泛[20]。Matsubara等[21]發(fā)現(xiàn)，SIS3處理的肝細(xì)胞對(duì)TGF-β、腫瘤壞死因子(TNF-α)的響應(yīng)降低，從而減弱肝細(xì)胞的纖維化。SIS3可以抑制心肌成纖維細(xì)胞的分化和膠原蛋白的生成[22-23]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smads是參與脯氨酸促進(jìn)黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積調(diào)控的重要途徑[7]，但其是否也參與調(diào)控Hyp促進(jìn)黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積尚未可知。為此，本試驗(yàn)用Hyp促進(jìn)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積，然后利用氧化苦參堿和SIS3對(duì)TGF-β/Smads通路進(jìn)行抑制，比較抑制與否對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白含量的影響，探討TGF-β/Smads通路在Hyp促膠原蛋白沉積過程中的作用，為膠原蛋白代謝的營養(yǎng)調(diào)控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

SIS3，分子式為C28H28ClN3O3，購于MedChemExpress(MCE)公司(中國，上海)。氧化苦參堿，分子式為C15H24N2O2，購于MedChemExpress(MCE)公司。Hyp含量測(cè)定試劑盒(Art.No.A030-2；南京建成生物工程研究所)。TransScript?One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit(Trans Gen生物技術(shù)，北京)。SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒(Takara，大連)。丁香酚溶液(阿拉丁試劑有限公司，中國)。主要儀器有Infinite?Pro 200酶標(biāo)儀(Tecan、瑞士)、Nanodrop?ND-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific NanoDrop,USA)、Roche Light Cycler?480 System實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(Roche，瑞士)。

1.2 飼料配制

根據(jù)文獻(xiàn)[9]配制Hyp空白組和Hyp添加組飼料(表1)。

表1 試驗(yàn)飼料配方及養(yǎng)分含量(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Formulation and nutrient contents of the experimental diets(air-dry basis) g/kg

Hyp空白組不額外添加Hyp，Hyp添加組添加9.70 g/kgL-羥脯氨酸，用丙氨酸來平衡飼料中的氮，參考美國國家科學(xué)研究委員會(huì)(NRC，2011)中大黃魚的營養(yǎng)需求設(shè)計(jì)其他營養(yǎng)成分的含量[24]。飼料中氨基酸組成見表2。飼料原料過0.42 mm篩，經(jīng)充分混合，用2.5 mm直徑的膨化機(jī)制粒，在自然通風(fēng)環(huán)境中風(fēng)干。干顆粒飼料被密封在塑料袋里于-20 ℃存儲(chǔ)備用。

表2 試驗(yàn)飼料的氨基酸組成(以干物質(zhì)計(jì)) Table 2 Amino acid composition of experimental diets μmol/g

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

養(yǎng)殖試驗(yàn)在廣東省汕頭市南澳縣汕頭大學(xué)海洋生物臨海試驗(yàn)站進(jìn)行。淺色黃姑魚購自當(dāng)?shù)啬趁绶N孵化場(chǎng)。幼魚購回后，在一個(gè)大的浮動(dòng)網(wǎng)箱(長(zhǎng)×寬×深=3 m×3 m×2 m，)暫養(yǎng)2周，期間投喂揭陽通威股份有限公司生產(chǎn)的商業(yè)飼料(粗蛋白40.0%，粗脂肪10.0%)。試驗(yàn)前，試驗(yàn)魚先禁食24 h，用40 mg/L丁香酚溶液麻醉后稱體質(zhì)量并分組。300尾試驗(yàn)魚(體質(zhì)量(11.621±0.154) g/尾)被隨機(jī)分為4組(Hyp空白組、Hyp添加組、SIS3干擾組、氧化苦參堿干擾組)，每組3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)25尾魚(在長(zhǎng)×寬×深 = 1 m×1 m×1.5 m的網(wǎng)箱中養(yǎng)殖)。

在為期8周的養(yǎng)殖試驗(yàn)中，Hyp空白組試驗(yàn)魚飼喂不添加Hyp的日糧，其他3組試驗(yàn)魚均飼喂添加Hyp的日糧，SIS3、氧化苦參堿干擾組試驗(yàn)魚在4周后腹腔注射SIS3和氧化苦參堿注射液進(jìn)行干擾試驗(yàn)，每周注射1次，直至試驗(yàn)結(jié)束。為了消除注射應(yīng)激及SIS3、氧化苦參堿注射液中溶劑dimethysulfoxide(DMSO)對(duì)魚體基礎(chǔ)代謝的影響，減少試驗(yàn)系統(tǒng)誤差，Hyp空白組和Hyp添加組試驗(yàn)魚注射等量的DMSO注射液。試驗(yàn)期間，每天人工飽食投餌2次(07:00和16:30)，記錄好飼料投喂量。觀察記錄魚的健康狀況及環(huán)境變化等，在試驗(yàn)過程中，溫度23～30 ℃，pH值7.8～8.1，氨氮質(zhì)量濃度低于0.05 mg/L，鹽度31～33 g/L，溶解氧5.2～6.0 mg/L。

因溶劑內(nèi)含有DMSO，一定濃度的DMSO對(duì)魚體有毒副作用，所以參考SIS3[20]和氧化苦參堿的給藥量[19,25-27]并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果(試驗(yàn)魚腹腔注射液體100 μL/尾無死亡)，確定SIS3和氧化苦參堿的稀釋質(zhì)量濃度及注射方案如下：(1)SIS3注射液。將SIS3用DMSO配成20 mg/mL的儲(chǔ)存液，-20 ℃儲(chǔ)存1個(gè)月，使用前利用生理鹽水稀釋成1 mg/mL注射液進(jìn)行腹腔注射。按照100 μL/尾給藥，當(dāng)時(shí)魚體質(zhì)量約50 g，給藥量為2 mg/kg。(2)氧化苦參堿注射液。在超聲輔助下，將氧化苦參堿用DMSO配制成100 mg/mL儲(chǔ)存液，并按照上述方案稀釋成5 mg/mL注射液。按照100 μL/尾給藥，當(dāng)時(shí)魚體質(zhì)量約50 g，給藥量10 mg/kg。(3)DMSO注射液。將DMSO溶液用生理鹽水按1∶20體積比稀釋成注射液，參照SIS3和氧化苦參堿的給藥量確定注射量(100 μL/尾)。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，采用100 mg/L丁香酚麻醉，稱體質(zhì)量，計(jì)算魚的生長(zhǎng)和飼料利用率。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6尾試驗(yàn)魚，測(cè)量個(gè)體體質(zhì)量、體長(zhǎng)，計(jì)算肥滿度等；取魚鰾用于膠原蛋白含量的測(cè)定。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6尾試驗(yàn)魚，采集其肝臟(右側(cè))，分成小塊(1 cm×1 cm)固定于Bouin’s液中，用于組織切片觀察。

此外，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取4尾試驗(yàn)魚，采集魚鰾組織樣本，快速收集好后立即浸入液氮，隨后儲(chǔ)存在-80 ℃，用于總RNA的提取。

1.5 生長(zhǎng)性能測(cè)定

根據(jù)飼養(yǎng)試驗(yàn)中測(cè)定的魚體質(zhì)量、體長(zhǎng)、飼料消耗等指標(biāo)，計(jì)算特定生長(zhǎng)率(SGR)、飼料系數(shù)(FC)、鰾體比(SBSI) 、存活率(SR)、肥滿度(CF) ：

SGR(%/d)=[(ln FBW-ln IBW)/t]×100，

FC=FI/(FBW-IBW)，

SBSI=SBW/BW×100%，

SR=FFN/IFN×100%，

CF(g/cm3)=BW/BL3。

式中：FBW和IBW分別代表試驗(yàn)魚的終末體質(zhì)量和初始體質(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)時(shí)間(d)，F(xiàn)I代表采食量(g)，SBW代表魚鰾重(g)，BW代表魚體質(zhì)量(g)，F(xiàn)FN代表終末魚數(shù)，IFN代表初始魚數(shù)，BL代表體長(zhǎng)(cm)。

1.6 魚鰾膠原蛋白含量測(cè)定

用Hyp含量測(cè)定試劑盒測(cè)定魚鰾中的膠原蛋白含量，具體操作方法參考試劑盒說明書進(jìn)行，使用Infinite?Pro 200酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品(試劑盒自帶)的吸光度(OD550)，利用標(biāo)準(zhǔn)品的OD550與給定濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，試算試驗(yàn)樣品中Hyp含量。膠原蛋白的含量由Hyp的含量乘以8估算得到[10]。

1.7 肝臟組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

肝臟組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)在武漢賽維爾生物科技有限公司協(xié)助下完成，試驗(yàn)步驟簡(jiǎn)介如下：1)將新鮮的組織樣品固定于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛24 h以上；2)用體積分?jǐn)?shù)75%酒精-無水乙醇按梯度脫水6 h；3)使用二甲苯取代酒精透明2次，每次10 min；4)在溫箱中，將已透明的組織塊放入加熱融解的石蠟中，浸蠟3次，每次1 h；5)將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋后，使用輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)對(duì)包埋好的組織進(jìn)行切片，切片厚度控制在5～6 μm；6)將切片烤干，HE染色后，脫水封片，最后進(jìn)行顯微鏡鏡檢，采集圖像分析。

1.8 膠原蛋白代謝相關(guān)基因及TGF-β/Smads通路關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

魚鰾組織總RNA根據(jù)Trizol (InvitrogenTM)試劑說明書，使用氯仿-異丙醇法提取，通過1.2%瓊脂糖凝膠分析確定其完整性和質(zhì)量，利用Nanodrop?ND-2000分光光度計(jì)于260和280 nm處測(cè)定吸光度(OD260、OD280)，計(jì)算OD260/OD280，確定RNA的最終濃度。使用TransScript?One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)膠原蛋白代謝相關(guān)基因Ⅰ型膠原蛋白α1(COL1A1)、COL1A2、Ⅰ型脯氨酸羥化酶(P4Hα(Ⅰ))、P4Hα(Ⅱ)、P4Hα(Ⅲ)及TGF-β/Smads通路關(guān)鍵基因TGF-β、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體(TGF-βRT)Smad2、Smad3、Smad4和Smad7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)表達(dá)分析，以β-actin為管家基因。根據(jù)大黃魚(Larimichthyscrocea)、鱸魚(Micropterussalmoides)和鱖魚(Sinipercachuatsi)等的膠原蛋白代謝相關(guān)基因的核心序列保守區(qū)，利用Primer Premier 5.0軟件(USA)設(shè)計(jì)其特異性引物(表3)，交由華大基因(深圳)合成。

表3 膠原蛋白代謝相關(guān)基因的RT-PCR引物序列Table 3 Sequences of real-time PCR primers for genes of collagen metabolism

表3(續(xù)) ContinuedTable 3

使用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒配制RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL)，在Roche Light Cycler?480 System RT-qPCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。使用2-ΔΔCt法[28]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。使用倍數(shù)變化(fold change)法將基因相對(duì)表達(dá)量換算成倍數(shù)變化進(jìn)行繪圖。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0程序(SPSS,Inc.，Chicago， IL，USA)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并采用Tukey進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(n=3)呈現(xiàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hyp及干擾劑對(duì)淺色黃姑魚生長(zhǎng)的影響

由表4可知， Hyp添加組試驗(yàn)魚的特定生長(zhǎng)率(SGR)顯著高于Hyp空白組(P<0.05)，其余組間差異不顯著；其他指標(biāo)在4個(gè)組間均無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，飼料中添加Hyp能顯著促進(jìn)淺色黃姑魚的生長(zhǎng)；注射干擾劑SIS3和氧化苦參堿對(duì)試驗(yàn)魚生長(zhǎng)無顯著影響(P>0.05)。

2.2 Hyp及干擾劑對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的影響

Hyp和TGF-β/Smads通路抑制劑對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白含量的影響見圖1。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖1 Hyp和TGF-β/Smads通路抑制劑對(duì)淺色黃姑魚 魚鰾膠原蛋白含量的影響Fig.1 Effect of Hyp and TGF-β/Smads pathway inhibitors on collagen content in swim bladder of Nibea coibor

由圖1可知， Hyp添加組試驗(yàn)魚魚鰾膠原蛋白含量顯著高于Hyp空白組(P<0.05)，表明飼料中添加Hyp對(duì)魚鰾膠原蛋白沉積具有顯著的促進(jìn)作用；SIS3干擾組魚鰾膠原蛋白含量顯著低于Hyp添加組(P<0.05)；氧化苦參堿干擾組膠原蛋白含量低于Hyp添加組，但二者差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，抑制TGF-β/Smads通路可降低淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白的沉積；與SIS3相比，氧化苦參堿的抑制效果稍差。

2.3 DMSO對(duì)淺色黃姑魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，各試驗(yàn)組肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列緊密，胞質(zhì)界限分明且細(xì)胞數(shù)量較多，無病理性現(xiàn)象，表明在本試驗(yàn)條件下DMSO對(duì)淺色黃姑魚健康無不良影響。

2.4 Hyp及干擾劑對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

Hyp及干擾劑對(duì)淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響見圖3。

A～D分別為Hyp空白組、addition Hyp添加組、SIS3干擾組和氧化苦參堿干擾組 A-D indicate Hyp blank group,Hyp addition group,SIS3 interference group and oxymatrine interference group,respectively圖2 DMSO對(duì)淺色黃姑魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of DMSO on liver tissue structure of Nibea coibor

以Hyp空白組(對(duì)照組)為基線(橫軸)，Y軸上的數(shù)據(jù)大于0表示與對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)，具體數(shù)據(jù)代表上調(diào)的倍數(shù)； 數(shù)據(jù)小于0表示表達(dá)與對(duì)照組相比下調(diào)，具體數(shù)據(jù)的絕對(duì)值代表下調(diào)的倍數(shù)。圖柱上標(biāo)注*表示與Hyp空白組差異顯著(P<0.05) Taking the Hyp blank group (control group) as the baseline (horizontal axis),a value greater than 0 on the Y-axis indicates that the expression is up-regulated and the specific value represents the fold of the up-regulation.On the contrary,less than 0 means down-regulation,and the absolute value represents the fold of down-regulation.* indicates significant differences compared with the Hyp blank group (P<0.05)圖3 Hyp及干擾劑對(duì)淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of Hyp and inhibitors on expression levels of collagen-metabolism-related genes in swim bladder of Nibea coibor

由圖3可知，Hyp添加組魚COL1A1和COL1A2相對(duì)表達(dá)量均顯著高于Hyp空白組(P<0.05)，說明飼料中添加Hyp可上調(diào)COL1A1和COL1A2基因的表達(dá)；SIS3和氧化苦參堿干擾組COL1A1和COL1A2基因表達(dá)量顯著低于Hyp添加組(P<0.05)，說明抑制TGF-β/Smads通路可顯著下調(diào)淺色黃姑魚魚鰾中COL1A1和COL1A2基因的表達(dá)。Hyp添加組、SIS3干擾組和氧化苦參堿干擾組中P4Ha(Ⅲ)基因表達(dá)量均顯著低于Hyp空白組(P<0.05)，說明飼料中添加Hyp可顯著下調(diào)P4Hα(Ⅲ)基因的表達(dá)，而抑制TGF-β/Smads通路對(duì)其作用不明顯。淺色黃姑魚魚鰾中P4Hα(Ⅰ)、P4Hα(Ⅱ)、TGF-β、TGF-βRT、Smad3、Smad4和Smad7基因的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，均不受Hyp的影響。

3 討 論

氨基酸在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、維持機(jī)體正常生理及營養(yǎng)代謝中起著至關(guān)重要的作用[29]。飼料中Hyp含量較少，特別是植物源飼料中幾乎不存在Hyp[30]。越來越多的證據(jù)表明[31-34]，提供充足的Hyp有利于魚類的健康生長(zhǎng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，Hyp顯著提高了淺色黃姑魚的特定生長(zhǎng)率，作者前期研究也發(fā)現(xiàn)，添加Hyp對(duì)淺色黃姑魚[9]和雙棘黃姑魚[31]的生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用。Wei等[32]曾報(bào)道，飼料中添加Hyp可以促進(jìn)大黃魚的生長(zhǎng)性能，在Hyp添加水平為0.33%時(shí)，大黃魚可獲得最佳的特定生長(zhǎng)率。Liu等[33]研究表明,以植物蛋白為基礎(chǔ)的飼料中添加Hyp可以顯著促進(jìn)大菱鲆的生長(zhǎng)。在高比例植物源飼料中添加0.28%的Hyp可以增加三文魚的體質(zhì)量[34]。然而Albrektsen等[35]研究發(fā)現(xiàn)，三文魚的生長(zhǎng)性能不受Hyp水平的顯著影響；Zhang等[8]在大菱鲆中也未發(fā)現(xiàn)Hyp對(duì)生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。上述研究中，魚的種類、大小、試驗(yàn)飼料和水產(chǎn)養(yǎng)殖條件存在較大差異，這可能是致試驗(yàn)結(jié)果差異的主要原因。如在Liu等[33]與Zhang等[8]的研究中魚種雖均為大菱鲆幼魚，但飼料配方中植物蛋白的比例卻相差甚遠(yuǎn)；飼料中添加Hyp對(duì)246～264 g三文魚[34]和2.4 kg三文魚[35]的試驗(yàn)結(jié)果截然相反，這有可能是因?yàn)樽恤~期的特定生長(zhǎng)率要遠(yuǎn)大于育成期，所以生長(zhǎng)對(duì)營養(yǎng)素的響應(yīng)度在仔魚期較成魚期會(huì)更敏感。分析肝臟組織形態(tài)是了解機(jī)體健康情況的一個(gè)重要手段。本研究干擾劑注射液中含一定濃度的DMSO，過量的DMSO對(duì)動(dòng)物有一定毒副作用，因此有必要就DMSO對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度加以評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)條件下干擾劑DMSO對(duì)淺色黃姑魚的毒副作用較小，不足以影響營養(yǎng)代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Hyp作為膠原蛋白的重要組成部分，能夠在一定程度上促進(jìn)膠原蛋白的沉積，而關(guān)于Hyp促進(jìn)膠原蛋白沉積的作用機(jī)制鮮有報(bào)道[36]。TGF-β/Smads信號(hào)通路在調(diào)控膠原蛋白代謝過程中具有重要作用，有研究表明，脯氨酸[7]和蠶豆[37]可通過TGF-β/Smads信號(hào)通路促進(jìn)魚類膠原蛋白沉積，而有關(guān)TGF-β/Smads信號(hào)通路是否也參與調(diào)控Hyp對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的促進(jìn)作用目前尚未見報(bào)道。本研究通過抑制劑干擾TGF-β/Smads通路，比較抑制與否，Hyp對(duì)淺色黃姑魚膠原蛋白沉積及相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加Hyp顯著促進(jìn)了淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積，一些學(xué)者在大菱鲆上也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果[8,33]，說明飼料中添加適量的Hyp能夠促進(jìn)膠原蛋白的合成。為了探討Hyp促進(jìn)膠原蛋白沉積的作用機(jī)制，本研究分析了膠原蛋白代謝相關(guān)基因及TGF-β/Smads信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hyp顯著上調(diào)COL1A1和COL1A2的表達(dá)，這也與之前在雙棘黃姑魚中的研究結(jié)果相吻合[7]，說明可能通過上調(diào)膠原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)膠原蛋白合成。本研究中，SIS3和氧化苦參堿干擾對(duì)Hyp介導(dǎo)的淺色黃姑魚魚鰾中COL1A1和COL1A2基因表達(dá)有明顯的下調(diào)作用，這可能是抑制劑導(dǎo)致膠原蛋白沉積下降的原因。這也與早期研究報(bào)道的氧化苦參堿和SIS3能夠降低機(jī)體組織的纖維化(膠原蛋白的沉積過程)[16-19]相一致。TGF-β/Smads信號(hào)通路中包含多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)因子，如TGF-β和TGF-βRT可刺激Smad2、Smad3與Smad4締合形成易位復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，通過其他轉(zhuǎn)錄因子與靶基因(如COL1A2)啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[38-39]。近年來，人們逐步證實(shí)在組織纖維化的過程中，經(jīng)典的TGF-β/Smads通路并不是唯一的信號(hào)傳遞途徑，且TGF-β的胞內(nèi)信號(hào)傳遞在不同細(xì)胞中有不同的信號(hào)通路，TGF-β下游的信號(hào)傳導(dǎo)分子除了經(jīng)典的Smad2、Smad3之外，還存在其他一些非Smads通路，如MAPK通路、AKT/PIK3通路等[12]。本試驗(yàn)中，SIS3和氧化苦參堿干擾對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路中關(guān)鍵基因表達(dá)并無顯著影響，說明Hyp促進(jìn)魚鰾中膠原蛋白沉積可能與TGF-β/Smads信號(hào)通路無關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，P4Hα(Ⅲ)基因的表達(dá)水平在Hyp添加組顯著下調(diào)，但并不受抑制劑的影響。Hyp不能作為合成膠原蛋白的底物，自然狀態(tài)下也不存在游離的Hyp，Hyp是在膠原蛋白肽鏈形成后，由脯氨酰殘基羥基化形成的[40]。脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，P4H)是催化脯氨酰殘基羥基化的主要酶，主要有3個(gè)α亞基，由脯氨酸羥化酶基因(P4Hα(Ⅰ)、P4Hα(Ⅱ)和P4Hα(Ⅲ))編碼[41]。添加Hyp可能導(dǎo)致P4H活性降低，減弱了Pro羥基化形成Hyp這一過程，直接抑制了膠原蛋白的降解，從而間接地促進(jìn)了膠原蛋白的沉積。正常生理狀態(tài)下，膠原蛋白的合成和分解過程時(shí)刻都處在動(dòng)態(tài)的平衡中，本試驗(yàn)中添加Hyp導(dǎo)致魚鰾中膠原蛋白沉積增加，可能是膠原蛋白合成增加與降解減少共同的作用結(jié)果，而TGF-β/Smad信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用有限。

綜上所述，Hyp對(duì)淺色黃姑魚的生長(zhǎng)和魚鰾膠原蛋白沉積有一定的促進(jìn)作用，而SIS3干擾抑制后，魚鰾膠原蛋白含量顯著降低，對(duì)TGF-β/Smads通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響，僅影響了Smad2的轉(zhuǎn)錄；氧化苦參堿干擾對(duì)TGF-β/Smads通路中相關(guān)基因的影響不顯著，且干擾前后魚鰾中膠原沉積無顯著性差異。結(jié)果表明，SIS3對(duì)膠原蛋白代謝的抑制作用要強(qiáng)于氧化苦參堿，且TGF-β/Smads通路不是調(diào)控Hyp促進(jìn)膠原蛋白沉積的主要路徑。Hyp促進(jìn)膠原蛋白沉積的作用機(jī)理可能與抑制膠原蛋白的降解有關(guān)。

志謝：感謝汕頭大學(xué)理學(xué)院海洋生物研究所為本試驗(yàn)提供試驗(yàn)場(chǎng)所，感謝溫小波教授和林帆博士對(duì)文稿所提的寶貴意見。