環(huán)狀RNA 在哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育中的功能研究進(jìn)展

張翔棟，汪薪，許騰騰，汝振遠(yuǎn)，張夢(mèng)雅，劉秋晨，閆業(yè)聯(lián)，張運(yùn)海，曹祖兵

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036）

在細(xì)胞總RNA 中只有2%～5% 的信使RNA（mRNA）具有編碼蛋白質(zhì)的功能，被稱為編碼RNA，其余的RNA 被稱為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。隨著近年來(lái)研究者們對(duì)于ncRNA 探索研究的深入，ncRNA 中的一個(gè)亞類——環(huán)狀RNA（circRNA）慢慢走進(jìn)了科學(xué)家們的視線中，并成為了目前研究前沿的熱點(diǎn)之一。circRNA 是一類以共價(jià)閉合的環(huán)狀形式存在的特殊非編碼RNA。1971 年，Diener 等在馬鈴薯紡錘塊莖病中發(fā)現(xiàn)一些具有單鏈閉合RNA 結(jié)構(gòu)的類病毒能夠造成植株死亡。1976 年，Sanger 等首次報(bào)道某些高等植物類病毒以共價(jià)閉合的環(huán)形分子形式存在。1979 年，Hsu 等使用電子顯微鏡觀察猴腎CV-1 細(xì)胞胞質(zhì)，第1 次在真核細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了circRNA。1991年，Nigro 等首次證實(shí)了人類細(xì)胞中存在內(nèi)源性的、由外顯子形成的circRNA，此后circRNA 開始逐漸被人們所重視。

近幾年，隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約100 000 個(gè)circRNAs。有研究者在胎盤和胚胎中鑒定了circRNA 的存在，并表明circRNA可能在繁殖領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。然而，研究?jī)?nèi)容主要集中在circRNA 的篩選和表達(dá)模式上，缺乏對(duì)circRNA功能的深入探索。為進(jìn)一步挖掘circRNA 的功能和調(diào)控機(jī)制，本文對(duì)circRNA 的特征、形成機(jī)制、可能存在的生物學(xué)功能以及在哺乳動(dòng)物生殖方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期揭示circRNAs 的潛在作用及其與哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育的關(guān)系。

1 circRNA 的特征

與傳統(tǒng)的線性RNA（Linear RNA）相比，circRNA 是通過(guò)反向剪接形成的閉合環(huán)狀RNA 分子，不存在5'和3'端（圖1）。大部分circRNAs 由外顯子環(huán)化形成，其主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；少數(shù)circRNAs則是由內(nèi)含子環(huán)化或者外顯子和內(nèi)含子共同環(huán)化形成，主要存在于細(xì)胞核中。由于circRNA 結(jié)構(gòu)的特殊性，其對(duì)RNA 核酸外切酶（RNase R）具有高度抗性，所以circRNA 比線性RNA 更加穩(wěn)定。circRNA 是古老的、高度保守的RNA 異構(gòu)體，幾乎在所有的生命體中都能夠鑒定到circRNA 的存在。此外，circRNA 還普遍存在于各類組織和細(xì)胞中，并且具有細(xì)胞、組織以及發(fā)育階段特異性的表達(dá)模式。隨著身體發(fā)育階段的改變或疾病的出現(xiàn)，circRNA 的豐度也會(huì)隨之發(fā)生變化，這表明它們?cè)谏砗筒±磉^(guò)程中可能具有重要的生物學(xué)功能。

圖1 前體mRNA 剪接形成線性RNA 和circRNA

2 circRNA 的分類及形成機(jī)制

circRNA 根據(jù)其序列來(lái)源主要可以分為3 類：僅含有外顯子的circRNA（Exonic Circular RNA，EciRNA）、僅含有內(nèi)含子的circRNA（Intronic Circular RNA，ciRNA）、外顯子和內(nèi)含子均含有的circRNA（Exonintron Circular RNA，EIciRNA）。circRNA 的形成主要是通過(guò)2 個(gè)存在于側(cè)翼內(nèi)含子中的假定剪接位點(diǎn)相結(jié)合，反向剪接所產(chǎn)生。有研究表明，在側(cè)翼內(nèi)含子中有超過(guò)30 nt 的互補(bǔ)重復(fù)序列就能夠?qū)Νh(huán)化產(chǎn)生促進(jìn)作用，很多circRNA 的形成與互補(bǔ)重復(fù)序列呈現(xiàn)正相關(guān)。目前，涉及到反向剪接的機(jī)制主要有套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化、內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化和RNA 結(jié)合蛋白配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化。

2.1 套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化 套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化主要分為外顯子跳讀（圖2-A）和內(nèi)含子套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化（圖2-B）2 種類型。當(dāng)前體mRNA 進(jìn)行可變剪接時(shí)，可能會(huì)發(fā)生跳過(guò)外顯子的剪接方式，影響mRNA 的形成。在外顯子跳讀過(guò)程中，先形成1 個(gè)包含外顯子的套索中間體，然后移除其中的內(nèi)含子，形成EciRNA；少數(shù)情況下內(nèi)含子會(huì)被保留，形成EIciRNA。內(nèi)含子套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化是目前普遍認(rèn)可的ciRNA 形成機(jī)制。套索內(nèi)含子的形成依賴于一個(gè)共有基序，該基序包含位于5' 端剪接位點(diǎn)附近的7 nt 富GU 基序和位于分支點(diǎn)附近的11 nt 富C 基序，共有基序能夠幫助套索內(nèi)含子逃避脫支酶誘導(dǎo)的脫支作用，使得內(nèi)含子3' 端到分支位點(diǎn)的多余序列被核酸外切酶降解，從而形成ciRNA。

2.2 內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化 在進(jìn)行內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化過(guò)程時(shí)，首先由環(huán)化外顯子的側(cè)翼內(nèi)含子序列互補(bǔ)配對(duì)，形成穩(wěn)定的堿基對(duì)，使剪接位點(diǎn)相互接近觸發(fā)反向剪接事件。由于這種機(jī)制是下游外顯子的5'端剪接位點(diǎn)直接與上游外顯子的3'端剪接位點(diǎn)結(jié)合，所以又被稱為直接反向剪接。目前認(rèn)為內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化（圖2-C）是EciRNA 形成的主要機(jī)制，其需要順式作用元件或反式作用因子才能使外顯子剪接位點(diǎn)結(jié)合在一起，如反向ALU 重復(fù)元件（IARE）可以促進(jìn)外顯子環(huán)化。

圖2 circRNA 的生成過(guò)程

2.3 RNA 結(jié)合蛋白配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化 有研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白（RNA Binding Protein，RBP）能夠驅(qū)動(dòng)環(huán)化產(chǎn)生circRNA，尤其對(duì)特異性circRNA 的產(chǎn)生具有重要作用。因?yàn)镽BP 只能與含有特異性RBP 結(jié)合位點(diǎn)的側(cè)翼內(nèi)含子相結(jié)合，從而促進(jìn)環(huán)化，所以只有在特異的結(jié)合位點(diǎn)存在的情況下，它們才可能發(fā)揮調(diào)控circRNA 形成的功能。此外，有研究發(fā)現(xiàn)盲肌蛋白MBL 可以促進(jìn)circRNA 的形成；RNA 編輯酶ADAR1 能夠抑制circRNA 的形成；RNA 結(jié)合蛋白Quaking（QKI）能夠促進(jìn)外顯子環(huán)化。因此，RBP既可以通過(guò)橋接互補(bǔ)序列來(lái)促進(jìn)環(huán)化，也可以通過(guò)抑制典型剪接來(lái)抑制環(huán)化。

3 circRNA 的分子調(diào)控機(jī)制

3.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 circRNA 能夠通過(guò)與特定的RNA 互作參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄從而影響基因表達(dá)。ciRNA 和EIciRNA 主要定位于細(xì)胞核，它們能夠與RNA 聚合酶II 相互作用共同調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄（圖3-A）。Zhang 等首次在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了ciRNA，并證實(shí)ciANKRD52、ciMCM5 和ciSIRT7 能夠在細(xì)胞核中與RNA 聚合酶II 結(jié)合，從而促進(jìn)自身編碼基因的轉(zhuǎn)錄。EIciRNA 能夠在親本基因的啟動(dòng)子區(qū)域與U1snRNP 形成復(fù)合物，后與RNA 聚合酶II 相互作用，從而增強(qiáng)其親本基因的轉(zhuǎn)錄效率。EciRNA 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，有研究證明，EciRNA 的產(chǎn)生與外顯子跳讀呈正相關(guān)，而外顯子跳讀是前體mRNA 中最常見的選擇性剪接方式，因此EciRNA 的產(chǎn)生可能會(huì)與線性mRNA 相互競(jìng)爭(zhēng)（圖3-B），當(dāng)大多數(shù)外顯子環(huán)化時(shí)，線性mRNA的表達(dá)量通常會(huì)下降，從而影響親本基因的表達(dá)。

3.2 海綿功能 microRNA（miRNA）是一類由發(fā)夾前體衍生的含有20～24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它能夠與3'端非翻譯區(qū)（Untranslated Region，UTR）的部分堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而調(diào)控哺乳動(dòng)物中含有miRNA 反應(yīng)元件（MicroRNA Response Elements，MRE）的靶向mRNA 的轉(zhuǎn)錄后抑制。網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物中含有數(shù)千個(gè)circRNAs 攜帶預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，提示了其作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）的潛在作用（圖3-C）。Memczak 等證明了circRNA CDR1as（ciRS-7）具有強(qiáng)大的miRNA 海綿作用，其能夠靶向結(jié)合miR-7，從而提高miR-7 靶基因的表達(dá)水平。因此，circRNA 可以作為miRNA 海綿參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

circRNA 還可以作為RNA 結(jié)合蛋白（RNA Binding Proteins，RBP）的海綿（圖3-D），通過(guò)與不同的RBP 結(jié)合形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而影響相關(guān)蛋白的表達(dá)。Ashwal 等研究發(fā)現(xiàn)由蒼蠅和人類的盲?。∕uscleblind，MBL）衍生而來(lái)的circMBL 含有多個(gè)盲肌蛋白結(jié)合位點(diǎn)，其能夠直接與盲肌蛋白結(jié)合，并且盲肌蛋白可以反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)circMBL 的形成。

綜上所述，circRNA 能夠通過(guò)吸附miRNA 從而發(fā)揮功能，但是考慮到circRNA 存在的miRNA 靶點(diǎn)數(shù)量問題，也有人認(rèn)為大多數(shù)報(bào)道的circRNA 很可能不是標(biāo)準(zhǔn)的miRNA 海綿，而是在一個(gè)更大的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。

3.3 翻譯功能 5'端的7-甲基鳥苷“帽子”（m7G）和3'端的ploy（A）尾結(jié)構(gòu)對(duì)于線性mRNA 翻譯至關(guān)重要，而circRNA 作為一種非編碼RNA 并不具備這種結(jié)構(gòu)，所以一直以來(lái)circRNA 被認(rèn)為不具有翻譯功能。后來(lái)有研究證實(shí)circRNA 也可以產(chǎn)生功能蛋白（圖3-E），這打破了人們以往的認(rèn)知。目前circRNA 的翻譯機(jī)制主要分為2 種，即內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal Ribosome Entry Site，IRES）介導(dǎo)的翻譯模式（圖3-F）、m6A修飾的翻譯模式（圖3-G）。翻譯起始元件和開放閱讀框 架（Open Reading Frame，ORF）是circRNA翻譯蛋白質(zhì)的2 個(gè)基本元件，由研究者設(shè)計(jì)的具有IRES 的circRNA 能夠在體外翻譯成蛋白質(zhì)。后來(lái)發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)源性的circRNA 也具有IRES，并且可以進(jìn)行翻譯。例如，能夠調(diào)控肌肉生成的circZNF609 可以翻譯成多肽。2017 年Yang 等首次發(fā)現(xiàn)RNA 最豐富的堿基修飾——N6-甲基腺苷（m6A）也可以促進(jìn)人類細(xì)胞中circRNA 的翻譯啟動(dòng)，并且能夠影響翻譯效率。在人類轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的很多由m6A 修飾的circRNA 具有編碼蛋白質(zhì)的潛力。m6A 修飾和依賴IRES 的模式都是circRNA 翻譯的潛在機(jī)制，Legnini 等研究發(fā)現(xiàn)在IRES 介導(dǎo)進(jìn)而促進(jìn)翻譯的circZNF609 中能夠檢測(cè)到較高的m6A 甲基化水平，提示2 條途徑之間可能存在一些關(guān)聯(lián)。

圖3 circRNA 的分子調(diào)控機(jī)制

4 circRNA 在哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育中的功能

4.1 circRNA 調(diào)控下丘腦-垂體-性腺生殖軸激素的合成 下丘腦和垂體通過(guò)調(diào)節(jié)生殖激素的合成與分泌從而在生殖方面發(fā)揮重要作用。在下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸中，下丘腦產(chǎn)生的GnRH 到達(dá)并作用于垂體，促進(jìn)垂體釋放FSH 和LH 作用于卵巢，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育和排卵。Zhang 等對(duì)熱應(yīng)激母豬和正常母豬的腦垂體進(jìn)行測(cè)序，在垂體中共鑒定出12 035 個(gè)circRNA，與正常母豬垂體相比，熱應(yīng)激母豬垂體中有59 個(gè)circRNA 的表達(dá)存在顯著差異，其中42 個(gè)表達(dá)上調(diào)，17 個(gè)表達(dá)下調(diào)。通過(guò)預(yù)測(cè)circRNA-miRNAmRNA 調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)一些circRNA 可能結(jié)合miRNA 共同調(diào)節(jié)垂體特異性基因和熱休克蛋白家族成員，這表明circRNA 可能在垂體激素分泌和熱應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。Chen 等對(duì)青春期及前后3 個(gè)階段的長(zhǎng)白和約克雜交母豬的垂體進(jìn)行circRNA 測(cè)序，共鑒定出5 148個(gè)circRNA，其中有158 個(gè)circRNA 為首次發(fā)現(xiàn)，假設(shè)其為垂體特異性circRNA，對(duì)這些circRNA 的宿主基因進(jìn)行KEGG 分析，結(jié)果顯示這些宿主基因主要富集于催乳素信號(hào)通路、多巴胺能突觸信號(hào)通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路中。Li 等對(duì)發(fā)情期和乏情期綿羊的垂體前葉進(jìn)行circRNA 測(cè)序，共鑒定出12 468 個(gè)circRNA，其中有9 231 個(gè)差異表達(dá)的circRNA，通過(guò)對(duì)這些差異表達(dá)的circRNA 進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其主要與雌激素信號(hào)通路、促性腺激素釋放激素信號(hào)通路相關(guān)，提示circRNA 在綿羊發(fā)情中參與垂體調(diào)節(jié)的潛在作用。Zhang 等在綿羊下丘腦中鑒定出41 863 個(gè)circRNA，在多胎和單胎綿羊的卵泡期有333 個(gè)circRNA 差異表達(dá)（162 個(gè)上調(diào)，171 個(gè)下調(diào)），黃體期有340 個(gè)circRNA 差異表達(dá)（163 個(gè)上調(diào)，177個(gè)下調(diào)），對(duì)這些差異表達(dá)的circRNA 進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)circRNA 參與調(diào)控GnRH 的活性或關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控綿羊生殖。La 等對(duì)多胎和單胎綿羊的子宮進(jìn)行circRNA 測(cè)序，在卵泡期和黃體期分別鑒定出147 個(gè)和364 個(gè)circRNA 呈現(xiàn)差異性表達(dá)，通過(guò)GO 和KEGG 分析發(fā)現(xiàn)這些circRNA 主要富集于促性腺激素釋放激素信號(hào)通路，這與Zhang 等的研究結(jié)果存在一定的相關(guān)性。

4.2 circRNA 在精子發(fā)生中的作用 Chioccarelli 等通過(guò)circRNA 測(cè)序在人類精子細(xì)胞中鑒定出10 726 個(gè)circRNA，其中84.6%來(lái)源于外顯子區(qū)域；通過(guò)對(duì)比高活力和低活力精子circRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析出148個(gè)具有顯著差異表達(dá)的circRNA，對(duì)這些circRNA 的宿主基因進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果顯示其主要與DNA 復(fù)制、RNA 運(yùn)輸和降解、細(xì)胞周期以及類固醇生物合成等信號(hào)通路高度相關(guān)，提示這些circRNA 可能在胚胎發(fā)育的起始階段發(fā)揮作用。此外，Gòdia 等在豬精子中鑒定出1 598 個(gè)circRNA，其中82.1%來(lái)源于外顯子區(qū)域，通過(guò)與已發(fā)現(xiàn)的人、鼠、豬circRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在豬精子中具有高度特異表達(dá)的circRNA，對(duì)這些circRNA 的宿主基因進(jìn)行GO 分析，結(jié)果顯示宿主基因主要參與表觀遺傳修飾、精子發(fā)生以及纖毛組裝等過(guò)程，并提示一些circRNA 如ssc_circ_1458 和 ssc_circ_1321 與精子運(yùn)動(dòng)特性存在著顯著相關(guān)性。Dong 等研究顯示，circRNA 在各類精細(xì)胞中大量表達(dá)，如在圓形精母細(xì)胞中有7 220 個(gè)，細(xì)線期精母細(xì)胞中有6 689 個(gè)，在粗線期精母細(xì)胞中有4 467個(gè)，提示circRNA 在精子分化中具有差異化的潛在調(diào)控作用。Tang 等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在粗線期精母細(xì)胞發(fā)育成精子的過(guò)程中，circRNA 的數(shù)量和豐度都顯著升高，而對(duì)應(yīng)的線性RNA 的水平顯著降低，提示精子中circRNA 水平的上升可能是一些重要轉(zhuǎn)錄本提高自身穩(wěn)定性的機(jī)制，以確保精子形成晚期一些關(guān)鍵蛋白的持續(xù)產(chǎn)生，GO 分析結(jié)果顯示這些宿主基因可能參與了精子發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵事件，主要在表觀遺傳調(diào)控（DNA 甲基化、組蛋白修飾和核小體組織）和精子運(yùn)動(dòng)（纖毛運(yùn)動(dòng)、軸絲組裝和微管束形成）等方面發(fā)揮作用。睪丸組織作為雄性生殖系統(tǒng)的重要組成部分，不僅為精子生成提供重要的場(chǎng)所，還為保障精子的正常發(fā)育起到至關(guān)重要的作用。Zhang 等在仔豬睪丸和性成熟豬睪丸中發(fā)現(xiàn)了大量的差異表達(dá)circRNA，GO 分析表明其可能參與精子發(fā)生和激素合成，為評(píng)估豬睪丸發(fā)育情況提供潛在的生物標(biāo)記物。綜上所述，睪丸和精子來(lái)源的circRNA 主要來(lái)源于基因的外顯子區(qū)域，根據(jù)宿主基因的位置，它們廣泛分布在包括線粒體基因組在內(nèi)的所有染色體上。GO 分析表明，這些circRNA 主要參與生殖細(xì)胞進(jìn)程、減數(shù)分裂事件、表觀遺傳修飾、精子活力和受精等過(guò)程，從而在雄性生殖方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

4.3 circRNA 在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟中的作用 Hu等對(duì)麻城黑山羊和波爾山羊的排卵前卵泡進(jìn)行了circRNA 測(cè)序，在山羊排卵前卵泡中共鑒定出13 950個(gè)circRNA，其中有13 527 個(gè)circRNA 來(lái)源于827 個(gè)宿主基因；對(duì)這些宿主基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)宿主基因參與細(xì)胞發(fā)育過(guò)程，如轉(zhuǎn)移酶活性、新陳代謝等；還有一些宿主基因與重要的信號(hào)通路如促性腺激素釋放激素（GnRH）信號(hào)通路、促性腺激素調(diào)節(jié)的卵母細(xì)胞成熟等也存在相關(guān)性，研究人員還分析出37 個(gè)差異表達(dá)的circRNA，并證實(shí)chi_circ_0008219 能夠結(jié)合卵泡發(fā)育相關(guān)的miRNA。這些結(jié)果表明circRNA 在山羊卵泡發(fā)育中具有的潛在作用。Xie 等對(duì)梅山豬和杜洛克豬中等大小的M2 期卵泡進(jìn)行circRNA 測(cè)序，鑒定出15 866 個(gè)circRNA，其中有244 個(gè)circRNA 的表達(dá)存在差異，對(duì)這些差異表達(dá)circRNA 的宿主基因進(jìn)行GO 和KEGG 分析，結(jié)果顯示它們可能參與卵泡發(fā)育信號(hào)通路。Fu 等利用BMP15、GDF9 和BMP15+GDF9 對(duì)牛卵丘細(xì)胞進(jìn)行體外處理，并對(duì)各組卵丘細(xì)胞進(jìn)行circRNA 測(cè)序，預(yù)測(cè)出1 706 個(gè)circRNA，分析各處理組與對(duì)照組之間circRNA 的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BMP15 和GDF9 可能通過(guò)circRNA 海綿吸附miRNA 來(lái)調(diào)控靶基因，從而調(diào)節(jié)牛卵丘細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生，影響卵泡發(fā)育。CircRNAs在卵母細(xì)胞成熟中的作用尚未得到廣泛研究。2019 年Shen 等報(bào)道circRNA 能夠作為miRNA 海綿調(diào)節(jié)多種生殖途徑，如卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，GnRH 信號(hào)和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟。同年，Cao 等以豬為模型，在豬卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中分別鑒定出7 067 個(gè)和637個(gè)circRNAs，發(fā)現(xiàn)敲低circARMC4 會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂期間染色體排列和第一極體運(yùn)動(dòng)異常，進(jìn)一步影響了豬早期胚胎發(fā)育。Cheng 等分析發(fā)現(xiàn)，與30 歲體外受精患者相比，38 歲體外受精患者顆粒細(xì)胞中有46個(gè)circRNA 表達(dá)上調(diào)，11 個(gè)circRNA 表達(dá)下調(diào)，其中circ_103827 和circ_104816 的表達(dá)與優(yōu)質(zhì)胚數(shù)呈負(fù)相關(guān)；GO 分析顯示這2 個(gè)circRNA 可能在葡萄糖代謝和有絲分裂細(xì)胞周期中發(fā)揮作用，提示circ_103827 和circ_104816 可能作為卵泡微環(huán)境受損的潛在指標(biāo)，用于預(yù)測(cè)輔助生殖結(jié)果。上述研究也提示了一些特異性的circRNA 或許能夠作為疾病診斷的標(biāo)志物，為相關(guān)生殖疾病的診斷和治療提供依據(jù)。

4.4 circRNA 與胚胎著床前發(fā)育緊密關(guān)聯(lián) 早期胚胎發(fā)育是生殖領(lǐng)域中的重要環(huán)節(jié)。哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育起始于受精卵，受精卵在輸卵管向子宮移行過(guò)程中伴隨著胚胎細(xì)胞分裂增殖、桑椹胚致密化和囊胚形成等形態(tài)學(xué)變化，在分子水平上也發(fā)生著一系列精細(xì)的改變，如卵母細(xì)胞庫(kù)RNA 降解和胚胎基因組轉(zhuǎn)錄激活等事件。circRNA廣泛存在于組織和細(xì)胞中，其豐度通常隨著發(fā)育階段而發(fā)生變化，探索circRNA 在各類生殖細(xì)胞中的表達(dá)模式對(duì)于后續(xù)揭示circRNA 在生殖領(lǐng)域的功能尤為重要。

Dang 等利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)人類植入前胚胎進(jìn)行circRNA 測(cè)序，結(jié)果顯示鑒定的10 032 個(gè)circRNA 來(lái)源于2 974 個(gè)宿主基因，這些circRNA 的表達(dá)呈現(xiàn)發(fā)育階段特異性特征。通過(guò)對(duì)2 974 個(gè)宿主基因進(jìn)行GO 分析，發(fā)現(xiàn)這些circRNA 可能參與細(xì)胞器組織、染色體組織和染色質(zhì)修飾過(guò)程。Fan 等對(duì)小鼠早期胚胎進(jìn)行circRNA 測(cè)序，共預(yù)測(cè)了2 891 個(gè)circRNA，來(lái)源于1 316 個(gè)宿主基因，大多數(shù)circRNA 的長(zhǎng)度在0～2 kb，對(duì)1 316 個(gè)宿主基因進(jìn)行GO 分析，結(jié)果顯示這些circRNA 可能參與染色體組織和染色質(zhì)修飾過(guò)程。Dang 等將人和小鼠早期胚胎的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)小鼠植入前胚胎中鑒定出的circRNA 和宿主基因的數(shù)量遠(yuǎn)低于在人類植入前胚胎，主要原因可能是物種之間的差異性以及進(jìn)化程度的不同，在人和小鼠早期胚胎中鑒定到的circRNA 宿主基因中，相同的宿主基因有835 個(gè)，表明circRNA 的形成在人和鼠之間是保守的。這些相同的宿主基因參與了早期胚胎形成中的一些關(guān)鍵事件，提示了它們可能在早期胚胎形成過(guò)程中具有不可替代的重要功能。目前已有研究發(fā)現(xiàn)一些circRNA 在滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲方面發(fā)揮著重要的功能，對(duì)胚胎的正常著床也有重要影響。鑒于circRNA 的保守性，可以假設(shè)其他物種的早期胚胎中也含有這些保守的宿主基因，進(jìn)而通過(guò)多物種對(duì)比的方式篩選出最保守的宿主基因，為研究早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能的circRNA 提供方向。

4.5 circRNA 調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性狀態(tài) 胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cell，ESCs）是從早期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始性腺中分離出來(lái)的一類細(xì)胞，其具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性，探索調(diào)控ESCs 多能性的維持和自我更新的機(jī)制對(duì)了解哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育和細(xì)胞組織分化過(guò)程十分重要。近年來(lái)，隨著誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSC）技術(shù)的逐漸成熟，其主要在疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)以及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但有關(guān)circRNA 在胚胎干細(xì)胞中的功能性研究仍有待探索。

Yu 等在人類胚胎干細(xì)胞中證明了circBIRC6和circCORO1C 在功能上與多能性狀態(tài)相關(guān)，其中circBIRC6 能夠通過(guò)吸附miR-34a 和miR-145，影響靶基因mRNA 的表達(dá)，從而維持多能性狀態(tài)。Barilani 等通過(guò)高通量測(cè)序分析構(gòu)建出人胎兒來(lái)源型誘導(dǎo)多能干細(xì)胞circRNA 表達(dá)譜，提示circRNA 可能參與調(diào)控多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，從而在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能。Cherubini 等首次描述了circRNA 在控制人類間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）特征和分化中的作用，通過(guò)對(duì)來(lái)源于人骨髓與臍帶血的原代間充質(zhì)干細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行circRNA 測(cè)序，證明了circFOXP1 是未分化MSC 的標(biāo)志物，其與miR-17-3p/miR-127-5p 相互作用，從而影響干性和分化相關(guān)信號(hào)通路以維持MSC 的增殖和自我更新。在ESCs 中，Oct4、Sox2 和Nanog是組成多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心轉(zhuǎn)錄因子。Li 等通過(guò)對(duì)雄性和雌性小鼠生殖干細(xì)胞進(jìn)行circRNA 測(cè)序，構(gòu)建了circRNA 差異表達(dá)譜，揭示了circRNA 可能與生殖干細(xì)胞的性別特異性分化有關(guān)。Zhang 等在人源胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了上千條circRNA，并揭示了內(nèi)含子互補(bǔ)序列配對(duì)所介導(dǎo)的circRNA 形成機(jī)制。綜上所述，circRNA 在干細(xì)胞多能性維持和促進(jìn)體細(xì)胞重編程效率方面均有明顯的作用。

5 展 望

circRNA 作為一種新型的非編碼RNA，其擁有廣泛性、穩(wěn)定性和特異性等生物學(xué)特性且具有調(diào)控基因表達(dá)的重要功能。近年來(lái)，隨著生物信息技術(shù)和高通量測(cè)序方法的逐漸發(fā)展，哺乳動(dòng)物生殖領(lǐng)域中有越來(lái)越多的circRNA 被鑒定出來(lái)。circRNA 的發(fā)現(xiàn)為篩選診斷和治療生殖疾病的標(biāo)志物提供了方向，為深入剖析生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制增加了一層新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為研究哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育開拓了新視角。高通量測(cè)序研究結(jié)果豐富了circRNAs 在配子、胚胎和干細(xì)胞等組織中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探索其在配子發(fā)生、胚胎發(fā)育和干細(xì)胞多能性調(diào)節(jié)等方面的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，尚不清楚新出現(xiàn)的circRNA 與RNA、蛋白質(zhì)之間存在的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是否會(huì)打破過(guò)去所認(rèn)知的調(diào)控機(jī)制。目前對(duì)circRNA 在哺乳動(dòng)物生殖領(lǐng)域中的研究仍處于起步階段，其在生殖領(lǐng)域中發(fā)揮的重要生物學(xué)功能仍需深入探索。相信隨著研究者們對(duì)circRNA 的努力挖掘，有關(guān)circRNA 在生殖領(lǐng)域的研究會(huì)取得更大進(jìn)展。