外源因子調(diào)控卵母細(xì)胞體外成熟的研究進(jìn)展

孫銘菊，屈佳丹，郇延軍

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

體外受精（in vitro Fertilization，IVF）、體細(xì)胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）以及胚胎冷凍保存（Embryo Cryopreservation，EC）等胚胎工程技術(shù)的興起及應(yīng)用極大促進(jìn)了畜牧業(yè)發(fā)展，這些胚胎工程技術(shù)的進(jìn)步離不開高質(zhì)量成熟的卵母細(xì)胞。研究表明，卵母細(xì)胞在成熟過程中，尤其是在體外環(huán)境下，容易受到各種外源因子的影響，這些外源因子能夠調(diào)控卵母細(xì)胞成熟，決定卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量和在胚胎工程技術(shù)中的應(yīng)用效果。但哪些或哪類外源因子在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮主要作用，以及這些外源因子如何發(fā)揮作用影響卵母細(xì)胞成熟還沒有詳細(xì)概述，而且改善卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的外源因子，尤其是抗氧化物質(zhì)，尚未有效開發(fā)，同時(shí)，最新研究技術(shù)，尤其是單細(xì)胞多組學(xué)測序（Single-Cell Multi-Omics Sequencing）技術(shù)，尚未指出在外源因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟機(jī)理研究中的發(fā)展空間。為此，本文概述了外源有害因子和有利（抗氧化）因子對卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響，指出開發(fā)健康有效提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的外源因子的重要性，探討了外源因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟機(jī)理的最新研究方法，為創(chuàng)新和完善卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系提供了研究思路，進(jìn)而提高動(dòng)物生殖健康和加快胚胎工程技術(shù)的應(yīng)用。

1 卵母細(xì)胞體外成熟及其研究意義

卵母細(xì)胞成熟需經(jīng)歷2 次減數(shù)分裂過程，在體外成熟培養(yǎng)條件下，處于第一次減數(shù)分裂前期雙線期的卵母細(xì)胞在卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH）等激素刺激下，發(fā)生生發(fā)泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD），恢復(fù)減數(shù)分裂，最終停滯在第二次減數(shù)分裂中期（MII），并排出第一極體，即核成熟；在卵母細(xì)胞核成熟過程中，細(xì)胞質(zhì)也發(fā)生了一系列形態(tài)變化來完成胞質(zhì)成熟，涉及細(xì)胞器的重新空間定位和母源物質(zhì)的儲備利用等。

研究發(fā)現(xiàn)，體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育能力低于體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，這可能歸因于體外成熟卵母細(xì)胞的核成熟和胞質(zhì)成熟不充分。卵母細(xì)胞在體外成熟過程中，不健全的培養(yǎng)體系會致使卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量下降，而且各種外源因子也會作用于卵母細(xì)胞，調(diào)控卵母細(xì)胞成熟及后續(xù)發(fā)育能力。因此，通過對這些外源因子深入研究，充分揭示外源因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制，將會創(chuàng)新和完善卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系，提升卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量，促進(jìn)胚胎工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

2 外源因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟

目前，科研人員通過改變培養(yǎng)體系確定了大量影響卵母細(xì)胞成熟的外源因子，其中外源有害因子和有利（抗氧化）因子受到廣泛關(guān)注。

2.1 外源有害因子分類 外源有害因子即環(huán)境污染物，涉及降低卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的物質(zhì)（表1）。根據(jù)外源有害因子屬性，主要分為物理類、化學(xué)類和生物類。物理類有害因子包括熱應(yīng)激（Heat Stress）、各種輻射（Radiation）等?；瘜W(xué)類有害因子是最廣泛存在的，涉及日常所接觸的塑化劑（Plasticizer）、除草劑（Herbicide）、重金屬（Heavy Metal）等。生物類有害因子主要是食物霉變所產(chǎn)生的毒素（Toxin）或感染的細(xì)菌、病毒及寄生蟲分泌的有害物質(zhì)等。

表1 外源有害因子損傷卵母細(xì)胞成熟的潛在調(diào)控作用

2.2 外源有害因子影響卵母細(xì)胞成熟的潛在作用機(jī)制

2.2.1 物理類有害因子 卵母細(xì)胞在生長成熟過程中對溫度極為敏感，熱應(yīng)激會給卵母細(xì)胞成熟造成嚴(yán)重?fù)p傷。熱應(yīng)激可降低成熟卵母細(xì)胞母源物質(zhì)的儲備，同時(shí)破壞縫隙連接，下調(diào)熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）和線粒體DNA 編碼的相關(guān)基因表達(dá)，致使ATP含量降低，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平增加，凋亡信號通路激活，此外，熱應(yīng)激還會破壞紡錘體組裝，降低卵母細(xì)胞成熟。

包括手機(jī)輻射、紫外線、-射線在內(nèi)的各種輻射也會干擾卵母細(xì)胞成熟。手機(jī)輻射會造成超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽過氧化物酶（）和過氧化氫酶（）的活性和總體抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，TAC）下降，脂質(zhì)過氧化物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平升高，致使卵母細(xì)胞成熟降低。紫外線輻射也會使卵母細(xì)胞線粒體分布出現(xiàn)異常，拷貝數(shù)下降。此外，-射線會誘導(dǎo)線粒體膜電位丟失，抑制卵母細(xì)胞成熟。

2.22 化學(xué)類有害因子 化學(xué)類有害因子廣泛存在，如塑化劑、除草劑、除蟲劑、重金屬等均對卵母細(xì)胞成熟具有明顯毒性。

鄰苯二甲酸酯（Phthalic Acid Ester，PAE）是鄰苯二甲酸形成的酯的統(tǒng)稱，常被用作增塑劑。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-（2-ethylhexyl）-phthalate，DEHP）及其代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單乙基己基酯（Monoethylhexyl Phthalate，MEHP）已被證明會損傷卵母細(xì)胞成熟。DEHP 及MEHP 會破壞卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的定位，改變線粒體膜電位，紊亂氧化磷酸化基因表達(dá)，同時(shí)下調(diào)母源基因表達(dá)，損傷線粒體功能，降低ATP 含量，增加ROS 水平，破壞紡錘體組裝和染色體排列，造成DNA 損傷，觸發(fā)凋亡，以及改變表觀遺傳修飾（DNA 甲基化、H3K9me3 和H3K9ac），降低卵母細(xì)胞成熟。雙酚A（Bisphenol A，BPA）同樣作為增塑劑和內(nèi)分泌干擾物，可降低卵母細(xì)胞成熟。BPA 可破壞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體的分布及功能，延遲減數(shù)分裂進(jìn)程，提高ROS 水平，觸發(fā)自噬和凋亡，而且紊亂紡錘體組裝和染色體排列，改變表觀遺傳修飾（H3K4me2 和DNA 甲基化）水平，損傷卵母細(xì)胞成熟。

草甘膦（Glyphosate，GLY）是一種廣泛使用的有機(jī)磷類除草劑，嚴(yán)重危害動(dòng)物生殖健康。研究表明，GLY 會抑制卵母細(xì)胞GVBD 發(fā)生，下調(diào)和基因表達(dá)，破壞線粒體分布和膜電位，提高ROS水平，破壞紡錘體結(jié)構(gòu)，造成DNA 損傷和凋亡，降低卵母細(xì)胞成熟，另外，GLY 也會影響卵母細(xì)胞類固醇類物質(zhì)生成，破壞卵母細(xì)胞成熟。

鎘（Cd）和鉛（Pb）等重金屬也會給卵母細(xì)胞帶來損傷。鎘暴露會紊亂卵母細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白（）表達(dá)和成熟促進(jìn)因子（）活性，提高ROS 水平，引發(fā)DNA 損傷和凋亡，而且破壞紡錘體組裝和染色體排列，造成染色體非整倍體，同時(shí)下調(diào)DNA 甲基化、組蛋白H3K9me3 和H3K9ac 水平，損傷卵母細(xì)胞成熟。鉛也具有生殖毒性，鉛可破壞線粒體分布，降低和酶活性，上調(diào)ROS 和MDA 水平，同時(shí)下調(diào)谷胱甘肽（Glutathione，GSH）水平，并通過信號通路干擾卵母細(xì)胞成熟。

2.2.3 生物類有害因子 霉菌毒素（Mycotoxin）是霉菌在其污染的食物中產(chǎn)生的有毒代謝物，常見的有赭曲霉素A（Ochratoxin A，OTA）、HT-2 毒素、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）等，嚴(yán)重危害動(dòng)物生殖健康。其中，OTA 破壞線粒體功能，降低ATP 含量，提高ROS 水平，誘發(fā)凋亡，同時(shí)，紊亂紡錘體組裝和染色體排列，改變DNA 甲基化、DNA 羥甲基化、H3K9ac和H3K9me3 水平，破壞卵母細(xì)胞成熟。HT-2 提高卵母細(xì)胞ROS 水平，破壞紡錘體形態(tài)，誘導(dǎo)凋亡和自噬，同時(shí)，也會增加DNA 甲基化、H3K4me2 和H3K9me2水平，降低卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。

動(dòng)物感染的病毒也會破壞卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。例如，牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）干擾類固醇類性激素合成，致使卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量下降。戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）也會促進(jìn)卵母細(xì)胞凋亡。

3 外源有利因子對卵母細(xì)胞成熟的影響

3.1 外源有利因子與抗氧化 外源有利因子主要指可改善卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的培養(yǎng)基添加物（表2）。目前的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系是基于下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamic-Pituitary-Ovarian Axis，HPOA）激素調(diào)控基礎(chǔ)上，添加卵泡液（Follicular Fluid，F(xiàn)F）、表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、半胱氨酸（Cysteine，CYS）等抗氧化因子建立。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，外源有害因子主要是通過氧化應(yīng)激損害卵母細(xì)胞成熟。為此，從外源因子中開發(fā)抗氧化劑，降低氧化損傷，成為提高卵母細(xì)胞成熟研究的熱點(diǎn)之一。目前，褪黑激素（Melatonin，MT）、天然酚類化合物、維生素、微量金屬元素等具有抗氧化功能的物質(zhì)已被應(yīng)用到卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中，改善了卵母細(xì)胞成熟。

表2 外源抗氧化因子改善卵母細(xì)胞成熟的潛在調(diào)控作用

3.2 外源抗氧化因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟的潛在作用機(jī)制

3.2.1 褪黑激素調(diào)控卵母細(xì)胞成熟的作用機(jī)制 MT 是一種吲哚雜環(huán)類化合物，可調(diào)控HPOA 激素分泌，是目前最強(qiáng)的內(nèi)源性自由基清除劑，呈現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化功能。卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加MT 可以改善線粒體分布和膜電位，提高GSH 含量，降低ROS 水平和凋亡，增強(qiáng)自噬，同時(shí)改善DNA 甲基化、DNA 羥甲基化、H3K9 整體乙?；?、H3K9 甲基化、H3K27 乙酰化以及H4K16 乙?；缺碛^遺傳修飾，促進(jìn)紡錘體組裝和染色體排列，提高卵母細(xì)胞成熟，還可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。此外，MT 能夠緩解外源有害因子對卵母細(xì)胞造成的損傷。例如，MT 可以保護(hù)卵母細(xì)胞免受熱應(yīng)激導(dǎo)致的ROS 水平升高、GSH含量下降、凋亡以及紡錘體組裝紊亂，挽救DEHP及MEHP 導(dǎo)致的卵母細(xì)胞氧化損傷、凋亡、自噬以及紊亂的紡錘體組裝、DNA 甲基化和H3K4me2，還能降低BPA、GLY、OTA 等誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞ROS 水平、凋亡、自噬以及紡錘體組裝和染色體排列紊亂，以及下調(diào)鎘誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，改善卵母細(xì)胞成熟?？梢姡琈T 可以增強(qiáng)線粒體功能，減少氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力及凋亡，調(diào)控自噬，改善紡錘體組裝、染色質(zhì)排列以及表觀遺傳修飾，提高卵母細(xì)胞成熟。

3.2.2 天然酚類化合物調(diào)控卵母細(xì)胞成熟的作用 天然酚類化合物通常包括類黃酮化合物和非類黃酮化合物，均具有抗氧化活性。槲皮素（Quercetin，QUR）是一種具有多種生物活性的類黃銅酚類化合物，能夠有效清除自由基，可保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，QUR 能夠改善線粒體活性，降低ROS 水平，抑制凋亡，改善卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。在熱應(yīng)激條件下，QUR 能減少顆粒細(xì)胞凋亡，維持卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量?？梢?，QUR 能夠有效改善線粒體功能，抑制凋亡，提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種非類黃酮酚類化合物，同樣具有抗氧化功能。研究表明，RES 可改善S和基因表達(dá)，提高GSH 和ATP 含量，降低ROS 和凋亡水平，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。在熱應(yīng)激條件下，RES 也能夠增強(qiáng)表達(dá)，提高GSH 含量，降低ROS 水平，增強(qiáng)卵母細(xì)胞成熟。RES 還能保護(hù)卵母細(xì)胞免受殺菌劑代森錳鋅誘導(dǎo)的凋亡?？梢?，RES 可改善線粒體功能，降低氧化損傷和凋亡，提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。總之，天然酚類化合物具有抗氧化功能，改善卵母細(xì)胞成熟。

3.2.3 維生素對卵母細(xì)胞成熟的影響 維生素是一類必須從外界獲得維持機(jī)體正常生理功能所需的微量有機(jī)物質(zhì)，包括維生素A、維生素B、維生素C 等，也具有很好的抗氧化活性。維生素C 能夠降低ROS 水平，改善表觀遺傳修飾相關(guān)基因表達(dá)，擦除DNA 甲基化和H3K27me3 以及建立H3K4me3 和H3K36me3，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，還能減輕BPA 對卵巢的毒性。此外，維生素B可提高卵母細(xì)胞GSH 含量，降低ROS 水平，改善凋亡相關(guān)基因表達(dá)。可見，維生素能夠有效防控氧化損傷，減少凋亡，改善表觀遺傳修飾，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。

3.2.4 微量元素對卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控作用 微量元素（硒、鋅、銅等）在卵母細(xì)胞成熟中也發(fā)揮抗氧化作用。硒可提高卵母細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶活力，降低顆粒細(xì)胞DNA 損傷。鋅能提高卵母細(xì)胞GSH 含量，降低ROS 水平，改善凋亡相關(guān)基因表達(dá)，還可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，增強(qiáng)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。

當(dāng)然，還有眾多極有潛力的抗氧化物質(zhì)可改善卵母細(xì)胞成熟。目前，尋找新的清除自由基的抗氧化物質(zhì)，并開發(fā)健康有效的抗氧化成分是現(xiàn)代生殖健康研究領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展方向。同時(shí)，在卵母細(xì)胞體外成熟過程中，抗氧化物質(zhì)的抗氧化機(jī)理、是否具有協(xié)同作用以及能否有效拮抗有害因子也需進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)與展望

卵母細(xì)胞成熟是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)調(diào)控過程，外源因子可直接或間接作用于卵母細(xì)胞，影響卵母細(xì)胞成熟，但外源因子如何作用于卵母細(xì)胞，調(diào)控哪些關(guān)鍵基因表達(dá)以及外源抗氧化因子如何拮抗有害因子發(fā)揮改善卵母細(xì)胞成熟作用目前還沒有明確答案。

最近幾年，單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)的興起和應(yīng)用，可以更加精確地闡明外源因子在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測序能夠明確外源因子調(diào)控的卵母細(xì)胞成熟關(guān)鍵基因，表觀遺傳修飾組學(xué)測序可以從表觀遺傳修飾角度指出外源因子通過哪些修飾調(diào)控卵母細(xì)胞成熟關(guān)鍵基因表達(dá)，以及染色質(zhì)可接近性測序更能精確反映外源因子對卵母細(xì)胞染色質(zhì)開放性的調(diào)控，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟關(guān)鍵基因表達(dá)。當(dāng)然，卵母細(xì)胞成熟是一個(gè)精密的調(diào)控過程，其調(diào)控機(jī)理尚未完全闡明，外源因子在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用也未充分揭示。為此，外源因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟機(jī)理已成為生命科學(xué)生殖領(lǐng)域的一個(gè)研究重點(diǎn)。相信，隨著卵母細(xì)胞研究新技術(shù)的發(fā)展和外源因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟機(jī)理的闡明，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系將更加健全，卵母細(xì)胞成熟率和成熟質(zhì)量將得到更大提高，更能有效促進(jìn)胚胎工程技術(shù)在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用。