甲酰肽受體激活劑丹皮酚抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用

楊小四，邵玉寶，李文昊，龔澤睿，陳萌檬，王家昊，盛書顏，陳曉宇

(1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 安徽 安慶 246052；2.安徽醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，3.安徽醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 安徽 合肥 230032；4 .皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 安徽 蕪湖 241003)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種伴有全身性免疫失調(diào)和自身免疫的滑膜疾病，臨床主要表現(xiàn)是滑膜炎癥和關(guān)節(jié)損傷，由多種因素共同作用引起，包括遺傳因素和環(huán)境因素[1]。在RA中，成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)具有獨(dú)特的侵襲行為，在疾病的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展中作用明顯，F(xiàn)LS已經(jīng)成為RA發(fā)病機(jī)理研究的重要貢獻(xiàn)者[2]。此外，巨噬細(xì)胞參與破壞性的破骨細(xì)胞形成過程，是RA組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的關(guān)鍵來源[3]。因此，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)RAW264.7的巨噬細(xì)胞模型經(jīng)常被用來探索RA發(fā)病機(jī)理[4]。

丹皮酚在現(xiàn)代中國的臨床應(yīng)用有很長的歷史。研究表明，丹皮酚具有廣泛的抗炎活性，能夠降低炎癥細(xì)胞因子(IL-1β和IL-6)水平，通過抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)[5]。在RA患者中，心血管疾病嚴(yán)重程度與RA疾病活動(dòng)的關(guān)系較傳統(tǒng)心血管風(fēng)險(xiǎn)因素的關(guān)系更為密切[6]。丹皮酚同時(shí)具有心臟保護(hù)作用，作為RA治療或輔助治療藥物具有巨大的潛力[7]?？梢姷てし泳哂辛己玫膽?yīng)用前景，但目前對(duì)丹皮酚的藥理作用缺乏整體的評(píng)估。

生物信息學(xué)作為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物，能夠更加深入全面的了解各種生物過程[8]。本研究選取LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型相關(guān)GEO數(shù)據(jù)，通過分析LPS刺激前后及丹皮酚處理前后的差異基因進(jìn)行分析，對(duì)丹皮酚潛在的藥理作用進(jìn)行全面的分析，并對(duì)其中最具有潛力的藥理作用進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS購買于上海冠道生物工程有限公司；RAW264.7細(xì)胞購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；TRIzol(15596026)購買于InvitrogenTM；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)購買于TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒Applied BiosystemsTMSYBRTMGreen(4385610)購買于Thermo Fisher公司；胎牛血清(fetal bovine serum，S711-00sS，Lonsera)；雙抗(penicillin-streptomycin solution，SV30010，Hyclone)；RPMI 1640培養(yǎng)基(RPMI 1640 medium，SH30027.01，HyClone)

1.2 儀器熒光定量儀PCR-ABI(賽默飛世爾科技，美國)；FLIPR Tetra?高通量CCD熒光成像分析系統(tǒng)(美谷分子儀器，上海)；GraphPad Prism 7.00數(shù)據(jù)處理軟件。

1.3 方法

1.3.1數(shù)據(jù)收集 從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)中獲取關(guān)于LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的模型相關(guān)數(shù)據(jù)：GSE86588數(shù)據(jù)集(GPL1261 [Mouse430_2] Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array)，GSE21841數(shù)據(jù)集(GPL18802 [MoGene-2_0-st] Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST Array)，GSE76563數(shù)據(jù)集(GPL10787 Agilent-028005 SurePrint G3 Mouse GE 8x60K Microarray (Probe Name version))，GSE9632(GPL2995 ABI Mouse Genome Survey Microarray)。根據(jù)各的注釋平臺(tái)，去除映射多個(gè)基因的探針和空探針。如果有許多個(gè)探針匹配到相同的基因符號(hào)，則將其平均值視為基因表現(xiàn)值。

1.3.2聯(lián)合分析差異基因 分別提取LPS處理組與對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，首先使用R包“affy”對(duì)數(shù)據(jù)GSE86588、GSE21841和GSE76563進(jìn)行校準(zhǔn)，再根據(jù)每組數(shù)據(jù)的測序平臺(tái)分別注釋，GSE86588使用GPL10787注釋文件進(jìn)行注釋，GSE21841使用GPL1261注釋文件，GSE76563使用GPL18802注釋文件[9]。合并注釋后的文件，并使用R包“sva”去除批次效應(yīng)[10]。3組數(shù)據(jù)分別按照陰性和陽性特點(diǎn)分進(jìn)行分組合并，將3組數(shù)據(jù)集中RAW264.7未處理組與LPS處理組分別合并，分組信息見 Tab 1。使用R包“l(fā)imma”對(duì)合并后的表達(dá)矩陣進(jìn)行差異分析，得到差異基因169個(gè)，其中上調(diào)基因160個(gè)，下調(diào)基因9個(gè)，篩選條件為log Fold Change=1.5，adjustP=0.05。

Tab 1 GEO data list rearrange

1.3.3基因功能富集 使用R語言對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)功能富集和《京都議定書基因與基因組百科全書》(the kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)相關(guān)途徑分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.3.4細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞系RAW264.7使用RPMI 1640培養(yǎng)基，RA-FLS培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基，均添加10%胎牛血清、1%雙抗，在含有5% CO2，環(huán)境溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIzol Reagent (15596026，InvitrogenTM)從細(xì)胞中提取總RNA，使用BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒(with gDNA EZeraser，D7180S)將mRNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (D7268S，beyotime)試劑盒進(jìn)行檢測。參數(shù)設(shè)置：95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 min，60 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，使用CFX96 Touch熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行檢測。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，進(jìn)行熔融曲線分析，以檢查引物-二聚體的存在。數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，所有的樣本都以3個(gè)復(fù)孔處理，并至少進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。引物通過Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)，并用BLAST分析每條引物的特異性，引物序列見Tab 2。

1.3.6細(xì)胞劃痕 使用鉛筆在12孔板底部劃一條水平線，后將RA-FLS細(xì)胞鋪于12孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到50%使用TNF-α刺激細(xì)胞，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，使用不同濃度的丹皮酚進(jìn)行處理，以DMSO為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用槍頭在12孔板中垂直畫線，隨后用磷酸鹽溶液(PBS)洗去漂浮細(xì)胞，于顯微鏡下拍照。將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，再次拍照，比較不同處理方式中細(xì)胞的遷移效率。

1.3.7鈣離子濃度檢測 將FLS細(xì)胞與鈣離子染色劑共同孵育30 min，洗去染色劑，向細(xì)胞中加入不同濃度的丹皮酚及抑制劑 Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-NH2(WRW4)，在FLIPR Tetra?儀器中檢測熒光強(qiáng)度。設(shè)置檢測間隔為10 s，持續(xù)檢測30 min。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)模型中差異基因的篩選生物信息學(xué)在探索藥物機(jī)制方面凸顯出了強(qiáng)大的能力，在轉(zhuǎn)錄層面分析藥物對(duì)基因表達(dá)的影響，利用基因的變化水平及相互關(guān)系分析，為研究藥物提供線索。利用R語言對(duì)3組巨噬細(xì)胞相關(guān)測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行聯(lián)合分析，首先根據(jù)是否經(jīng)過LPS處理分為兩組，分組信息見Tab 1。利用差異基因分析，并繪制差異基因繪制火山圖(Fig 1A)和熱圖(Fig 1B)，其中有9個(gè)表達(dá)下調(diào)基因，160個(gè)上調(diào)基因。選擇其中上調(diào)的6個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在mRNA表達(dá)水平使用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)其中部分基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)6 h后與未經(jīng)誘導(dǎo)的NC組進(jìn)行mRNA表達(dá)水平的檢測Edn1、Ccrl2、Cmpk2、Saa3、Cxcl2、Cxcl11均被上調(diào)(Fig 1C)。驗(yàn)證結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)模型特征與生物信息學(xué)分析結(jié)果相符。這些基因分別代表了不同的聚類子集。

Fig 1 Differentially expressed genes (DEGS) analysis of RAW264.7 cells induced by LPS

2.2 差異基因功能富集分析通過對(duì)169個(gè)基因進(jìn)行功能富集，包括GO(gene ontology,GO)，生物學(xué)過程(biological process，BP)，細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。分析結(jié)果表明169個(gè)DEGs與生物學(xué)過程、細(xì)胞微環(huán)境、分子功能與炎癥水平密切相關(guān)(Fig 2A)。先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞外空間、細(xì)胞因子活性。KEGG基因功能分析結(jié)果表明162個(gè)DEGs主要集中在炎癥相關(guān)通路(如TNF signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway)，表明這些差異基因主要與細(xì)胞炎癥水平密切相關(guān)(Fig 2B)。

Fig 2 GO functional enrichment

2.3 丹皮酚的基因影響分析使用GEO2R分析數(shù)據(jù)集GEO9632，分析丹皮酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，有275個(gè)基因受到丹皮酚影響，其中147個(gè)上調(diào)，128個(gè)下調(diào)。對(duì)此275個(gè)DEGs繪制火山圖(Fig 3A)，并進(jìn)行了KEGG富集分析(Fig 3C)。根據(jù)KEGG分析顯示，丹皮酚主要影響生物過程“Amacrine cell differentiation”和細(xì)胞成分“Plasma membrane”。

Fig 3 DEGs analysis about RAW264.7 cells treated with paeonol or not

對(duì)丹皮酚調(diào)控的基因進(jìn)行進(jìn)一步的分析，通過對(duì)受丹皮酚影響的275個(gè)基因與169個(gè)受LPS調(diào)控的炎癥相關(guān)基因進(jìn)行Venn圖繪制(Fig 3B)。得到了3個(gè)同時(shí)受LPS和丹皮酚共同調(diào)控的基因，甲酰酞受體(formyl peptide receptor,FPR)、Cd83與Cfb可能與丹皮酚的作用機(jī)制相關(guān)。這里我們主要分析了甲酰肽受體FPR，F(xiàn)PR主要分布于人體免疫細(xì)胞，調(diào)控多種重要生理功能，廣泛參與各類炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展[11]。

2.4 丹皮酚通過FPRL1抑制FLS發(fā)展通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察FPRL1在細(xì)胞遷移中的影響。通過RT-PCR檢測FLS不同處理組炎癥因子mRNA水平，以評(píng)價(jià)丹皮酚對(duì)炎癥因子的抑制能力。結(jié)果表明，丹皮酚能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的FLS遷移，同時(shí)FPRL1抑制劑WRW4能夠拮抗丹皮酚對(duì)FLS遷移的抑制作用(Fig 4A)。經(jīng)過TNF-α誘導(dǎo)后，炎癥因子水平明顯升高，在丹皮酚處理6 h后降低。在使用了FPR選擇性抑制劑WRW4后，丹皮酚的抑制炎癥能力被明顯抑制，提示丹皮酚的抗炎作用一定程度上依賴FPR的激活(Fig 4C)。綜上所述，丹皮酚能夠抑制FLS細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，且FPRL1在其中起到重要作用。

Fig 4 Paeonol has anti-inflammatory effect in FLS

2.5 丹皮酚影響FPR的激活FPR配體可能是一種能夠改善RA炎癥和骨骼損傷的新型治療藥物。為了進(jìn)一步證明丹皮酚可以作為FPR的配體，激活FPR受體功能，研究了丹皮酚對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響(Fig 5)。丹皮酚在10 μmol·L-1濃度下能夠明顯提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，且這種能力被抑制劑WRW4所限制。

Fig 5 Paeonol affected calcium influx in FLS through FPRL1 Determination of calcium ion concentration in FLS cells treated with paeonol and WRW4.

3 討論

丹皮酚具有廣泛的抗炎作用，在RA中有多種機(jī)制，但是缺乏其對(duì)RA的系統(tǒng)研究[12]。本研究通過LPS-RAW264.7模型進(jìn)行差異基因篩選，該模型在許多炎癥疾病表型中具有代表性[4]。分析獲得160個(gè)上調(diào)，9個(gè)下調(diào)基因，根據(jù)基因分枝樹圖不同，各分枝內(nèi)隨機(jī)選取一個(gè)基因，共計(jì)6個(gè)基因(Edn1、Ccrl2、Cmpk2、Saa3、Cxcl2、Cxcl11)進(jìn)行mRNA表達(dá)水平檢測，取得結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果趨勢一致。

為了分析這些基因在細(xì)胞中承擔(dān)的功能，對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG分析，GO分析結(jié)果主要為Innate immune response，Defense response to virus等機(jī)體免疫功能，KEGG分析主要與TNF signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway等與炎癥通路相關(guān)，與先前的報(bào)道一致，為后續(xù)丹皮酚藥理分析奠定了基礎(chǔ)。

接下來研究丹皮酚對(duì)該模型中基因及細(xì)胞功能的影響。通過對(duì)LPS-RAW264.7模型在丹皮酚處理前后進(jìn)行分析，得到275個(gè)差異基因，并對(duì)其進(jìn)行KEGG分析。結(jié)果顯示，丹皮酚主要影響生物過程“Amacrine cell differentiation”和細(xì)胞成分“Plasma membrane”。由此推斷，丹皮酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥抑制可能通過細(xì)胞膜相關(guān)功能而產(chǎn)生。

綜合以上兩部分差異基因，對(duì)其進(jìn)行Venn分析，結(jié)果提示FPR、Cd83與Cfb為丹皮酚作用機(jī)制的核心基因。根據(jù)丹皮酚KEGG分析結(jié)果，其主要影響細(xì)胞膜相關(guān)功能，遂將研究重點(diǎn)聚焦在FPR蛋白。

FPR屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，在維持炎癥反應(yīng)的平衡中有非常重要的作用[13]。眾多研究表明，F(xiàn)PRL1可能是一種能夠改善RA炎癥和骨損傷的新型治療藥物[14]。FPRL1的這種特性吸引了我們注意力，并對(duì)其進(jìn)行更深入的研究，我們推測丹皮酚可能通過FPR產(chǎn)生對(duì)關(guān)節(jié)炎的抑制作用。目前已有FPR激活劑被證明可以抑制RA的發(fā)展，抗菌肽Scolopendrasin IX可以通過激活FPRL1產(chǎn)生對(duì)RA的治療作用[15]；FPR激動(dòng)劑Cpd43在RA小鼠模型中減少破骨細(xì)胞形成和炎癥，并在相關(guān)的人類細(xì)胞中顯示抗炎作用[14]。FPRL1對(duì)關(guān)節(jié)炎的抑制作用可以被抑制劑WRW4(Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-NH2)減弱[16]。

本研究中，丹皮酚對(duì)FLS細(xì)胞的炎癥抑制作用能夠被WRW4所阻礙，在WRW4的作用下，丹皮酚對(duì)TNF-α誘導(dǎo)FLS細(xì)胞中IL-6、TNF-α與IL-1β的水平的抑制作用有所減弱(Fig 4 C)。丹皮酚對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)的能力依賴于FPR的激活，提示丹皮酚對(duì)關(guān)節(jié)炎的抑制作用可能在一定程度上依賴于FPR的激活。

研究表明，F(xiàn)PR激活后，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流[17]。為了進(jìn)一步了解丹皮酚是否能夠激活FPR，并引起炎癥抑制，對(duì)丹皮酚產(chǎn)生的鈣離子內(nèi)流水平進(jìn)行探究。如圖Fig 5所示，丹皮酚能夠增加鈣離子內(nèi)流，且該作用被抑制劑WRW4所阻礙。因此，我們認(rèn)為丹皮酚能夠促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，但該研究仍有局限，尚不能確定是否為直接影響。

綜上，我們認(rèn)為丹皮酚能夠通過FPR通路對(duì)RA產(chǎn)生抑制作用，但僅限于此，在今后的研究中需進(jìn)一步的探索，確認(rèn)丹皮酚是否直接影響FPR的激活。此外，本研究中利用了GEO數(shù)據(jù)庫內(nèi)已經(jīng)公開的測序數(shù)據(jù)，結(jié)合多個(gè)數(shù)據(jù)組進(jìn)行綜合分析，充分挖掘已有的測序結(jié)果，對(duì)公共數(shù)據(jù)庫內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了充分的利用，并進(jìn)行了優(yōu)化與探索。