冬瓜抗氧化基因的克隆及其在非生物脅迫下的表達(dá)分析

錢玉磊，閆晉強(qiáng)，楊松光，劉文睿，謝大森，吳智明，江 彪

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）是葫蘆科冬瓜屬一年生蔓生草本植物，富含多種維生素和膳食纖維，是典型的高鉀低鈉蔬菜，兼具藥用和保健功效［1-2］。冬瓜耐儲(chǔ)運(yùn)、貨架期長，在調(diào)節(jié)蔬菜淡季、保證周年供應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［3-4］。抗氧化（Oxidation Resistance，OXR）基因廣泛存在于真核細(xì)胞中，是一類能有效降低細(xì)胞中多余活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的基因［5］。研究表明，OXR基因在植物抵抗逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用［6-7］，因此開展冬瓜BhiOXR基因的克隆及其在非生物脅迫下的表達(dá)特征分析，對(duì)該基因的功能研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】OXR基因最早在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，其C 端含有TLDc〔TBC（Tre2/Bub2/Cdc16）、LysM（Lysine motif）、Domain catalytic〕保守結(jié)構(gòu)域，具有重要的抗氧化作用［5］。自2019 年在模式植物擬南芥中鑒定出6 個(gè)OXR基因家族成員以來［6］，相繼在向日葵［7］、十字花科植物［8］和小麥［9］等多種植物的全基因組范圍內(nèi)鑒定出OXR家族成員。擬南芥AtOXR2是一種線粒體蛋白，能夠減輕酵母oxr1突變體氧化應(yīng)激的敏感性，也可通過影響體內(nèi)的活性氧水平提高過表達(dá)AtOXR2擬南芥的光合作用效率和對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，促進(jìn)植株生長，從而提高植株整體的生物量和種子產(chǎn)量［6］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AtOXR2也可通過影響轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)水楊酸代謝來增強(qiáng)植株的抗病性［10］；擬南芥和玉米中異源過表達(dá)向日葵HaOXR2，可增強(qiáng)植株非生物氧化應(yīng)激脅迫的耐受性［7］。李寒等［9］研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaOXR1.6A和TaOXR2.5D在一定程度上響應(yīng)氧化脅迫，可通過調(diào)控水楊酸途徑來增強(qiáng)植株的免疫力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2019 年11 月，本課題組發(fā)表了第一張冬瓜高質(zhì)量基因組圖譜［11］，這為基于全基因組鑒定、克隆和分析冬瓜BhiOXR基因奠定了基礎(chǔ)，已有研究表明OXR基因在響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用，然而截至目前仍未有冬瓜BhiOXR基因在非生物脅迫響應(yīng)方面的相關(guān)研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以冬瓜高代自交系B227（參考基因組測序所用材料）的幼苗為試驗(yàn)材料，克隆冬瓜6 個(gè)BhiOXR基因，并分析其響應(yīng)4 種非生物脅迫處理（低溫、高溫、鹽和干旱）的表達(dá)特征，以期為深入研究冬瓜BhiOXR基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本研究所用材料為冬瓜高代自交系B227，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，于2020年7 月播種在培養(yǎng)缽中，置于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所溫室進(jìn)行培養(yǎng)。待幼苗長至兩葉一心期，分別將長勢一致的冬瓜幼苗置于4℃和40℃培養(yǎng)箱（16 h 光照、8 h 黑暗）進(jìn)行低溫和高溫處理，利用150 mmol/L NaCl 溶液模擬鹽脅迫、10%PEG6000 溶液模擬干旱脅迫，每個(gè)處理5 次重復(fù)。分別取未處理植株、不同脅迫處理后4、8、12 和24 h 植株的適量葉片，放置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 冬瓜BhiOXR 基因家族成員鑒定及克隆

以擬南芥6 個(gè)AtOXR基因家族成員的蛋白質(zhì)序列為種子文件，通過hmmsearch 和BLASTP搜索獲得冬瓜BhiOXR基因，并利用MEGA11 對(duì)冬瓜BhiOXR基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。分別利用EasyPure?RNA Kit 試劑盒（TransGen 公 司）和FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑盒（TIANGEN 公司）提取冬瓜葉片總RNA 和反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

根據(jù)冬瓜基因組數(shù)據(jù)庫中BhiOXR基因的CDS 序列，在ORF 兩端設(shè)計(jì)全長引物（表1），利用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增BhiOXR基因的CDS 全長。反應(yīng)體系為：25 μL Primer STAR Max DNA Polymerase，上、下引物（10 μmol/L）各1 μL，1 μ L cDNA（10 ng/μL），22 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s；72℃終延伸5 min，35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將目的片段回收測序。

表1 BhiOXR 基因克隆引物信息Table 1 Information of primers used for BhiOXR gene cloning

1.3 冬瓜BhiOXR 基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)基因的位置信息，利用MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）將其定位到相應(yīng)的染色體上。提取每個(gè)BhiOXR基因起始密碼子前2 500 bp 序列，在PlantCare 網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）獲得順式作用元件信息；提取冬瓜BhiOXR基因蛋白質(zhì)序列，提交植物蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測網(wǎng)站（Plant-mPLoc，http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的具體位置［12］；利用在 線SOPMA 工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測BhiOXR 蛋白含有的二級(jí)結(jié)構(gòu)［13］；利用SWISSMODEL 在線軟件預(yù)測冬瓜BhiOXR基因的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)［14］。

1.4 冬瓜BhiOXR 基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

在NCBI Primer-Blast 上設(shè)計(jì)6 個(gè)BhiOXR基因和內(nèi)參基因BhiUBQ的特異性qRT-PCR 引物（表2），引物由廣州生工生物工程有限公司合成。提取不同非生物脅迫處理樣品的總RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA（方法參考材料與方法1.2），qRTPCR 使用TransStart?Green qPCR SuperMix 試劑盒（TransGen 公司）在CFX ConnectTM實(shí)時(shí)熒光定量儀器〔BIO-RAD（美國）公司〕上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系為：5 μL 2 × TransStart?Green qPCR SuperMix，上、下向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 μL cDNA（10 ng/μL），2 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s、55℃退火15 s、72℃延伸10 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表2 qRT-PCR 引物信息Table 2 Information of primers used for qRT-PCR

以冬瓜BhiUBQ作為內(nèi)參對(duì)照，每個(gè)BhiOXR基因處理0 h 的Ct 值為基準(zhǔn)，采用2-??Ct方法計(jì)算冬瓜BhiOXR基因在4種非生物脅迫處理后4、8、12、24 h 后的相對(duì)表達(dá)量，并采用LSD檢驗(yàn)方法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬瓜BhiOXR 基因的鑒定及克隆

以擬南芥AtOXR基因?yàn)榉N子序列，在冬瓜基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定得到6 個(gè)冬瓜BhiOXR基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析可將6 個(gè)基因分為5 個(gè)亞族（OXR1～OXR5），其中OXR2亞族有2 個(gè)成員、其余亞族僅有1 個(gè)成員。因此，將冬瓜6 個(gè)BhiOXR基因分別命名為BhiOXR1、BhiOXR2a、BhiOXR2b、BhiOXR3、BhiOXR4、BhiOXR5。根據(jù)BhiOXR基因的CDS 序列設(shè)計(jì)全長引物，以冬瓜自交系B227 的葉片cDNA 為模板，利用RT-PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，成功克隆獲得BhiOXR2a、BhiOXR3、BhiOXR4和BhiOXR5等4 個(gè)基因的全長CDS（圖1），且克隆產(chǎn)物經(jīng)測序與冬瓜基因組數(shù)據(jù)庫CDS 序列一致。經(jīng)嘗試采用不同DNA 聚合酶和擴(kuò)增條件仍無法克隆BhiOXR1和BhiOXR2b的全長CDS 后，利用新的反向引物克隆獲得截短CDS 片段（圖1）。

圖1 6 個(gè)冬瓜BhiOXR 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of six BhiOXR genes in wax gourd

2.2 冬瓜BhiOXR 基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)克隆獲得的BhiOXR基因進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，各個(gè)亞族內(nèi)BhiOXR基因和AtOXR基因同源性較高（圖2）。6 個(gè)冬瓜BhiOXR基因的CDS序列長度變化范圍為777～1 620 bp，編碼的氨基酸數(shù)量最多有539 個(gè)（BhiOXR5），最少僅258個(gè)（BhiOXR4）。染色體定位結(jié)果（表3）顯示，冬瓜BhiOXR基因不均勻分布于4 條染色體，其中1、9、12 號(hào)染色體各有1 個(gè)成員，11 號(hào)染色體有3 個(gè)成員。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明BhiOXR1、BhiOXR2a和BhiOXR2b的編碼產(chǎn)物位于細(xì)胞核，BhiOXR3和BhiOXR5的編碼產(chǎn)物位于葉綠體，而BhiOXR4的編碼產(chǎn)物存在于多個(gè)細(xì)胞器中。

圖2 冬瓜BhiOXR 基因與擬南芥AtOXR 基因的同源性分析Fig.2 Homology analysis of BhiOXR genes from wax gourd and AtOXR gene from Arabidopsis

表3 冬瓜BhiOXR 基因家族理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 3 Physicochemical properties and subcellular localization prediction of BhiOXR gene family in wax gourd

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（表4）表明，BhiOXR所編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由4 種結(jié)構(gòu)組成：無規(guī)則卷曲（構(gòu)成無規(guī)則卷曲的氨基酸個(gè)數(shù)占總氨基酸個(gè)數(shù)的57.69%～43.04%）、α-螺旋（34.32%～21.00%）、延伸鏈（13.37%～25.19%）和

表4 冬瓜BhiOXR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 4 Prediction of secondary structure of BhiOXR proteins in wax gourd

β-轉(zhuǎn)角（2.19%～9.30%）。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖3）顯示，6 個(gè)BhiOXR基因之間的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度相似性，暗示其可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖3 冬瓜BhiOXR 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of tertiary structure of BhiOXR proteins in wax gourd

順式作用元件分析結(jié)果表明，冬瓜BhiOXR基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有多種抗逆元件，如參與低溫響應(yīng)的LTR、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的TC-rich repeats、參與厭氧誘導(dǎo)的ARE 等順式作用元件，暗示它們可能參與非生物脅迫響應(yīng)。

2.3 冬瓜BhiOXR 基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

為明確6 個(gè)冬瓜BhiOXR基因在非生物脅迫下的表達(dá)特征，利用qRT-PCR 研究其在低溫（4 ℃）、高溫（40 ℃）、鹽脅迫（150 mmol/L NaCl）和干旱（10%PEG6000）等非生物脅迫下的表達(dá)特征。

2.3.1 低溫脅迫BhiOXR2a在低溫處理后表達(dá)量明顯降低，而BhiOXR1、BhiOXR2b、BhiOXR4和BhiOXR5均呈現(xiàn)先顯著升高、隨后下降的趨勢。BhiOXR3在處理后4 h 表達(dá)量輕微升高，12 h 和24 h 表達(dá)量顯著降低（圖4）。

圖4 冬瓜BhiOXR 家族成員在低溫脅迫下的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of wax gourd BhiOXR family members under low temperature stress

2.3.2 高溫脅迫 圖5 顯示，高溫處理后，BhiOXR2a、BhiOXR2b和BhiOXR4的表達(dá)量有波動(dòng)，但均未顯著升高或降低；BhiOXR1、BhiOXR3和BhiOXR5的表達(dá)量均顯著升高，并分別在24、12 和12 h 達(dá)到峰值。

圖5 冬瓜BhiOXR 家族成員在高溫脅迫下的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of wax gourd BhiOXR family members under high temperature stress

2.3.3 鹽脅迫 鹽處理后，BhiOXR2a和BhiOXR4的表達(dá)量顯著降低；BhiOXR2b的表達(dá)量在鹽處理后4 h 升高并達(dá)到峰值，隨后恢復(fù)正常水平；BhiOXR3和BhiOXR5在鹽處理后表達(dá)量有所下降，但降幅不大；BhiOXR1的表達(dá)量在鹽處理前后沒有發(fā)生顯著變化（圖6）。

圖6 冬瓜BhiOXR 家族成員在鹽脅迫下的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of wax gourd BhiOXR family members under salt stress

2.3.4 干旱脅迫BhiOXR3的表達(dá)量在干旱處理后8 h 輕微降低，BhiOXR5的表達(dá)量在處理后4 h和8 h 也降低，但均未發(fā)生顯著降低；BhiOXR1在干旱處理前期表達(dá)無明顯變化，24 h 時(shí)表達(dá)量顯著升高；BhiOXR2a在干旱處理下表達(dá)量先下降（12 h 時(shí)達(dá)到最低），然后又急劇升高，24 h 時(shí)達(dá)到峰值；BhiOXR2b的表達(dá)量在受到干旱脅迫后有所升高；BhiOXR4的表達(dá)量有所下降，處理后12 h 達(dá)到谷值（圖7）。

圖7 冬瓜BhiOXR 家族成員在干旱脅迫下的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of wax gourd BhiOXR family members under drought stress

3 討論

非生物脅迫會(huì)影響植物的生長和發(fā)育，最終會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量減少和品質(zhì)下降［13］。處于非生物脅迫下的植物，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）［14］，這些ROS 將破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 等生物大分子物質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡［15-17］。前人研究表明，OXR基因可以影響氧自由基清除基因的表達(dá)，降低細(xì)胞中的ROS水平，從而減少ROS 對(duì)細(xì)胞的損傷［5］。通過對(duì)冬瓜OXR基因的全基因組鑒定，我們獲得6 個(gè)OXR成員，根據(jù)與擬南芥OXR基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，可將其分為OXR1～OXR5等5 個(gè)亞族，其中OXR2亞族有2 個(gè)成員、其余亞族均有1 個(gè)成員；擬南芥OXR有6 個(gè)成員，OXR3亞族有2 個(gè)成員，其余亞族都僅有1 個(gè)成員［6］；菊科植物向日葵也有6 個(gè)OXR成員，其中OXR1亞族有2 個(gè)成員，其余亞族都有1 個(gè)成員［7］。張夢云等［8］通過對(duì)7 種十字花科植物的OXR基因進(jìn)行全基因組鑒定，發(fā)現(xiàn)十字花科7 種物種中的OXR基因家族成員的數(shù)量為5～11 個(gè)，且位于OXR1～OXR5亞族的成員數(shù)量不一致；單子葉植物小麥有15 個(gè)OXR成員，可分為Ⅰ～Ⅳ組，Ⅰ組有6 個(gè)成員，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組分別有3 個(gè)成員［9］。說明OXR家族成員的個(gè)數(shù)以及不同OXR亞族成員的個(gè)數(shù)也會(huì)因物種特異性而產(chǎn)生差異。

基因表達(dá)趨勢通?？梢苑从称湎鄳?yīng)功能［18-19］。Zhang 等［20］通過對(duì)西瓜和甜瓜超氧化物歧化酶（SOD）基因家族的全基因組鑒定及其在脅迫下的表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)CmSOD和ClSOD基因在低溫、NaCl 和PEG6000 下表達(dá)明顯上調(diào)，表明它們可能在應(yīng)答脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。C2H2 鋅指蛋白家族（C2H2-ZFP）在植物的生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中起著重要作用，Chen 等［21］從黃瓜基因組中共鑒定出101 個(gè)C2H2鋅指蛋白家族成員，通過qRT-PCR 分析了16 個(gè)C2H2-ZFP基因在低溫、干旱、鹽和脫落酸（ABA）脅迫下的表達(dá)特征，表明C2H2-ZFP基因可能參與不同的信號(hào)通路。為揭示小麥TaOXR基因在非生物脅迫〔NaCl、甘露醇（Mannitol）、SA、H2O2〕中的潛在功能，李寒等［9］使用qRT-PCR分析TaOXR1.6A和TaOXR2.5D的表達(dá)水平，結(jié)果顯示兩者均能響應(yīng)氧化脅迫。

因此，為了解冬瓜BhiOXR基因在非生物脅迫應(yīng)答過程中的重要作用，本研究利用qRTPCR 技術(shù)分析BhiOXR基因在4 種非生物脅迫（低溫、高溫、鹽和干旱）下的表達(dá)特征，結(jié)果表明6 個(gè)BhiOXR基因均能響應(yīng)特定的非生物脅迫，推測BhiOXR基因可能在抵抗非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。然而，不同的BhiOXR基因響應(yīng)的非生物脅迫有異同，如BhiOXR1響應(yīng)低溫、高溫和干旱脅迫，不響應(yīng)鹽脅迫；BhiOXR2a、BhiOXR2b和BhiOXR4響應(yīng)低溫、鹽和干旱脅迫，不響應(yīng)高溫脅迫；BhiOXR3和BhiOXR5響應(yīng)低溫、高溫和鹽脅迫，不響應(yīng)干旱脅迫，這可能與基因的功能特性有關(guān)。

4 結(jié)論

通過全基因組鑒定、克隆獲得6 個(gè)冬瓜OXR基因家族成員，并對(duì)這些成員的物理化學(xué)性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、染色體定位、啟動(dòng)子、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過qRT-PCR 分析其響應(yīng)低溫、高溫、鹽脅迫和干旱等非生物脅迫的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)冬瓜BhiOXR基因受低溫、高溫、鹽和干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并且不同的BhiOXR基因響應(yīng)的非生物脅迫有異同，由此推測6 個(gè)BhiOXR成員可能在抵御不同非生物脅迫過程中所表現(xiàn)的抗氧化作用不盡相同。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究冬瓜BhiOXR基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，對(duì)開展冬瓜分子育種有一定的參考作用。