熔解曲線法在痰涂陰肺結(jié)核患者中的應(yīng)用

梁立鋒

廣東省云浮市慢性病防治中心檢驗(yàn)科，廣東云浮 527300

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染病，尤其以肺結(jié)核多見，嚴(yán)重影響人類的生命安全。實(shí)驗(yàn)室檢測是確診肺結(jié)核的重要依據(jù)，根據(jù)結(jié)核病防治要求，現(xiàn)行采用痰涂片找抗酸桿菌、痰培養(yǎng)等方法檢測，但其不能滿足快速診治的臨床要求，亟須尋找一種快速且經(jīng)濟(jì)的病原學(xué)檢測方法，為臨床快速診斷提供依據(jù)。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、熔解曲線法檢測痰涂陰患者中的結(jié)核分枝桿菌核酸和利福平耐藥突變基因，與痰培養(yǎng)及表型藥敏試驗(yàn)進(jìn)行比對，探討其應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年1月至2021年9月于本院結(jié)核門診就診的1 040例患者的痰標(biāo)本，患者經(jīng)直接數(shù)字化X線攝影系統(tǒng)檢查有異常，臨床有咳嗽、咳痰兩周以上等癥狀，且全部為痰涂陰肺結(jié)核可疑者，年齡17～82歲，平均(45±17)歲。

1.2儀器與試劑 金胺O染色液、羅氏固體培養(yǎng)基、羅氏含藥培養(yǎng)基采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；核酸提取儀、結(jié)核分枝桿菌核酸提取試劑、MTB基因和利福平耐藥突變檢測試劑采用廈門致善生物科技股份有限公司產(chǎn)品，擴(kuò)增分析儀由上海宏石醫(yī)療科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1染色鏡檢 采用金胺O染色法，操作及結(jié)果報(bào)告按《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[1]執(zhí)行。

1.3.2痰培養(yǎng) 采用中性離心法，操作及結(jié)果報(bào)告按《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[2]執(zhí)行。

1.3.3藥敏試驗(yàn) 采用比例法，操作及結(jié)果報(bào)告按《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)操作程序及質(zhì)量保證手冊》[3]執(zhí)行。

1.3.4DNA提取 取1.5 mL經(jīng)4%氫氧化鈉液化后的痰標(biāo)本，以13 000×g離心5 min，去掉上清液，加入500 μL結(jié)核的DNA提取液，渦旋振蕩混勻。99 ℃加熱10 min，取出冷卻至室溫，把所有標(biāo)本加至提取條中并加20 μL增強(qiáng)液放入提取儀提取，提取液作DNA模板。

1.3.5MTB核酸檢測、利福平耐藥突變檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測MTB核酸：把15 μL DNA模板和15 μL裂解液加入檢測體系，振蕩5 s，瞬時(shí)離心，去除大的氣泡，轉(zhuǎn)到PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增。利福平耐藥突變檢測：采用熔解曲線法檢測。每個(gè)標(biāo)本使用A和B兩個(gè)反應(yīng)體系，每個(gè)體系采用FAM和TET兩個(gè)通道，共4個(gè)通道檢測，通過比較標(biāo)本與陽性對照之間熔解曲線熔點(diǎn)(TM值)的差異判斷樣品是否發(fā)生突變。A、B反應(yīng)體系的配制為：取n×19.6 μL Mix A或Mix B和n×0.4 μL TB酶混合液加入1.5 mL離心管內(nèi)，振蕩5 s，分別向PCR反應(yīng)管內(nèi)分裝20 μL即為反應(yīng)體系。向反應(yīng)體系再加入5 μL相應(yīng)提取樣品或陽/陰對照，振蕩5 s，瞬時(shí)離心，去除大的氣泡，轉(zhuǎn)到PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增和熔解曲線分析，以4個(gè)通道任一通道中樣品的熔點(diǎn)低于陽性對照2 ℃時(shí)判定為突變型，樣品對利福平耐藥。操作及結(jié)果判讀嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.6質(zhì)量控制 (1)人員培訓(xùn)：操作人員全部經(jīng)省級結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)培訓(xùn)和省臨床檢驗(yàn)中心核酸擴(kuò)增培訓(xùn)，具有省級認(rèn)可的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室操作能力和PCR上崗證。(2)羅氏固體培養(yǎng)基、含藥羅氏培養(yǎng)基，每批次均有廠家提供的敏感性測試和無菌試驗(yàn)合格報(bào)告。(3)每年均通過國家和省級組織的PCR質(zhì)評及藥敏質(zhì)評考核。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2．1MTB核酸檢測和痰培養(yǎng)結(jié)果 把金胺O染色鏡檢結(jié)果為陰性的1 040份痰標(biāo)本分別進(jìn)行痰培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，痰培養(yǎng)檢測為MTB的有74份，陽性率為7.1%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測為MTB的有101份，陽性率為9.7%，兩者經(jīng)一致性檢驗(yàn)，有較高的一致性(Kappa=0.83)。見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測與痰培養(yǎng)結(jié)果(n)

2．2利福平耐藥突變和表型藥敏結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測為陽性的101份痰標(biāo)本中，剔除Ct值>20和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測為陽性而痰培養(yǎng)檢測為陰性的標(biāo)本，最終有74例患者的標(biāo)本納入研究，利福平耐藥突變檢測全部有效。熔解曲線法檢測利福平耐藥7例，rpoB基因513～520區(qū)域共8個(gè)氨基酸密碼子，突變4例，rpoB基因529～533區(qū)域共5個(gè)氨基酸密碼子，突變3例，耐藥率為9.5%；表型藥敏試驗(yàn)檢測利福平耐藥8例，耐藥率為10.8%；兩者經(jīng)一致性檢驗(yàn)，有較高的一致性(Kappa=0.79)。見表2。

表2 熔解曲線法與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果(n)

3 討 論

目前使用的結(jié)核分枝桿菌檢測方法包括痰涂片染色鏡檢、痰培養(yǎng)和分子生物學(xué)檢查。痰涂片染色找到抗酸桿菌和痰培養(yǎng)陽性被認(rèn)為是肺結(jié)核診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。痰涂片染色找到抗酸桿菌可快速診斷，但其受痰標(biāo)本質(zhì)量、觀察視野等諸多因素影響，其敏感性較低；而痰培養(yǎng)耗時(shí)較長[4]，易造成延遲診斷，不能快速切斷傳染源。有研究表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可用于結(jié)核的快速診斷和利福平耐藥性檢測[5]，但試劑成本高、儀器維護(hù)費(fèi)用高。熔解曲線法是PCR和熔解曲線分析方法的結(jié)合，由于野生型序列具有自身特定的熔點(diǎn)，當(dāng)基因突變時(shí)探針結(jié)合力下降導(dǎo)致熔點(diǎn)下降，通過監(jiān)測熒光雜交信號區(qū)分出野生型與突變型。本研究將痰涂陰疑似肺結(jié)核患者的標(biāo)本采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、熔解曲線法檢測痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌核酸基因、利福平耐藥突變，與痰培養(yǎng)、表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較，一致性較高(K>0.75)。

本研究痰培養(yǎng)檢測出陽性74例，陽性率為7.1%，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測出陽性101例，陽性率為9.7%，實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽性率比痰培養(yǎng)陽性率略高，與核酸檢測的敏感性高有關(guān)，比劉蘭瑞等[5]報(bào)道的低，原因可能與本研究納入對象為痰涂陰患者有關(guān)。表型藥敏試驗(yàn)檢測利福平耐藥8例，熔解曲線法檢測利福平耐藥7例，氨基酸密碼子區(qū)域集中在513～520區(qū)域和529～533區(qū)域，其中的差異值得進(jìn)一步探索，但熔解曲線法與曾松芳等[6]、陳榕等[7]報(bào)道的結(jié)果一致，說明此方法具有可接受的一致性和很好的替代性。

熔解曲線法是國內(nèi)產(chǎn)品，檢測時(shí)間在3 h左右，比類似的國外產(chǎn)品檢測時(shí)間略長[8]，利福平檢測覆蓋rpoB基因507～533共27個(gè)氨基酸密碼子，但國內(nèi)試劑成本低、儀器維護(hù)費(fèi)用少、可擴(kuò)展的藥物種類比國外的豐富[9]，還能選擇性地檢測利福平、異煙肼、卡那霉素、喹諾酮類藥物的突變基因，使熔解曲線法具有選擇優(yōu)勢。有報(bào)道對利福平耐藥的患者80%是耐多藥患者，這樣一般只需檢測利福平的耐藥性，就可大致推斷患者的耐多藥性，可大幅降低患者的負(fù)擔(dān)、提高患者的依從性和化療的準(zhǔn)確性[10]。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑使用非常方便，試劑已制成干粉并在八聯(lián)管中保存，檢測時(shí)只需加DNA模板和裂解液就可上PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增；而耐藥突變檢測覆蓋了利福平、異煙肼、卡那霉素、喹諾酮類藥物，更能符合臨床診斷耐多藥、多耐藥和廣泛耐藥結(jié)核病的需求。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR、熔解曲線法與痰培養(yǎng)、表型藥敏試驗(yàn)檢測具有較好的一致性(Kappa>0.75)，熔解曲線法試劑成本低、儀器維護(hù)費(fèi)用低，檢測耐藥突變的藥物品種全面，生物安全性能好，且快速經(jīng)濟(jì)，使用方便，可以用于痰標(biāo)本直接檢測；因此該方法在快速診斷肺結(jié)核和耐藥結(jié)核病上具有應(yīng)用前景，對結(jié)核病防控具有重要意義。有條件的結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)可以同時(shí)采用痰涂片染色鏡檢和痰培養(yǎng)檢測，對痰陰性患者再作核酸檢測，對核酸陽性再行藥物耐藥突變檢測，這樣可及早發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核和耐藥肺結(jié)核患者。但此方法也有其不足之處：(1)有些標(biāo)本會出現(xiàn)核酸抑制；(2)Ct值>20(濃度低)時(shí)測耐藥突變出現(xiàn)不明確的結(jié)果；(3)耐藥突變試劑配制麻煩；(4)利福平檢測只覆蓋rpoB基因507～533區(qū)域共27個(gè)氨基酸密碼子。