黃芩苷元鼻噴霧劑對(duì)豚鼠變應(yīng)性鼻炎的療效觀察*

彭寶紅

三亞市康復(fù)療養(yǎng)中心耳鼻咽喉科，海南三亞 572000

變應(yīng)性鼻炎（AR）是一種機(jī)體接觸變應(yīng)原后由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病，典型臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性噴嚏、清水樣涕、鼻塞、鼻癢等，伴有眼癢、結(jié)膜充血等不適［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有40%的人口深受AR影響，AR極易演變?yōu)檫^(guò)敏性哮喘，后者是嚴(yán)重影響生命健康的慢性呼吸道疾病之一。

臨床治療AR的藥物有糖皮質(zhì)激素類(lèi)、抗組胺類(lèi)、抗白三烯類(lèi)等［2］，其中抗組胺類(lèi)藥物如氯雷他定等具有良好的安全性，目前運(yùn)用廣泛。但是也存在易嗜睡、咽部刺激征和鼻干等諸多不良反應(yīng)，以及耐藥和藥物依賴等問(wèn)題。我國(guó)傳統(tǒng)中藥藥方如補(bǔ)中益氣湯、玉屏風(fēng)散和蒼耳子散等，在治療AR以及過(guò)敏性哮喘方面具有良好的臨床療效。通過(guò)前期分析研究發(fā)現(xiàn)，上述中藥方劑的共同特點(diǎn)是具有黃芩這一成分，提示黃芩可能在抑制上呼吸道過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。黃芩苷元（Baicalein）是從黃芩根中提取的黃酮類(lèi)化合物，是中藥黃芩的主要活性成分［3］。黃芩苷元能夠穩(wěn)定肥大細(xì)胞、抑制組胺和花生四烯酸，白三烯和前列腺素E生成及釋放、減輕血管擴(kuò)張以及降低血管通透性等，具有良好的抗過(guò)敏作用［4］。桉葉油是樟科植物等葉子脛骨水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，其主要成分桉葉素具有殺菌、抑菌消炎等作用，同時(shí)也可以作為一種脂溶性溶液，用于鼻咽喉疾病的霧化治療［5］。本科室在前期研究的基礎(chǔ)上，利用桉葉油和黃芩苷元，加入適量的保濕劑和防腐劑制成鼻噴霧劑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立AR豚鼠模型，觀察黃芩苷元鼻噴霧劑對(duì)AR豚鼠鼻部行為學(xué)癥狀、血清炎癥細(xì)胞因子以及免疫球蛋白的影響，為黃芩苷元治療AR提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：卵清蛋白（OVA，美國(guó)Sigma公司，V級(jí)）。0.9%生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）。儀器：超聲霧化器（江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號(hào)：402AI），恒溫循環(huán)水浴槽(上海庚庚儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：DC0506)，監(jiān)控?cái)z像頭（360科技有限公司，1080P智能攝像機(jī)）。黃芩苷元（江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司，貨號(hào)152089），一次性使用靜脈血樣采集器(綠色-肝素管，康德萊)，一次性使用采血針（康德萊），眼科手術(shù)剪（六六眼科醫(yī)療器械有限公司），2.5 mL注射器（康德萊），消毒用碘伏（海氏海諾），外科用無(wú)菌敷料（海氏海諾）。IL-4酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海碧云天生物制劑有限公司），離心機(jī)（LD5-2A，上海離心機(jī)廠）。

1.2 動(dòng)物和分組

SPF級(jí)成年Hartley豚鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（350±50）g，購(gòu)于海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK瓊2013-0009）。動(dòng)物飼養(yǎng)于空調(diào)房（室溫20℃～26℃），可自由攝食及攝水，定時(shí)定量供應(yīng)新鮮潔凈綠葉蔬菜，早晚12 h間斷照明。所有豚鼠均利用改良的AR模型方法復(fù)制成功，隨后將實(shí)驗(yàn)豚鼠分為模型組（0 mL），低劑量組（0.2 mL/min），中劑量組（0.5 mL/min）和高劑量組（1 mL/min），每組各10只。

1.3 建模方法和流程

OVA約30 mg加入0.9%生理鹽水100 mL制成溶液，1 mL/只腹腔注射，隔日一次，持續(xù)一周作基礎(chǔ)致敏。間隔5 d后，將豚鼠移至半封閉透明塑料盒（10 cm×5 cm×5 cm大?。┲校惨蚤_(kāi)洞（洞口面積剛好能夠放下霧化器吸管）的潔凈塑料透明蓋板，1%OVA生理鹽水溶液10 mL從開(kāi)洞處?kù)F化吸入5 min，每日1次，連續(xù)7 d，末次霧化完成1 h后，將豚鼠雙足置于0℃～4℃恒溫循環(huán)水浴槽中激發(fā)1 min，至此AR模型完成。隨后豚鼠正常條件飼養(yǎng)，除模型組不予霧化處理，其余各組豚鼠按照不同劑量的黃芩苷元桉葉油鼻噴霧劑，超聲霧化吸入10 min，每日2次，連續(xù)2周。

2 檢測(cè)指標(biāo)

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

末次給藥1 h后，將豚鼠及采血管做好標(biāo)記后，用10%水合氯醛麻醉，抓緊豚鼠頸部皮膚，固定好豚鼠頭部，消毒其眼眶后邊緣1～1.5 cm區(qū)域，并輕輕向下壓迫頸部?jī)蓚?cè)，使眼球充血、外突，用一次性使用的采血針針頭頂端，垂直插入內(nèi)眥靜脈叢，另一端接采血管承接靜脈血，見(jiàn)血液連續(xù)滴入采血管中，當(dāng)達(dá)到所需血量時(shí)退出采集針，立即用無(wú)菌敷料壓迫數(shù)秒止血。采集的血液推入離心管靜置3 h后，4℃3 000 r/min離心10 min，分裝后均于-20℃冰箱中冷凍保存，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)豚鼠血清中IL-4含量，該步驟重復(fù)3次取平均值。

2.2 行為學(xué)觀察和評(píng)分

各組豚鼠在分籠飼養(yǎng)期間，每籠各安裝1臺(tái)監(jiān)控?cái)z像頭，每日24 h持續(xù)錄制，以每次給藥后2 h為主要觀察時(shí)段，對(duì)豚鼠的攝食、攝水、排便和精神活動(dòng)狀態(tài)以及過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分。方法如下。鼻癢：輕度為1分，輕擦鼻幾次；重度為2分，抓搔鼻、面不止，到處擦磨。噴嚏：1～3個(gè)記1分，4～10個(gè)記2分，l0個(gè)以上記3分。清涕：流至前鼻孔記1分，過(guò)前鼻孔記2分，流涕滿面記3分。哮喘：呼吸急促計(jì)1分，明顯喘息計(jì)2分，喘息致死計(jì)3分。于最后一次霧化吸入黃芩苷元制劑鼻噴霧劑后30 min內(nèi)，觀察各組豚鼠的過(guò)敏性癥狀，將各癥狀分累積，如總分≥5分則表示造模成功。

2.3 蛋白免疫印跡

豚鼠斷頸處死后，暴露雙側(cè)鼻腔，取靠近上鼻甲的部分鼻部黏膜組織，用于蛋白免疫印跡檢查，采集IgE和內(nèi)參β-actin條帶圖像，Image J軟件確定圖像中各個(gè)條帶的凈光密度，用目標(biāo)條帶凈光密度與內(nèi)參凈光密度比值比較各組之間蛋白表達(dá)的差異，該步驟重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 癥狀評(píng)分

建立AR模型后無(wú)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，所有豚鼠均出現(xiàn)鼻過(guò)敏癥狀，經(jīng)鼻癥狀評(píng)分均達(dá)到AR模型標(biāo)準(zhǔn)后，各組豚鼠經(jīng)黃芩苷元鼻噴霧劑干預(yù)后，低、中、高劑量組有4、2、1只動(dòng)物出現(xiàn)過(guò)敏性鼻炎表現(xiàn)，末次霧化后各組豚鼠過(guò)敏癥狀評(píng)分結(jié)果如表1，各組癥狀評(píng)分之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.237，P＜0.05）。黃芩苷元干預(yù)組豚鼠癥狀評(píng)分較模型組均有所下降，其中高劑量組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.473，P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 不同組豚鼠癥狀評(píng)分以及IL-4表達(dá)情況（±s）

表1 不同組豚鼠癥狀評(píng)分以及IL-4表達(dá)情況（±s）

檢測(cè)指標(biāo)癥狀評(píng)分IL-4(pg/mL)模型組（n=10）6.50±1.31 31.26±3.69低劑量組（n=10）5.10±0.92 29.69±5.78中劑量組（n=10）4.73±0.89 24.84±4.53高劑量組（n=10）3.04±0.62 19.13±3.96

3.2 ELISA檢測(cè)血清IL-4含量

模型組和低劑量組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.142，P＞0.05），中劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.258，P＜0.05），高劑量組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.364，P＜0.01）。

3.3 蛋白免疫印跡

本實(shí)驗(yàn)考慮豚鼠比較膽小敏感，麻醉以及取樣過(guò)程中可能會(huì)引起應(yīng)激反應(yīng)，影響血清中IL-4表達(dá)。因此，本研究檢測(cè)了AR豚鼠鼻黏膜組織中IgE表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組IgE表達(dá)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.374，8.364，P＜0.01），低劑量黃芩苷元組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.374，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 不同組IgE表達(dá)示意圖

4 討論

AR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為其主要受到遺傳、環(huán)境以及內(nèi)分泌等因素影響，Th1/Th2比例失衡，大量IL-4以及過(guò)量IgE釋放，共同參與誘發(fā)AR。目前臨床治療AR的一線藥物為皮質(zhì)類(lèi)固醇和抗組胺藥，二線藥物包括抗白三烯藥物、抗變態(tài)反應(yīng)藥物、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑及炎性介質(zhì)拮抗劑等［6］。黃芩苷元作為一種天然黃酮類(lèi)化合物，在抑制IL-4、IL-1等炎性因子表達(dá)方面作用顯著，和γ—干擾素合用還能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，減輕過(guò)敏反應(yīng)［7］。黃芩苷元在部分抗過(guò)敏性哮喘的中藥方劑中發(fā)揮的作用，被認(rèn)為可能是調(diào)節(jié)免疫功能和抗過(guò)敏的活性成分之一。豚鼠是高致敏性動(dòng)物，其血清中含有大量補(bǔ)體，常作為AR的模型動(dòng)物，本實(shí)驗(yàn)使用OVA作為致敏劑，通過(guò)腹腔注射和霧化吸入方式激發(fā)AR模型［8］。

通過(guò)對(duì)豚鼠過(guò)敏性癥狀進(jìn)行評(píng)分可以初步判斷建模是否成功，但既往對(duì)AR動(dòng)物模型評(píng)分存在較大的主觀性，容易受到觀察時(shí)機(jī)或者觀察者水平、責(zé)任心等影響，出現(xiàn)遺漏和誤判。本研究選擇高清攝像系統(tǒng)對(duì)豚鼠鼻部癥狀進(jìn)行觀察，既避免了長(zhǎng)期觀察帶來(lái)的注意力下降，又能夠明確藥物干預(yù)對(duì)豚鼠鼻部癥狀的影響。本研究采用顧曉娜等［9］改良的AR豚鼠模型，通過(guò)霧化吸入方式給藥，有利于藥物快速吸收，便于獲取更客觀、可靠的評(píng)分和數(shù)據(jù)。

AR在病程不同階段受到輔助T細(xì)胞的影響，如Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過(guò)釋放IL-2來(lái)抑制Th2細(xì)胞活化，而Th2主要介導(dǎo)體液免疫，可產(chǎn)生IL-4、IL-5等炎性細(xì)胞因子來(lái)抑制Th1細(xì)胞，當(dāng)Th1分化不足時(shí)，Th2細(xì)胞出現(xiàn)亢進(jìn)現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的IL-4并誘發(fā)IgE大量釋放。臨床上可以通過(guò)檢測(cè)IL-4水平判斷AR模型是否建立成功，通過(guò)IgE可以檢測(cè)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度［10］。本研究中，中、高劑量組豚鼠血清中IL-4，鼻腔黏膜組織中IgE表達(dá)水平較模型組均顯著下降，表明黃芩苷元具有減輕豚鼠鼻過(guò)敏癥狀的作用，且呈現(xiàn)劑量—依賴效應(yīng)。黃芩苷元抑制IL-4表達(dá)的作用，可能與其具備的抗炎、緩解組織炎性損傷等作用有關(guān)［11］。模型組豚鼠出現(xiàn)鼻腔黏膜微血管擴(kuò)張，表面出現(xiàn)典型慢性炎癥，分泌物增加［12］，是導(dǎo)致鼻癢、眼癢、水樣涕、連續(xù)噴嚏和鼻塞等癥狀的組織基礎(chǔ)［13］，而使用黃芩苷元鼻噴霧劑干預(yù)后上述表現(xiàn)顯著改善。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷元具有改善AR豚鼠過(guò)敏癥狀的作用，該效應(yīng)可能與黃芩苷元降低血清中IL-4以及IgE表達(dá)水平有關(guān)。但AR是一種主觀性很強(qiáng)的慢性疾病，患者主觀體驗(yàn)、心理狀態(tài)對(duì)疾病療效影響甚大。本研究對(duì)AR長(zhǎng)期變化的研究尚少，后期有待進(jìn)一步研究。