五價(jià)砷脅迫處理對(duì)普通小球藻的急性毒性效應(yīng)

李立杰 彭 夢(mèng) 楊 帆 余佳妮 金 巍 譚鳳霞 柴 毅

(1. 長(zhǎng)江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心,荊州 434025;2. 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,荊州 434025)

砷(Arsenic,As)是全球水環(huán)境中毒性最強(qiáng)的重金屬污染物之一,主要以As3+和As5+兩種無(wú)機(jī)形式存在于水體中,其中As3+主要存在于地下水等還原性環(huán)境中,而As5+在河流和湖泊等氧化性環(huán)境中占主導(dǎo)地位[1]。毒性試驗(yàn)研究表明,As5+毒性比As3+毒性較弱,但As5+進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)歷一系列的還原和甲基化過(guò)程,導(dǎo)致產(chǎn)生其他毒性更強(qiáng)的產(chǎn)物,如As3+、有機(jī)單甲基(MMA)和二甲基(DMA)代謝物等,從而放大毒性,并且As5+在水環(huán)境中穩(wěn)定性和含量均高于As3+[2],具有低劑量高毒性、難降解和生物富集放大等特征,其主要來(lái)源于地表徑流和工業(yè)“三廢”排放等途徑[3]。近年來(lái),我國(guó)水環(huán)境的As污染呈現(xiàn)出集中、多發(fā)的趨勢(shì),云南省陽(yáng)宗海As濃度高達(dá)179.6 μg/L[4];長(zhǎng)江中游江北平原和鄱陽(yáng)湖平原淺層地下水As含量為0.65—956.72和0.09—267.45 μg/L[5];河南省大沙河As濃度為0.002—0.530 mg/L[6]。As的檢測(cè)濃度均高于我國(guó)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)0.05 mg/L,然而,這些As的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估僅依賴于總砷,這可能不適合于不同形式的As潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[1]。研究表明As5+會(huì)顯著影響浮游植物的群落演替,從而通過(guò)食物鏈間接影響水生生物[7],并且水體過(guò)量As5+會(huì)直接導(dǎo)致水生生物產(chǎn)生毒性效應(yīng),如改變運(yùn)動(dòng)行為、導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、影響生理生化和改變遺傳基因表達(dá)等[8—11],給水生生物帶來(lái)生態(tài)壓力,同時(shí)As5+污染會(huì)在水生生物體內(nèi)富集,并通過(guò)食物鏈傳遞[12],最終危害人類健康。因此,從生態(tài)毒理學(xué)的角度來(lái)看,開(kāi)展基于不同價(jià)態(tài)的As濃度監(jiān)測(cè)和水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是非常迫切和必要的。

浮游植物(主要是微藻)是水域生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者,也是環(huán)境污染物在食物鏈中富集的起點(diǎn),其多樣性和生物量直接影響著水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[13]。且大多數(shù)微藻結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、世代時(shí)間短和對(duì)環(huán)境敏感等特點(diǎn)。近年來(lái),藻類作為水環(huán)境指示生物已被廣泛應(yīng)用于水安全評(píng)價(jià)和環(huán)境污染物檢測(cè)中[14]。普通小球藻(Chlorella vulgaris)屬綠藻門(Chorophyta),小球藻科(Chlorellaceae),小球藻屬(Chlorella),分布廣泛,可大量繁殖形成水華,也是富營(yíng)養(yǎng)化水體的指示生物,是研究生態(tài)毒理學(xué)的經(jīng)典生物學(xué)模型[15]。本研究以普通小球藻(Chlorella vulgaris)作為受試生物,探究As5+脅迫下普通小球藻的藻密度、Chl.a、抗氧化酶活性、活性氧自由基等指標(biāo)的變化規(guī)律,揭示典型指示種普通小球藻在As5+環(huán)境脅迫中的生理生化反應(yīng),進(jìn)一步探究重金屬As污染對(duì)水生生物的致毒作用及機(jī)理提供理論參考,為水環(huán)境中重金屬污染的修復(fù)及制定相關(guān)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)水域生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展與利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藻種: 普通小球藻(Chlorella vulgaris,FACHB-2338)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB-Collection)。

As5+標(biāo)準(zhǔn)品(1000 mg/L)購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 藻種擴(kuò)培

普通小球藻在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng),并在光照培養(yǎng)箱(GZX-250BSH-Ⅲ,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),培養(yǎng)條件: 溫度為(25±1)℃,光暗比為12h ∶12h,光強(qiáng)為5000—8000 lx,每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶3—4次,每隔1—2周轉(zhuǎn)接,使藻類生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程,均經(jīng)過(guò)滅菌處理。

1.3 五價(jià)砷對(duì)普通小球藻毒性效應(yīng)

設(shè)置濃度梯度為0(對(duì)照組)、0.1、0.5、1、1.5和2 mg/L。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的普通小球藻藻液,離心3000×g下離心15min,蒸餾水重懸,再離心,重復(fù)3次,去除細(xì)胞表面吸附培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)鹽,培養(yǎng)藻液體積為100 mL,初始藻密度為1×106cells/mL(初始A680=0.122),每組設(shè)3個(gè)重復(fù),每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶3—4次,試驗(yàn)周期為96h。

1.4 藻細(xì)胞密度測(cè)定

通過(guò)血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù),并在波長(zhǎng)680 nm下測(cè)定藻液光密度,建立不同藻細(xì)胞濃度和光密度之間的線性關(guān)系(y=84.8931x-0.3361,R2=1),實(shí)驗(yàn)中以測(cè)定的光密度根據(jù)線性方程計(jì)算出的藻細(xì)胞密度表示生物量,每24h在OD680檢測(cè)各處理組和對(duì)照組藻培養(yǎng)液的吸光度。通過(guò)藻密度繪制生長(zhǎng)曲線并計(jì)算抑制率I(%)。

式中,ACK指對(duì)照組的藻密度,AX指實(shí)驗(yàn)組的藻密度。

采用Graphpad Prism 8.0軟件,使用非線性回歸模型擬合濃度-響應(yīng)曲線,計(jì)算IC50值和相關(guān)參數(shù)[16]。

1.5 葉綠素a(Chl.a)質(zhì)量濃度測(cè)定

各濃度組取5 mL藻液,3000×g下離心15min,并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS;0.01 mol/L,pH=7.3)清洗3次,去除上清液,加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇在75℃水浴鍋中水浴3min。再次離心后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在665和649 nm處吸光度,并依據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算[17]

1.6 生理生化指標(biāo)測(cè)定

暴露96h時(shí)取50 mL藻液離心3000×g下離心15min,PBS緩沖溶液重懸離心,重復(fù)3次,藻泥加入1 mL PBS和0.3 g氧化鋯珠(R=0.05 mm),低溫條件下在高效組織細(xì)胞破碎儀(Tissue Cell-distroyer D1000,湖北新縱科病毒疾病工程技術(shù)有限公司)破碎,5000×g下工作30s,間隙10s,重復(fù)3次,低溫離心上清液為粗酶液?？偪寡趸芰?T-AOC,A015-3-1)、總超氧化物歧化酶(T-SOD,A001-3)活性、三磷酸腺苷酶(ATP,A070-1)活性、丙二醛(MDA,A003-1)含量及總蛋白含量(TP,A045-2)用南京建成生物工程研究所相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.7 活性氧自由基(ROS)和藻細(xì)胞膜通透性測(cè)定

活性氧自由基(ROS)測(cè)定采用DCFH-DA(2,7-Dichlorofuorescin Diacetate)探針?lè)?南京建成生物工程研究所相應(yīng)的試劑盒(E004-1-1)進(jìn)行測(cè)定。

用二乙酸熒光素(Fluorescein Diacetate,FDA)法測(cè)定細(xì)胞通透性[14]。將5 mL的藻細(xì)胞懸液離心(12000×g,2min),用PBS洗滌3次,然后加入最終濃度為10 μg/mL的FDA。將懸液在室溫黑暗條件下孵育30min,離心(12000×g,2min),用PBS洗滌3次。熒光樣品用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(SpectraMax iD3)檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。結(jié)果顯示為熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞數(shù)的比值作為單個(gè)藻細(xì)胞通透性水平(對(duì)照組為1)。

1.8 透射電鏡(TEM)超微結(jié)構(gòu)分析

96h時(shí),As5+脅迫2 mg/L處理組和對(duì)照組,藻液10 mL在3000×g下離心10min,藻泥棄去培養(yǎng)液加入電鏡固定液(武漢百仟度生物科技有限公司,B0012)4℃固定2—4h,依次入50%—70%—80%—90%—95%—100%—100%乙醇脫水,每次15min,最后滲透、包埋、切片和染色,使用透射電子顯微鏡(TEM,日立,HT7800)下進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD,n=3)表示,使用Graphpad Prism 8.0繪圖和非線性曲線-最小二乘法回歸分析,SPSS 20.0采用單因素(One-way Anova)和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義: *P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度As5+對(duì)普通小球藻藻密度的影響

由圖1可知,在試驗(yàn)所設(shè)濃度梯度下,普通小球藻藻密度隨As5+濃度及暴露時(shí)間的增加,均顯著降低,普通小球藻在96h生長(zhǎng)抑制最為嚴(yán)重,0.1、0.5、1、1.5和2 mg/L處理組抑制率分別達(dá)到了4.1%、6.9%、15.0%、32.0%和52.9%。通過(guò)非線性曲線-最小二乘法對(duì)As5+暴露濃度和各時(shí)間段普通小球藻生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行擬合,得到擬合效應(yīng)曲線(圖1),A5+對(duì)普通小球藻96h-IC50為1.94 mg/L。

圖1 As5+對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響及各時(shí)間段抑制率曲線擬合Fig. 1 Effect of As5+ on the growth of C. vulgaris and curve fitting of inhibition rate in different time periods

2.2 不同濃度As5+對(duì)普通小球藻Chl.a的影響

由圖2可知,As5+對(duì)普通小球藻Chl.a含量的影響與其對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律,96h時(shí),隨暴露濃度的增加,Chl.a受到的抑制作用越強(qiáng),表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。0.1 mg/L處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異;0.5、1、1.5和2 mg/L處理組均表現(xiàn)出顯著抑制,Chl.a含量分別下降了17.7%、26.6%、42.3%和68.6%。

圖2 As5+對(duì)普通小球藻葉綠素a的影響Fig. 2 Effect of As5+ on chlorophyll a content of C. vulgaris

2.3 不同濃度As5+對(duì)普通小球藻細(xì)胞膜通透性的影響

由圖3可知,在不同濃度As5+處理96h后,單個(gè)藻細(xì)胞通透性水平隨As5+濃度的增加呈顯著升高趨勢(shì)。0.1、0.5和1 mg/L處理組與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異;1.5和2 mg/L處理組通透性顯著增加,分別為對(duì)照組的1.7倍和2.2倍。

圖3 As5+對(duì)普通小球藻細(xì)胞通透性水平的影響Fig. 3 Effect of As5+ on the permeability of C. vulgaris cells

2.4 不同濃度As5+對(duì)普通小球藻ROS和MDA含量的影響

由圖4可知,在不同濃度As5+處理96h后,ROS和MDA含量均隨暴露濃度的增加而遞增。2 mg/L處理組ROS含量與對(duì)照組相比顯著增加,為對(duì)照組的4.0倍。1、1.5和2 mg/L處理組MDA含量分別為對(duì)照組的1.6倍、2.0倍和2.6倍,呈顯著性差異。

圖4 As5+對(duì)普通小球藻ROS和MDA含量的影響Fig. 4 Effects of As5+ on ROS and MDA contents of C. vulgaris

2.5 不同濃度As5+對(duì)普通小球藻抗氧化酶和能量代謝的影響

As5+脅迫處理96h后,TP和ATP含量隨暴露濃度的增加而降低,0.1、0.5和1 mg/L處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異,1.5和2 mg/L處理組呈顯著降低,TP含量分別為對(duì)照組的68.4%和35.0%,ATP含量分別為對(duì)照組的60.6%和48.1%。T-AOC和T-SOD活性均隨暴露濃度的增加而增加,0.1—1.5 mg/L處理組T-AOC和T-SOD活性與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異,而2 mg/L處理組T-AOC和T-SOD活性分別為對(duì)照組的2.8倍和1.6倍,呈顯著性差異(圖5)。

圖5 As5+脅迫對(duì)普通小球藻TP、ATP、T-AOC和T-SOD含量的影響Fig. 5 Effects of As5+on the contents of TP,ATP,T-AOC and T-SOD in C. vulgaris

2.6 As5+脅迫對(duì)普通小球藻超微結(jié)構(gòu)的影響

As5+脅迫96h后普通小球藻透射電鏡(TEM)圖觀察如圖6所示,對(duì)照組藻細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好清晰可見(jiàn),細(xì)胞壁和質(zhì)膜結(jié)構(gòu)緊密。暴露于As5+2 mg/L處理組藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)異常,胞質(zhì)部分呈空泡化,類囊體片層結(jié)構(gòu)模糊不清,部分溶解消失,葉綠體結(jié)構(gòu)紊亂,僅蛋白核和淀粉鞘結(jié)構(gòu)完好。

圖6 As5+脅迫對(duì)普通小球藻超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Effects of As5+ stress on ultrastructure of C. vulgaris

3 討論

重金屬污染是全球水環(huán)境的主要問(wèn)題之一,藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的主要初級(jí)生產(chǎn)者,能夠最大限度地將光能轉(zhuǎn)化為有機(jī)能,對(duì)維持整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著十分關(guān)鍵的作用,同時(shí)對(duì)棲息環(huán)境變化極為敏感,因而成為監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)。在本研究中,不同濃度As5+脅迫下,普通小球藻生長(zhǎng)均表現(xiàn)出抑制作用,抑制作用隨濃度的增大和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),說(shuō)明抑制作用具有時(shí)間-劑量依賴性。通過(guò)非線性曲線擬合參數(shù),As5+脅迫對(duì)普通小球藻96h-IC50為1.94 mg/L。李莉霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)As5+對(duì)大型溞的96h-LC50為4.25 mg/L;Silva等[19]研究表明As5+對(duì)中肋骨條藻的72h-EC50為4.46 mg/L;Ghadersarbazi等[20]研究表明As5+對(duì)鯉96h-LC50為9.48 mg/L,與本試驗(yàn)結(jié)果相似,并且與前人結(jié)果相比,普通小球藻對(duì)As5+更為敏感。不同受試生物對(duì)As5+存在敏感性差異,可能與受試生物的規(guī)格、健康狀況及生命階段等諸多因素有關(guān),此外,水環(huán)境的理化性質(zhì)也會(huì)對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)產(chǎn)生影響。當(dāng)水環(huán)境處于還原性條件下時(shí),As3+占主導(dǎo)地位,根據(jù)其化學(xué)性質(zhì),As3+毒性比As5+更強(qiáng),Karthikeyan等[21]研究表明As3+對(duì)紡錘水蚤和斑節(jié)對(duì)蝦的96h-LC50分別為0.132和0.66 mg/L,He等[22]研究表明As3+對(duì)水蚤的48h-LC50為0.554 mg/L,與本試驗(yàn)結(jié)果相比,As3+毒性較強(qiáng)與前人結(jié)果一致,As3+對(duì)水生生物的具體毒性效應(yīng)機(jī)制后續(xù)會(huì)進(jìn)一步研究。

光合色素是微藻進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ),Chl.a是微藻光合色素的主要色素,其含量可以直接反映微藻的光合作用效率和生長(zhǎng)狀況[23]。TP作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是衡量藻細(xì)胞代謝水平的重要指標(biāo)[24]。ATP是微藻最重要的高能化合物之一,其主要來(lái)源于呼吸作用中的氧化磷酸化和光合作用中的光磷酸化,因此其含量可直接反應(yīng)藻類細(xì)胞的活性[25]。在本研究中,As5+96h脅迫后,普通小球藻Chl.a、TP和ATP含量與藻細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)一致,隨著暴露濃度的增加,Chl.a和TP含量顯著下降,ATP能量代謝紊亂,藻細(xì)胞活性降低。分析其原因,一方面,可能是As5+脅迫誘導(dǎo)ROS積累,抑制葉綠素酸脂還原酶和丙酮酸脫氫酶等物質(zhì)的活性,阻礙光合色素和ATP酶的合成,導(dǎo)致用于蛋白質(zhì)合成的碳骨架缺乏[26];另一方面,通過(guò)電鏡結(jié)果可知,As5+脅迫損傷藻細(xì)胞膜及胞內(nèi)類囊體和葉綠體等結(jié)構(gòu),光合作用機(jī)能遭到破壞,ATP酶活性中心的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而影響藻細(xì)胞能量代謝等生理功能的發(fā)揮,最終促使藻細(xì)胞凋亡[27];再者,As5+與磷酸鹽具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),能夠通過(guò)磷酸蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),在許多生化反應(yīng)中取代磷酸鹽,并對(duì)細(xì)胞磷代謝產(chǎn)生干擾,從而影響高能磷酸鍵ATP的合成,導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)異常和多種酶促反應(yīng)受阻等[28]。已有研究表明,當(dāng)微藻遭受不同污染物脅迫時(shí),TP和Chl.a含量變化與污染物劑量呈效應(yīng)關(guān)系[29]。張仁璇等[30]研究表明紫球藻ATP酶活性隨Cd2+濃度的增加而顯著降低,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

在正常條件下,機(jī)體產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)含量低,可被機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)有效地清除,ROS產(chǎn)生速率和抗氧化系統(tǒng)的運(yùn)作處于動(dòng)態(tài)平衡,以避免機(jī)體損傷。然而,當(dāng)機(jī)體受到超過(guò)其抗氧化系統(tǒng)能力的環(huán)境脅迫時(shí),機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量ROS無(wú)法消除,從而導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化和光合器官損傷等[31]。在本研究中,2 mg/L處理組ROS水平為對(duì)照組的4.0倍。這說(shuō)明普通小球藻在As5+脅迫下,自身抗氧化系統(tǒng)無(wú)法完全清除污染物產(chǎn)生的自由基,致使藻細(xì)胞受到氧化損傷。在微藻中,ROS主要由環(huán)境脅迫下葉綠體和質(zhì)膜中的電子傳遞活動(dòng)產(chǎn)生的,當(dāng)光合作用相關(guān)基因被抑制、電子傳遞受阻時(shí),多余的電子被輸送到分子氧中,由此產(chǎn)生活性氧[32]。正如本試驗(yàn)電鏡結(jié)果可知,經(jīng)As5+脅迫處理的藻細(xì)胞ROS的增加,可能是葉綠體和類囊體等結(jié)構(gòu)被破壞的結(jié)果一致,與本試驗(yàn)藻細(xì)胞中Chl.a含量與ROS水平呈負(fù)相關(guān)一致。

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物,可以反映生物體受活性氧自由基攻擊的程度,間接反映組織過(guò)氧化損傷程度[33]。在本研究中,1、1.5和2 mg/L處理組MDA含量顯著增加,分別為對(duì)照組的1.6倍、2.0倍和2.6倍,同時(shí)1.5和2 mg/L處理組通透性顯著增加,分別為對(duì)照組的1.7倍和2.2倍。這表明脂質(zhì)過(guò)氧化損傷加劇,改變膜酶、離子通道的脂質(zhì)微環(huán)境,從而使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性增強(qiáng),影響細(xì)胞內(nèi)平衡,最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變,這與透射電鏡結(jié)果相一致。推測(cè)原因,其一,可能是重金屬會(huì)影響藻細(xì)胞金屬硫蛋白的結(jié)合能力,致使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化和膜電位去極化,破壞細(xì)胞膜完整性,損傷細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),進(jìn)而干擾機(jī)體代謝和生長(zhǎng)[34];其二,藻細(xì)胞在脅迫環(huán)境下,Chl.a含量下降,MDA的積累與活性氧的氧化損傷有關(guān)[32]。呂金平等[35]研究發(fā)現(xiàn)隨As3+濃度不斷增加,黃花水龍葉片細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度不斷加深,細(xì)胞膜系統(tǒng)受到不可逆損壞,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和光合作用均受到抑制,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

T-AOC是總抗氧化能力,由生物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)組成,是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合指標(biāo),其中T-SOD是抗氧化系統(tǒng)中的重要組成部分,可以將超陰離子自由基(O2-)轉(zhuǎn)化為H2O和O2,防止機(jī)體受到活性自由基的攻擊,在機(jī)體的自我保護(hù)系統(tǒng)中發(fā)揮著極為重要的作用[36]。在本研究中,暴露于As5+96h后,藻細(xì)胞ROS呈濃度依賴性增加,同時(shí)藻細(xì)胞T-AOC和T-SOD有相似的活性變化,2 mg/L處理組T-AOC和T-SOD活性受到顯著誘導(dǎo),分別為對(duì)照組的2.8倍和1.6倍,表明隨著As5+濃度的增加,對(duì)藻細(xì)胞機(jī)體的刺激增大,ROS產(chǎn)生速率增強(qiáng),抗氧化酶被激活以平衡ROS的產(chǎn)生,其活性增高是為一種典型的清除過(guò)氧化物、維持細(xì)胞功能的應(yīng)激反應(yīng)。因此,T-AOC和T-SOD活性的提高為代償性增高,用以清除As5+脅迫時(shí)ROS產(chǎn)生過(guò)量的毒害,以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡,增強(qiáng)藻細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。張鵬等[37]研究發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)砷脅迫對(duì)銅藻產(chǎn)生氧化損傷,為緩解砷脅迫,銅藻的抗氧化酶(SOD、POD)活性和抗氧化物(GSH、NPT)含量也相應(yīng)提高;蔡卓平等[38]研究表明,較低濃度的重金屬Cd2+和Pb2+脅迫米氏凱倫藻時(shí),機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)激性,SOD活性會(huì)顯著升高,清除機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的自由基,抗氧化酶活性相對(duì)增強(qiáng),本試驗(yàn)結(jié)果與前人結(jié)果相似。

葉綠體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化可以直接反映光合作用能力,其中類囊體是光反應(yīng)的場(chǎng)所,是葉綠體的核心結(jié)構(gòu),類囊體的有序排列可以保證較大的光面積和光合速率[39]。本研究透射電鏡結(jié)果顯示,2 mg/L As5+脅迫下藻細(xì)胞胞質(zhì)部分呈空泡化,類囊體片層結(jié)構(gòu)模糊不清,部分溶解消失,葉綠體結(jié)構(gòu)紊亂。這主要是類囊體膜中富含不飽和脂肪酸,容易受到過(guò)量ROS的攻擊,脂質(zhì)過(guò)氧化程度不斷加深,導(dǎo)致膜的崩潰,光合作用機(jī)能遭到破壞以及能量供應(yīng)不足,造成氧化磷酸化和電子傳遞受阻,嚴(yán)重影響藻細(xì)胞自身的正常生長(zhǎng)以及代謝活動(dòng),促使細(xì)胞凋亡[40],這與上述本試驗(yàn)結(jié)果相一致。這一結(jié)果與Gu等[23]報(bào)道增塑劑鄰苯二甲酸二丁酯會(huì)破壞斜生柵藻和小球藻的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(葉綠體、細(xì)胞膜和蛋白核)的完整性及唐學(xué)璽等[41]研究發(fā)現(xiàn)2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)脅迫米氏凱倫藻,造成藻細(xì)胞胞內(nèi)基質(zhì)出現(xiàn)許多高電子密度區(qū)域及透明空泡,線粒體和葉綠體等細(xì)胞器受到明顯破壞作用,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

4 結(jié)論

由于重金屬對(duì)人類、水生生物和其他生物的毒性,水體重金屬污染對(duì)水環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定是一個(gè)潛在威脅。因此,以水環(huán)境為重點(diǎn)的污染影響研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。本研究證實(shí)了As5+濃度高于1.5 mg/L脅迫下普通小球藻表現(xiàn)出顯著的響應(yīng),表現(xiàn)為藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,Chl.a、TP和ATP含量下降,ROS和MDA含量升高,脂質(zhì)過(guò)氧化程度加深導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增大,藻細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂。但在As5+脅迫下,小球藻可以通過(guò)改變T-AOC和T-SOD活性來(lái)適應(yīng)和調(diào)節(jié),從而提高小球藻對(duì)As5+脅迫的抗性。因此,普通小球藻在As5+脅迫下的一系列生理反應(yīng)可作為水生態(tài)系統(tǒng)中As5+污染的天然生物標(biāo)志物或生物指示物。但是,重金屬砷對(duì)微藻毒性作用機(jī)制復(fù)雜,僅從濃度、受試生物死亡率和抗氧化酶活性等指標(biāo)去判斷有所欠缺,需要后續(xù)進(jìn)一步研究,同時(shí)水環(huán)境實(shí)際污染物呈多元化,重金屬As與其他污染物的聯(lián)合毒性試驗(yàn)亟待開(kāi)展。