槲皮素調(diào)控巨噬細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)改善載脂蛋白E敲除小鼠動脈粥樣硬化

羅 綱，向 露，姚 平，肖 琳

(中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院1.衛(wèi)生毒理學(xué)系、2.營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，湖南 長沙 410078；3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，湖北 武漢 430030)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為全球“頭號殺手”—心血管疾病的關(guān)鍵病理學(xué)基礎(chǔ)及急性發(fā)作致死、致殘的幕后元兇，長期以來嚴(yán)重威脅人類健康。因此，針對AS主要病理生理學(xué)特點和關(guān)鍵生物學(xué)事件，探索新的干預(yù)措施，有望為AS的防控提出新的方向。

AS是一種慢性退行性病變，其病變范圍廣，累及各大、中動脈，典型表現(xiàn)為內(nèi)膜下脂質(zhì)蓄積、內(nèi)皮受損、炎性細(xì)胞大量浸潤、粥樣斑塊形成及由管腔狹窄，最終引發(fā)的靶器官缺血性改變[1]。其中，由巨噬細(xì)胞膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)引發(fā)的細(xì)胞泡沫化作為斑塊形成的核心機(jī)制，在AS進(jìn)程中扮演著重要角色。泡沫細(xì)胞的形成來源于不平衡的巨噬細(xì)胞膽固醇攝取與外排，表現(xiàn)為CD36、SRA-1、LOX1等多種清道夫受體表達(dá)上調(diào)后對氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein ，ox-LDL)的吞噬內(nèi)化增加，以及由ATP結(jié)合盒亞族A1/G1(ATP-binding cassette subfamily A1/G1，ABCA1/G1)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的膽固醇外排減少[2]。泡沫細(xì)胞在受損內(nèi)皮下空間的形成和積聚是AS斑塊形成的標(biāo)志性事件。因此，進(jìn)一步闡明巨噬細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制對抑制細(xì)胞泡沫化并改善AS至關(guān)重要。

槲皮素(quercetin，Qu)作為一種廣泛存在的黃酮類物質(zhì)，膳食來源多種多樣，在洋蔥、蘆筍、青椒等蔬菜及蘋果、柑橘、甜瓜等水果中的含量尤為豐富[3]。流行病學(xué)研究表明，人群增加槲皮素等膳食黃酮類的日常攝取，可明顯減少心血管疾病的發(fā)病幾率[4]。大量體內(nèi)、外實驗研究表明，槲皮素對AS發(fā)生發(fā)展的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)均表現(xiàn)出良好的保護(hù)效應(yīng)，如降低斑塊氧化應(yīng)激水平、拮抗炎癥和恢復(fù)血管內(nèi)皮功能等[5-6]。更重要的是，研究表明槲皮素可特異性靶向富集于AS斑塊巨噬細(xì)胞，為其在斑塊微環(huán)境中發(fā)揮多種生物活性功能奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。然而，槲皮素對AS保護(hù)作用的潛在機(jī)制至今尚未完全明確。因此，本研究使用高脂膳食喂養(yǎng)載脂蛋白E敲除(apolipoprotein E knockout，ApoE KO)小鼠建立AS模型，采用ox-LDL孵育RAW264.7巨噬細(xì)胞建立體外泡沫細(xì)胞模型并使用槲皮素干預(yù)，聚焦于巨噬細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)控，探討槲皮素改善AS的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞SPF級成年♀ ApoE KO小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(SCXK【京】2019-0011)。飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。RAW264.7細(xì)胞系購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫(貨號：TCM13)。

1.2 試劑血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)檢測試劑盒(中生北控生物科技)；細(xì)胞總、游離膽固醇檢測試劑盒(普利萊生物科技)；油紅O(Sigma-Aldrich)；ox-LDL、Dil標(biāo)記的ox-LDL(Dil-labeled-ox-LDL)(奕源生物科技)；25-NBD-cholesterol (Avanti Polar Lipids)；槲皮素(Sigma)；環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A，Cyc A，CYP27A1抑制劑)(MedChem Express)；細(xì)胞色素P450 27羥化酶(cytochrome P450 27-hydroxylase，CYP27A1)抗體(14739-1，proteintech)；清道夫受體B(scavenger receptor B，CD36)抗體(18836-1，proteintech)；肝X受體α(liver receptor Xα，LXRα)(ab176323，Abcam)；ABCA1抗體(NB400-105，Novus Biologicals)；ABCG1抗體(ab52617，Abcam)；GAPDH抗體(2118，CST)；HRP標(biāo)記抗兔IgG抗體(7074，CST)。

1.3 儀器ELX800型酶標(biāo)儀(美國BIOTEK)；熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；7900HT熒光定量PCR儀(美國ABI)；凝膠成像系統(tǒng)(英國SYNGENE)。

1.4 動物模型[6]將45只成年♀ApoE KO小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，即普通飼料組(normal diet，ND)、高脂飼料組(high fat diet，HFD，21%脂肪和0.15%膽固醇)、高脂飼料+槲皮素組(HFD+Qu，100 mg·kg-1體質(zhì)量)。根據(jù)體質(zhì)量確定HFD+Qu組小鼠每日槲皮素灌胃量，每周記錄小鼠進(jìn)食量與體質(zhì)量。持續(xù)喂養(yǎng)16周后，2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，經(jīng)眼眶內(nèi)眥動脈叢取血，并迅速分離其主動脈，采用4%多聚甲醛固定或-80 ℃冰箱凍存。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)[6，8]將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度近70%時采取如下處理，對照組(Con，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng))、ox-LDL干預(yù)組(50 mg·L-1ox-LDL孵育)、ox-LDL+Qu干預(yù)組(50 mg·L-1ox-LDL和100 μmol·L-1槲皮素共同孵育)、Qu干預(yù)組(100 μml·L-1槲皮素孵育)、ox-LDL+Qu+Cyc A干預(yù)組(50 mg·L-1ox-LDL、100 μmol·L-1槲皮素和20 μmol·L-1Cyc A共同孵育)、Cyc A干預(yù)組(20 μmol·L-1Cyc A孵育)。

1.6 主動脈弓橫截面油紅O及HE染色取長約2 mm的各組小鼠主動脈弓組織，經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟后進(jìn)行OCT包埋并切片，每只小鼠收集10～15張切片，行油紅O及HE染色。在顯微鏡下隨機(jī)挑選視野，采集圖像。

1.7 生化指標(biāo)測定采用相應(yīng)試劑盒，根據(jù)操作說明檢測各組小鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平。

1.8 PCR采用TRIzol法提取各組小鼠主動脈組織總RNA，嚴(yán)格按照說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后采用SYBR-Green擴(kuò)增cDNA并獲得Ct值。引物序列見Tab 1。β-actin為內(nèi)參基因，利用2-△△Ct法得到各基因表達(dá)水平。

1.9 細(xì)胞油紅O染色分別使用4%多聚甲醛和60%異丙醇對經(jīng)過干預(yù)處理的各組細(xì)胞進(jìn)行固定和浸洗，隨后加入適量油紅工作液，37 ℃孵育1 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況并采集圖像。

1.10 細(xì)胞Dil-ox-LDL攝取實驗用含Dil-ox-LDL(5 mg·L-1)的無酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)已干預(yù)處理后各組細(xì)胞2 h后，利用熒光顯微鏡采集目標(biāo)圖像。

1.11 細(xì)胞總膽固醇及游離膽固醇水平測定根據(jù)試劑盒說明書所述操作方法與步驟測定經(jīng)干預(yù)處理的各組細(xì)胞的總膽固醇及游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)水平。

1.12 膽固醇外流試驗含熒光標(biāo)記膽固醇NBD-cholesterol(5 μmol·L-1)的無酚紅培養(yǎng)基孵育細(xì)胞4 h后，棄去上清并清洗，隨后分別添加含apoA-I(50 mg·L-1)或HDL(50 mg·L-1)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。依次收集培養(yǎng)上清，并0.1%Triton溶液充分裂解細(xì)胞。檢測上清培養(yǎng)液及細(xì)胞裂解液熒光強(qiáng)度數(shù)值。計算公式：膽固醇外流率/%=上清熒光值/(上清熒光值+細(xì)胞裂解液熒光值)×100%。

1.13 蛋白免疫印跡(Western blot)收集待測細(xì)胞，RIPA裂解液于冰上充分裂解并提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測定樣品蛋白濃度后，進(jìn)行蛋白變性。上樣后電泳完成蛋白分離，將蛋白濕轉(zhuǎn)于PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h。隨后相繼進(jìn)行一抗、二抗孵育及洗膜后，加入顯影試劑并使用凝膠成像儀采集條帶圖像，利用Quantity one軟件檢測蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素減少ApoE KO小鼠AS斑塊面積如Fig 1所示，ND組的主動脈內(nèi)膜呈增生狀，并存在泡沫細(xì)胞聚集及炎性細(xì)胞浸潤；與之相較，HFD組的主動脈結(jié)構(gòu)明顯異常，管腔狹窄，內(nèi)膜增厚并附著斑塊，其內(nèi)泡沫細(xì)胞和無結(jié)構(gòu)壞死物大量存在。與HFD組相比，槲皮素干預(yù)組AS斑塊損傷明顯改善，以內(nèi)膜增厚伴泡沫細(xì)胞浸潤為主要表現(xiàn)，無明顯斑塊附著。

Fig 1 Quercetin ameliorated atherosclerotic lesion formation in ApoE KO mice

2.2 槲皮素降低ApoE KO小鼠血脂水平如Tab 2所示，相比于ND組，血TG、TC及LDL-C水平在HFD組均明顯增高(P<0.01)，HDL-C水平則明顯下降(P<0.05)。相反，相比于HFD組，槲皮素干預(yù)組的TG、TC和LDL-C水平明顯降低，分別降低了約34%、26%和45%(P<0.05)，HDL-C水平則增高了約30%(P<0.05)。血脂水平變化與前述各組小鼠AS斑塊形成情況相一致。

2.3 槲皮素改善ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積細(xì)胞油紅O染色結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)ox-LDL處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴數(shù)量(Fig 2A)及Dil-ox-LDL的熒光強(qiáng)度(Fig 2B)明顯增加，由HDL與載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，apoA-I)介導(dǎo)的膽固醇流出率較對照組分別增加了近30%和48%(Fig 2C)，此外，細(xì)胞內(nèi)TC和FC水平明顯升高(Fig 2D)。經(jīng)槲皮素干預(yù)后，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積較ox-LDL組明顯減少，Dil-ox-LDL熒光強(qiáng)度明顯降低，膽固醇流出率進(jìn)一步上升。

Fig 2 Quercetin reduced ox-LDL-induced lipid accumulation in RAW264.7 macrophages

2.4 槲皮素對膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Tab 3所示，與ND組相比，HFD組小鼠主動脈LXRα、CD36、ABCA1及ABCG1的mRNA表達(dá)水平均明顯上升(P<0.05)。HFD組小鼠主動脈CYP27A1的mRNA表達(dá)水平雖高于ND組，但無統(tǒng)計學(xué)差異。相比于HFD組，在槲皮素干預(yù)后，小鼠主動脈組織中CYP27A1、LXRα及ABCA1的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)；而CD36的mRNA表達(dá)水平呈明顯性下降(P<0.01)。如Fig 3所示，RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)后，CD36及ABCG1蛋白水平明顯升高(P<0.05)；CYP27A1、LXRα及ABCA1蛋白水平雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而槲皮素干預(yù)不僅使靜息狀態(tài)下的CYP27A1、LXRα及ABCA1/G1蛋白水平明顯升高，同時進(jìn)一步明顯上調(diào)由ox-LDL誘導(dǎo)的CYP27A1、LXRα和ABCA1/G1蛋白表達(dá)(P<0.05)。相反，槲皮素對靜息狀態(tài)及ox-LDL誘導(dǎo)的CD36蛋白表達(dá)均存在明顯的抑制作用(P<0.05)。

Fig 3 Effects of quercetin on cholesterol homeostasis-related protein expressions in RAW264.7 macrophages

2.5 槲皮素通過CYP27A1/LXRα信號通路調(diào)控膽固醇穩(wěn)態(tài)如Fig 4所示，由ox-LDL干預(yù)的巨噬細(xì)胞，預(yù)孵CYP27A1抑制劑Cyc A可明顯下調(diào)由槲皮素誘導(dǎo)的CYP27A1、LXRα及ABCA1/G1蛋白表達(dá)；并有效拮抗槲皮素對CD36蛋白表達(dá)的抑制作用(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)TC和FC水平均明顯升高(P<0.05)。此外，Cyc A干預(yù)可明顯降低靜息狀態(tài)下的CYP27A1和LXRα蛋白表達(dá)，并誘導(dǎo)CD36蛋白表達(dá)(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)TC水平較對照組明顯升高(P<0.05)。

Fig 4 Cyc A antagonized protective effects of quercetin on ox-LDL-induced macrophage cholesterol disequilibrium

3 討論

巨噬細(xì)胞作為構(gòu)成AS斑塊最主要的細(xì)胞成分之一，在AS進(jìn)程的各個環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要作用。研究表明槲皮素可特異性靶向富集于AS斑塊巨噬細(xì)胞，為其在斑塊微環(huán)境中發(fā)揮多種生物活性功能奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。本研究表明，槲皮素干預(yù)可顯著改善HFD喂養(yǎng)的ApoE KO小鼠AS主動脈斑塊損傷。由ox-LDL誘發(fā)的巨噬細(xì)胞泡沫化是AS斑塊形成的核心事件，本研究以50 mg·L-1ox-LDL孵育RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h建立泡沫細(xì)胞模型，經(jīng)槲皮素干預(yù)后，巨噬細(xì)胞TC、FC水平明顯降低，泡沫化程度有效減輕。

巨噬細(xì)胞泡沫化源于膽固醇攝取與外排過程的顯著不平衡，主要表現(xiàn)為清道夫受體增加對ox-LDL的攝取，而膜膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體減少對膽固醇的外排。CD36是巨噬細(xì)胞內(nèi)極為重要的清道夫受體[9]；而ABCA1/G1作為介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，其在荷脂巨噬細(xì)胞膽固醇外流過程中發(fā)揮不可替代的作用[10]。已有研究報道，LXRα可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控ABCA1/G1的蛋白表達(dá)[11]。本研究表明，槲皮素可明顯拮抗由ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞上調(diào)的CD36蛋白，減少巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取，這一結(jié)果與Choi等[12]的報道相一致。與此同時，槲皮素干預(yù)可有效拮抗由ox-LDL誘導(dǎo)激活的巨噬細(xì)胞LXRα-ABCA1/G1信號通路，明顯增加巨噬細(xì)胞膽固醇流出率，這一現(xiàn)象與Jia等[13]報道相一致。然而槲皮素對CD36及LXRα-ABCA1/G1信號通路的潛在調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

CYP27A1是一種功能多樣的細(xì)胞色素P450羥化酶，主要存在于細(xì)胞線粒體，可羥基化膽固醇的第27位碳基位點生成27-羥基膽固醇(27HC)。27HC作為LXRα的高親和度內(nèi)源性配體，在膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中扮演了重要角色[14]。研究表明，CYP27A1可通過介導(dǎo)27HC生成，激活LXRα-ABCA1/G1信號通路以促進(jìn)膽固醇外流[15]；此外，巨噬細(xì)胞在27HC干預(yù)后，其清道夫受體CD36蛋白水平卻明顯下調(diào)[16]。由此表明，CYP27A1對巨噬細(xì)胞膽固醇攝取和外流過程具有雙向調(diào)控作用，是維持細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)并由此改善AS的關(guān)鍵蛋白。本研究表明，槲皮素干預(yù)明顯上調(diào)CYP27A1蛋白水平，誘導(dǎo)下游LXRα-ABCA1/G1蛋白表達(dá)，并抑制CD36蛋白表達(dá)，有效降低巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平；而使用CYP27A1特異性抑制劑Cyc A可有效拮抗槲皮素的上述保護(hù)作用，表明由CYP27A1調(diào)控的CD36與LXRα-ABCA1/G1信號通路在槲皮素調(diào)控巨噬細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，槲皮素可通過上調(diào)CYP27A1蛋白表達(dá)，抑制由CD36介導(dǎo)的膽固醇攝取，并增加由LXRα-ABCA1/G1信號通路介導(dǎo)的膽固醇輸出，有效降低巨噬細(xì)胞泡沫化水平而發(fā)揮AS保護(hù)作用。槲皮素調(diào)控CYP27A1表達(dá)的潛在分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。