千里香離體再生體系的建立

羅藝，楊淦麟，譚嘉娜，陳月桂，羅劍飄，楊俊賢

（1.廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所湛江研究中心，廣東 湛江 524300；2.崇左市江州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 崇左 532200）

【研究意義】千里香（Murraya paniculata）是一種蕓香科九里香屬小喬木或灌木的藥用植物，主要生于疏林或干燥的坡地中，大多分布于廣東、海南、廣西、湖南、福建等華南以及西南地區(qū)［1］，屬于熱帶亞熱帶植物［2］。千里香具有行氣止痛、活血散瘀、降血糖、抗生育以及抗腫瘤等多種功效，有利于治療感冒、風(fēng)濕骨痛、胃痛和跌打腫痛等癥狀［3-6］，是中成藥的主要原料之一，近年來市場需求量逐年增加。目前千里香繁殖的主要方法為自然播種繁殖，但在野生狀態(tài)下難以開花，致使種子數(shù)量少［7］，且種子的萌發(fā)成功率較低，種子萌動前的貯藏天數(shù)較多，完成萌發(fā)過程需要較長時間，部分種子存在休眠狀態(tài)［8］，經(jīng)過自然播種達(dá)到的叢芽繁殖系數(shù)與生根率較小，難以滿足大面積生產(chǎn)種植需求。構(gòu)建千里香離體再生繁殖體系，可滿足千里香種植的種苗需求，為我國三九集團(tuán)等藥企提供可靠的原材料及提供技術(shù)保障。

【前人研究進(jìn)展】近十幾年來，關(guān)于千里香化學(xué)成分和藥理方面的研究較多。從千里香中分離鑒定出黃酮類化合物、生物堿、香豆素等物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)千里香含有的磷脂酶A 抑制劑能夠治療蛇毒引起的肌肉損傷［9-10］；葉片的乙醇提取物具有鎮(zhèn)痛作用［11］；《中國植物信息》記載千里香的根還可用作口腔黏膜表皮的麻醉劑；提取的揮發(fā)油也具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用［12］。這些化合物的發(fā)現(xiàn)為千里香的藥用價值和應(yīng)用提供了新的思路［13-16］。在千里香種苗繁育方面，蔣健林等以四數(shù)九里香種子為材料研究種子萌發(fā)，使用最佳的IBA激素處理萌芽率只能達(dá)50%［17］。千里香在誘根方面存在生根數(shù)較少和生根率較低的問題，蔣燁用千里香無菌苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，結(jié)果表明千里香的出根數(shù)和生根率都低［7］。由此可知，千里香的高效繁殖有待進(jìn)一步提高。

【本研究切入點】以千里香成熟種子所誘導(dǎo)的叢生芽作為增殖材料，利用植物離體培養(yǎng)技術(shù)繁殖速度快、系數(shù)高的優(yōu)點，篩選出種子萌發(fā)、增殖、壯苗、生根等階段適宜的培養(yǎng)基配方，以解決其種苗大量增殖與生根的問題，建立千里香離體再生體系。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用植物生長調(diào)節(jié)劑及不同培養(yǎng)基種類，對其再生體系建立的各環(huán)節(jié)進(jìn)行探索優(yōu)化，以期獲得高效的離體再生體系，為千里香組培種苗的工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料千里香種子由三九集團(tuán)提供，試驗于2021 年9 月至2022 年5 月在廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所湛江研究中心完成。成熟千里香果實的果皮為黃綠色或者黃褐色，按照果實種子含胚數(shù)可分為單胚果實和雙胚果實，本試驗使用的是單胚果實的種子。挑選形狀大小一致、籽粒飽滿的種子進(jìn)行預(yù)處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理 外植體處理：在超凈工作臺中，種子用75%酒精處理30 s，無菌水沖洗2 次，再用0.1%升汞處理10 min，無菌水沖洗5 次，用無菌濾紙吸干水分，種子剝?nèi)シN皮，接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上。置于組織培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23（±2）℃，平均光照強(qiáng)度為1 200 lx 左右，光照時間10 h/d。

試驗培養(yǎng)基中蔗糖均為30 g/L，卡拉膠7.0 g/L，pH 值在5.8～6.2。馬鈴薯汁配制方法：市售馬鈴薯，削皮，切塊，稱取200 g 煮軟，使用榨汁機(jī)榨成汁液，加水定容至1 L 配制成200 g/L 濃度。香蕉汁配制方法：市售香蕉，剝皮，稱取200 g 香蕉加水榨汁，加水定容至1 L 配制成200 g/L 濃度。

1.2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選 以MS 為基本培養(yǎng)基，設(shè)置5 種培養(yǎng)基（表1）進(jìn)行種子萌發(fā)的誘導(dǎo)試驗。統(tǒng)計萌發(fā)率，獲得適宜種子萌發(fā)的培養(yǎng)基。

1.2.3 增殖與壯苗基本培養(yǎng)基篩選 根據(jù)千里香種胚在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的發(fā)芽情況，分別設(shè)置3/2MS、MS、3/4MS、1/2MS 4 種培養(yǎng)基（表2）進(jìn)行比較試驗。每種培養(yǎng)基接種4 瓶，每瓶接種6 叢。每3 d 觀察一次生長情況，40 d 后觀測生長勢、色澤、莖粗、落葉、褐化和死亡等指標(biāo)。

1.2.4 增殖培養(yǎng)基的篩選 以1.2.3 篩選的最佳培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA、NAA和IBA（表3）。將誘導(dǎo)的無菌芽苗頂芽或帶腋芽的莖段作為增殖材料，接種到增殖培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基配方接種4 瓶，每瓶接種6 株種苗，每株種苗帶有2～3 個叢生芽。40 d 后統(tǒng)計增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=新增殖苗數(shù)/接種苗數(shù)）與生長勢、色澤、莖粗、落葉、褐化和死亡等指標(biāo)。

1.2.5 壯苗培養(yǎng)基的篩選 以1.2.3 篩選的最佳培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，通過添加馬鈴薯汁和香蕉汁進(jìn)行生根前的壯苗培養(yǎng)，將增殖培養(yǎng)獲得的叢芽分6 個處理組合（表4），每個處理接種3 瓶，每瓶接種6 叢。40 d 后觀察生長狀況和測量植株增長高度，篩選出最適宜的壯苗培養(yǎng)基。

1.2.6 生根培養(yǎng)基的篩選 以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，添加活性炭0.1 g/L，分別添加不同濃度IBA、NAA、IBA+NAA，設(shè)置15 個處理（表5）。挑選生長一致的芽苗，切除基部及近基部1～2 片葉子，切取長度為2 cm 左右、生長健壯的不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。每個處理接種4 瓶，每瓶接種6 株。40 d 后統(tǒng)計生根率［生根率（%）=（生根的組培苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100］。

根據(jù)以上生根結(jié)果對生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置不同激素濃度IBA、IBA 與NAA 組合，并添加馬鈴薯汁與香蕉汁進(jìn)行提純復(fù)壯（表6）。每個處理接種3 瓶，每瓶接種6 株叢苗。40 d 后計算生根率。

1.2.7 煉苗移栽 將生根良好健壯的植株移到溫室中進(jìn)行閉瓶煉苗2～3 d。用鑷子夾出，清洗根部的培養(yǎng)基，在植株水分蒸騰量處于較低水平時移植，將其移栽至泥炭土∶黃心土∶珍珠巖∶鈣鎂磷肥（3∶2∶1∶0.2）的混合基質(zhì)中，灑上濃度0.4 mg/L 的生根水使其定根［17］，觀察統(tǒng)計成活率［成活率(%)=（成活的移栽苗數(shù)量/總移栽數(shù)量）×100］和苗的生長狀況。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行方差分析，F(xiàn)測驗顯著后使用新復(fù)極差法（SSR）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選

由表1 可知，MS+0.5 mg/L 6-BA 和MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA 培養(yǎng)基種子萌發(fā)速度最快，萌發(fā)率最高。為節(jié)約成本，本試驗篩選出最適合種子萌發(fā)的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L，萌發(fā)率可達(dá)62.5%。

表1 不同培養(yǎng)基種子培養(yǎng)24 d 后的萌發(fā)率Table 1 Germination rates of seeds cultured in different media for 24 d

2.2 增殖與壯苗基本培養(yǎng)基的篩選

由表2 可知，MS 培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最高，生長勢較好，表現(xiàn)最佳，1/2MS 培養(yǎng)基生長勢一般，3/4MS 培養(yǎng)基表現(xiàn)較差，而3/2MS 培養(yǎng)基出現(xiàn)落葉、褐化和死亡的現(xiàn)象，與其他3 種培養(yǎng)基相比，MS 培養(yǎng)基組培苗生長狀態(tài)最好。

表2 千里香在不同基本培養(yǎng)基中的生長狀況Table 2 Growth of Murraya paniculata in different basic media

2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選

由表3可知，在培養(yǎng)基MS添加6-BA+NAA不同配比中，培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L的叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到2.37，生長勢較好，莖稈較粗，芽苗健壯，葉片多且大。培養(yǎng)基MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L 增殖系數(shù)出現(xiàn)下降的情況，繼續(xù)加大6-BA 和NAA 濃度，增殖系數(shù)逐漸提高但其組培苗的生長勢一般，黃葉多且葉片稀疏。培養(yǎng)基6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.40 mg/L 芽苗的增殖系數(shù)急降，生長勢弱且出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在培養(yǎng)基MS 添加6-BA+IBA 不同配比中，其組培苗增殖系數(shù)相對比添加同濃度6-BA+NAA 培養(yǎng)基的增殖系數(shù)低，所有處理增殖系數(shù)<2，其中培養(yǎng)基MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.30 mg/L 的增殖系數(shù)最低，僅為1.01，生長勢也一般，可知添加IBA 對千里香的增殖效果比NAA 差。對處理間增殖系數(shù)進(jìn)行方差分析表明，各處理間的增殖系數(shù)差異顯著。因此，篩選出千里香增殖適宜培養(yǎng)基為MS +6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L。

表3 不同6-BA、NAA 與IBA 激素水平配比對增殖的效應(yīng)Table 3 Effects of different ratios of 6-BA,NAA and IBA on proliferation

2.4 壯苗培養(yǎng)基的篩選

如表4 所示，培養(yǎng)基中添加有機(jī)物馬鈴薯汁的濃度在20 g/L 時，組培苗的生長速度最快，植株增長高度大于1 cm，但葉色偏黃，葉片少，莖稈較細(xì)，出現(xiàn)葉子掉落現(xiàn)象。添加馬鈴薯汁30 g/L 培養(yǎng)基中組培苗長勢較好，植株高度0.93 cm，葉子較濃密，葉片大，莖稈粗壯挺直，且與馬鈴薯汁濃度為20 g/L 相比兩組處理間差異不顯著。培養(yǎng)基中添加有機(jī)物香蕉汁的濃度為20 g/L 時，組培苗的生長速度最快，但植株生長表現(xiàn)和增長高度不如添加馬鈴薯汁20 g/L 和30 g/L處理，且植株增長高度對比達(dá)到顯著差異。因此篩選出千里香最佳壯苗培養(yǎng)基配方為MS+馬鈴薯汁30 g/L。

表4 馬鈴薯汁與香蕉汁對千里香壯苗的效應(yīng)Table 4 Effects of potato juice and banana juice on strong seedlings of Murraya paniculata

2.5 生根培養(yǎng)基的篩選

由表5 可知，添加IBA 的培養(yǎng)基中，生根條數(shù)最多的培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+活性炭 0.1 g/L，生根率為25.0%，但無愈傷組織產(chǎn)生；添加NAA 的培養(yǎng)基中，各處理均有愈傷組織產(chǎn)生，但生根效果不理想，其中添加NAA 0.8、1.0 mg/L的培養(yǎng)基中無根系產(chǎn)生，且出現(xiàn)黃葉現(xiàn)象，表明添加NAA 對生根的效果不理想；添加IBA+NAA不同配比的培養(yǎng)基中，IBA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L 配比生根率最高，但僅為12.5%，愈傷組織也極少。

表5 不同濃度IBA、NAA、IBA+NAA 對生根的效應(yīng)Table 5 Effects of different concentrations of IBA,NAA,IBA+NAA on rooting

由表6 可知，與只添加不同配比激素的培養(yǎng)基組培苗相比較，增添有機(jī)物的培養(yǎng)基組培苗多數(shù)長勢較好。在不同濃度IBA 的培養(yǎng)基中，1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+馬鈴薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭0.1 g/L 的培養(yǎng)基組培苗根系較粗且長，根生長速度較快，葉色較濃綠，生根率最高，達(dá)55.6%；在IBA+NAA 不同配比培養(yǎng)基中，1/2 MS+馬鈴薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性碳0.1 g/L+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L 或IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基的組培苗生根率較高，達(dá)到27.8%。因此，篩選出適合千里香生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+馬鈴薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭 0.1 g/L。

表6 不同IBA、NAA 濃度和添加有機(jī)物對生根的效應(yīng)Table 6 Effects of different concentrations of IBA and NAA and organic matter addition on rooting

2.6 移栽煉苗

種苗經(jīng)煉苗移栽至泥炭土：黃心土：珍珠巖：鈣鎂磷肥（3∶2∶1∶0.2）的混合基質(zhì)中，前期萎蔫嚴(yán)重，注意噴水保濕，3～4 d 后開始恢復(fù)生長，千里香生根瓶苗移栽成活率達(dá)85%，葉片變大，莖稈變粗，除1 株葉片變黃之外，其余葉色較綠，后移植于A100 杯繼續(xù)生長，莖葉較為濃綠，莖稈健壯且木質(zhì)化（圖1）。

圖1 千里香組培過程示意圖Fig.1 Diagram of tissue culture process of Murraya paniculata

3 討論

在種子萌發(fā)培養(yǎng)的研究中，其中生長素的種類及含量對外植體的生長具有重要作用［8］，不同培養(yǎng)基對同品種不同部位外植體的誘導(dǎo)也有較大差異［18］。本研究通過誘導(dǎo)促使千里香種子萌發(fā)率達(dá)62.5%。蔣健林等以四數(shù)九里香種子為材料研究不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA、GA3、IBA 對外植體生長的影響，利用IBA 處理萌芽率最高，達(dá)50%［17］。本研究同樣是以千里香種子誘導(dǎo)萌芽，較前人研究萌芽率有所提高。這可能與千里香基因類型不同，誘導(dǎo)所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不同，從而影響了萌芽率。

增殖培養(yǎng)為后期大規(guī)模的工廠化育苗關(guān)鍵階段，基本培養(yǎng)基和香蕉汁對組培苗的增殖影響明顯［19］，在不同濃度范圍內(nèi)，不同的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對芽的增殖分化有不同影響［20-22］。本研究得出最佳增殖與壯苗的基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，生長狀態(tài)最好；最佳的增殖培養(yǎng)基其增殖系數(shù)為2.37。蔣燁以千里香大田苗誘導(dǎo)出的無菌叢生芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，配方6-BA∶KT∶NAA=1∶1∶1 時增殖效果最好，增殖系數(shù)達(dá)到了9.63［7］。但在本研究中千里香的芽增殖系數(shù)僅為2.37，使用NAA 處理時，大多數(shù)組培苗產(chǎn)生愈傷組織與褐化現(xiàn)象，導(dǎo)致芽無法繼續(xù)擴(kuò)繁，而使用IBA 處理時相對增殖系數(shù)較高。與上述報道相比較，本研究的增殖系數(shù)相對較低，上述報道采用的是千里香莖段作為外植體培養(yǎng)，而本研究使用的是成熟種子所誘導(dǎo)的叢生芽作為增殖材料，這可能與試驗材料的基因型不同及用作外植體的部位不同有關(guān)。

本試驗壯苗培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+馬鈴薯汁30 g/L，此時芽苗平均高度增長可達(dá)1 cm，芽苗長勢較好；千里香生根的適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+馬鈴薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭0.1 g/L，生根率達(dá)55.6%，以培養(yǎng)的千里香無菌生根苗為材料，通過煉苗移栽后存活率達(dá)85%以上。蔣燁使用無菌苗進(jìn)行生根培養(yǎng)得到的最高生根率為52%［7］。根據(jù)本試驗觀察，千里香的生根培養(yǎng)條件較高，與增殖階段叢芽生長狀態(tài)關(guān)系較大，本試驗結(jié)果在千里香種子胚芽誘導(dǎo)、增殖及壯苗階段獲得了較好的結(jié)果，可為生產(chǎn)實踐提供技術(shù)參考，且55.6%的生根率較前人研究有所提高，能滿足實際生產(chǎn)的部分需求但仍有提升空間，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同激素及濃度對千里香種子萌發(fā)和叢芽增殖過程影響顯著，添加馬鈴薯汁和香蕉汁利于壯苗和生根培養(yǎng)。適宜千里香種子萌發(fā)的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L，萌發(fā)率可達(dá)62.5%；最佳千里香增殖與壯苗的基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，生長狀態(tài)最好；最佳的千里香增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.15 mg/L，增殖系數(shù)為2.37；最佳的千里香壯苗培養(yǎng)基配方為MS+馬鈴薯汁30 g/L，此時芽苗平均高度增長可達(dá)1 cm，芽苗長勢較好；適宜千里香組培苗生根的培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+馬鈴薯汁30 g/L+香蕉汁30 g/L+活性炭 0.1 g/L，生根率達(dá)55.6%；以培養(yǎng)的千里香無菌生根苗為材料，通過煉苗移栽至泥炭土∶黃心土∶珍珠巖∶鈣鎂磷肥（3∶2∶1∶0.2）的混合基質(zhì)中成活率達(dá)85%以上。