利拉魯肽通過調(diào)控AMPK/mTOR自噬信號減輕糖尿病大鼠心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷

張 哲,王 杏,楊林泉,馬慧娟

(河北省人民醫(yī)院代謝病重點(diǎn)實驗室,河北 石家莊 050051)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是以高血糖、胰島素抵抗為特征的慢性代謝性疾病,長期血糖控制不良容易誘發(fā)心、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等各種并發(fā)癥。其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因。研究認(rèn)為，代謝紊亂、炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等因素均參與DCM發(fā)生發(fā)展,進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加[1]。然而,T2DM導(dǎo)致心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制仍不明確。自噬是通過溶酶體途徑降解、清除細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的重要過程,廣泛參與細(xì)胞生長、增殖、能量代謝等生理和病理過程[2]。研究發(fā)現(xiàn),自噬與胰島素抵抗、糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),調(diào)控細(xì)胞自噬已經(jīng)成為防治DCM的重要手段[3]。

利拉魯肽(liraglutide,LRG)是臨床常用的新型降糖藥物。新近研究證實,除了降糖作用外,LRG還對糖尿病心肌損傷具有保護(hù)作用[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),LRG不僅能夠改善T2DM大鼠糖脂代謝紊亂及心肌組織病理變化,還能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化,從而延緩高糖誘導(dǎo)的心肌損傷[5]。然而,自噬在LRG心血管保護(hù)作用中所扮演的角色及相關(guān)調(diào)控機(jī)制,目前尚未完全明確。本實驗中我們旨在探討LRG是否通過調(diào)控AMPK/mTOR自噬信號減輕T2DM大鼠心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 40只SPF級雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號SCXK(京)2016-0006,6～8周齡,體質(zhì)量(200～220)g。

1.1.2藥物與試劑 LRG,諾和諾德；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),Sigma；甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)檢測試劑盒,建成；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,Roche；IL-6(貨號ab6672)、TNF-α(貨號ab6671)、IL-1β(貨號ab9787)、NOX2(貨號ab31092)、NOX4(貨號ab133303)、cleaved caspase-3(貨號ab32042)、Bax(貨號ab32503)、Bcl-2(貨號ab194583)、Beclin-1抗體(貨號ab62557),Abcam；Atg5(貨號CST 2630)、LC3(貨號CST 4108)、AMPK(貨號CST 2532)、p-AMPK(貨號CST 2535)、mTOR(貨號CST 2983)、p-mTOR抗體(貨號CST 5536),Cell Signaling Technology。

1.1.3儀器 血糖儀(強(qiáng)生)；彩色多普勒超聲儀(Visual Sonics)；冷凍高速離心機(jī)、紫外分光光度計(Thermo)；凝膠成像系統(tǒng)(賽智)。

1.2 方法

1.2.1造模及分組 SD大鼠隨機(jī)分為對照組(CON,n=10)、造模組(n=30),CON組給予普通飼料喂養(yǎng),造模組給予高脂飼料喂養(yǎng),8周后一次性腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)以構(gòu)建T2DM大鼠模型,以空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)≥16.7 mmol·L-1持續(xù)1周作為判斷T2DM造模成功的標(biāo)準(zhǔn),繼續(xù)給予高脂飲食。成模大鼠30只隨機(jī)分為T2DM組、LRG組、LRG+AMPK抑制劑Compound C組(LRG+CC)。LRG組給予LRG(200 μg·kg-1·d-1)皮下注射,LRG+CC組在LRG皮下注射的同時給予CC(10 mg·kg-1·d-1)腹腔注射,CON組和T2DM組予以等體積生理鹽水,干預(yù)4周。

1.2.2超聲心動圖檢測 采用彩色多普勒超聲檢測大鼠左室舒張末期直徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室收縮末期直徑(left ventricular end-systolic dimension,LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)、左室舒張早期最大血流/二尖瓣心房收縮期最大血流(ratio of E/A)。

1.2.3標(biāo)本采集 干預(yù)結(jié)束后,采用2%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈采血,4 ℃下5 000 r·min-1離心15 min,分離血清,-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｑ杆賱冸x心臟,剪取心肌組織,用生理鹽水清洗殘留血液,一份置于-80 ℃冰箱中備用,另一份置于多聚甲醛中固定,制作石蠟切片,行TUNEL染色。

1.2.4糖脂代謝指標(biāo)檢測 血糖儀和試紙測定FBG；試劑盒測定血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量,根據(jù)說明書操作。

1.2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 比色法測定心肌SOD、GSH活性及MDA含量,根據(jù)說明書操作。

1.2.6TUNEL染色 心肌組織石蠟切片按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行染色處理,熒光顯微鏡下觀察并計算凋亡細(xì)胞數(shù)量。凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)/%=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.7Western blot 提取各處理組心肌組織總蛋白,BCA法定量蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,采用5%脫脂奶粉封閉2 h,加入特異性一抗(IL-6、IL-1β、NOX2、NOX4、cleaved caspase-3、Bax、LC3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR的稀釋比例為1 ∶1 000,TNF-α、Bcl-2、Atg5、Beclin-1的稀釋比例為1 ∶500),4 ℃冰箱孵育過夜,洗膜后加入二抗,室溫孵育1 h,ECL顯影劑顯色后用ImageJ進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 LRG對T2DM大鼠血糖、血脂的影響如Tab 1所示,與CON組比較,T2DM組FBG、TG、TC、LDL-C明顯升高,HDL-C明顯降低(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組FBG、TG、TC、LDL-C明顯降低,HDL-C明顯升高(P<0.05或P<0.01),但使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.05或P<0.01)。

Tab 1 Effects of LRG on blood glucose and blood lipids in T2DM n=10)

2.2 LRG對T2DM大鼠心功能的影響如Tab 2所示,與CON組比較,T2DM組LVEDD、LVESD明顯升高,LVEF、FS、E/A明顯降低(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組LVEDD、LVESD明顯降低,LVEF、FS、E/A明顯升高(P<0.01),但使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.05或P<0.01)。

Tab 2 Effects of LRG on cardiac function in T2DM n=10)

2.3 LRG對T2DM大鼠心肌炎癥因子表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示(Fig 1),與CON組比較,T2DM組心肌IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組心肌IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯降低(P<0.01),但使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.05或P<0.01)。

Fig 1 Effects of LRG on IL-6, TNF-α and IL-1β expression

2.4 LRG對T2DM大鼠心肌氧化應(yīng)激的影響如Tab 3所示,與CON組比較,T2DM組心肌SOD、GSH活性明顯降低,MDA含量明顯升高(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組心肌SOD、GSH活性明顯升高,MDA含量明顯降低(P<0.01),但使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示(Fig 2),與CON組比較,T2DM組心肌氧化應(yīng)激標(biāo)志分子NOX2、NOX4表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組心肌NOX2、NOX4表達(dá)明顯降低(P<0.01),但使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.05或P<0.01)。

Tab 3 Effects of LRG on oxidative stress in cardiac tissues of T2DM rats n=10)

Fig 2 Effects of LRG on NOX2 and NOX4 expression in cardiac tissues of T2DM n=5)

2.5 LRG對T2DM大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示(Fig 3A),與CON組比較,T2DM組心肌細(xì)胞AI明顯升高(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組心肌細(xì)胞AI明顯降低(P<0.01),但使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示(Fig 3B),與CON組比較,T2DM組心肌凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、Bax表達(dá)明顯升高,Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組心肌cleaved caspase-3、Bax表達(dá)明顯降低,Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.01),但使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.05或P<0.01)。

Fig 3 (A)Representative images of TUNEL staining (×400,scale bar=50 μm,n=6)；(B)Effects of LRG on cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 expression in cardiac tissues of T2DM rats vs CON group；##P<0.01 vs T2DM group；▲P<0.05,▲▲P<0.01 vs LRG group

2.6 LRG對T2DM大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示(Fig 4),與CON組比較,T2DM組心肌自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組心肌Atg5、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)明顯升高(P<0.05或P<0.01),而使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.01)。

Fig 4 Effects of LRG on Atg5, Beclin-1 and LC3 expression in cardiac tissues of T2DM n=5)

2.7 LRG對T2DM大鼠心肌AMPK/mTOR通路的影響Western blot結(jié)果顯示(Fig 5),與CON組比較,T2DM組心肌p-AMPK/AMPK表達(dá)明顯降低,p-mTOR/mTOR表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與T2DM組比較,LRG組心肌p-AMPK/AMPK表達(dá)明顯升高,p-mTOR/mTOR表達(dá)明顯降低(P<0.01),但使用AMPK抑制劑Compound C能夠明顯逆轉(zhuǎn)LRG的作用(P<0.01)。

3 討論

近年來,糖尿病患病率增長迅速,已經(jīng)成為威脅全球人類健康的慢性疾病之一,容易誘發(fā)一系列嚴(yán)重并發(fā)癥,例如心血管疾病、外周血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腎臟疾病。其中糖尿病患者心血管并發(fā)癥發(fā)生率約為正常人的2～3倍,且預(yù)后差,約2/3以上的糖尿病患者死于心血管并發(fā)癥。DCM是由于高血糖、胰島素抵抗、代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎性損傷等病理因素共同作用引起的特異性心肌病,心肌肥厚、間質(zhì)纖維化、炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞凋亡是其主要病理特征,這也是導(dǎo)致DCM左室收縮和舒張功能障礙,進(jìn)而發(fā)展為心力衰竭和猝死的主要原因之一。

Fig 5 Effects of LRG on p-AMPK, AMPK, p-mTOR and mTOR expression in cardiac tissues of n=5)

如何采取有效措施早期防治糖尿病心肌損傷是目前臨床丞待解決的問題。

LRG是一種新型GLP-1受體激動劑,2014年，美國FDA證實LRG(3 mg·d-1)能夠有效控制血糖并降低體重,目前LRG已經(jīng)廣泛應(yīng)用于T2DM的臨床治療中。尤為重要的是,多項臨床研究發(fā)現(xiàn),相較于其他降糖藥物(西格列汀、二甲雙胍等),LRG對T2DM患者具有明確的心臟保護(hù)作用。Madsbad等[6]研究指出,LRG能夠明顯降低T2DM患者心血管死亡率,患者心肌梗死、猝死再入院率明顯降低,并且這一作用并不完全歸因于其對血糖、血壓、體質(zhì)量等代謝指標(biāo)的改善。本研究結(jié)果顯示,高脂飲食和低劑量STZ腹腔注射建立的T2DM大鼠存在明顯的糖脂代謝紊亂,同時心臟收縮和舒張功能減退,LRG能改善血糖、血脂和心功能指標(biāo),提示LRG對糖尿病心肌損傷具有潛在保護(hù)作用,與臨床研究結(jié)果一致。然而,LRG對心血管的作用機(jī)制很大程度上是未知的,仍需深入研究。

研究顯示,高糖可通過激活TLRs/NF-κB/NLRP3信號通路導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤并上調(diào)炎癥因子表達(dá),這是導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化、心肌重構(gòu)和舒張功能障礙的重要因素。另外,高糖、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙導(dǎo)致活性氧生成增加和脂質(zhì)過氧化,同時機(jī)體抗氧化防御能力下降,誘發(fā)氧化應(yīng)激,最終通過死亡受體途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步加重心臟功能障礙。因此,調(diào)控炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激對于防治DCM至關(guān)重要。目前,體內(nèi)外模型證實LRG在高糖誘導(dǎo)的心肌損傷中具有不同程度的抗炎、抗氧化應(yīng)激作用。Trang等[7]研究報道,糖尿病大鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TNF-α、caspase-3表達(dá)及凋亡指數(shù)增加,導(dǎo)致心肌纖維化和心功能降低；給予LRG可下調(diào)NLRP3、IL-1β、TNF-α、caspase-3表達(dá),改善心肌纖維化和心功能；在高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中,LRG能夠上調(diào)Bcl-2表達(dá)、增加SOD活性,同時下調(diào)cleaved caspase-3、Bax表達(dá)、降低MDA含量[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),LRG干預(yù)能夠顯著抑制T2DM大鼠心肌炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,同時減少細(xì)胞凋亡,提示LRG通過調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡發(fā)揮心血管保護(hù)作用。

自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)特有的分解代謝途徑,通過溶酶體將受損的細(xì)胞器、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等進(jìn)行降解、再利用,對維持物質(zhì)穩(wěn)態(tài)、能量代謝等起到了重要作用。研究發(fā)現(xiàn),多種心血管疾病(動脈粥樣硬化、心肌肥厚、心衰等)發(fā)生發(fā)展與自噬調(diào)控異常有關(guān)。高血糖、胰島素抵抗、ROS生成增多可通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白(Atg5、Beclin-1等)的表達(dá)導(dǎo)致自噬缺陷,從而加重心肌細(xì)胞損傷。有研究證實,糖尿病小鼠心肌LC3表達(dá)下調(diào),伴有蛋白聚集物增多,表明心肌細(xì)胞自噬水平明顯降低[9]；而上調(diào)自噬水平能夠改善糖尿病引起的心室重構(gòu)和心臟功能障礙,提示調(diào)控和干預(yù)自噬信號具有心血管保護(hù)作用[10-11]。然而,自噬的過度激活導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn),1型糖尿病小鼠表現(xiàn)為心臟自噬水平過度激活,相反降低Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)和自噬活性可減輕高糖引起的心肌損傷,從而改善心功能。由此可知,自噬調(diào)控具有復(fù)雜性,其在DCM發(fā)生發(fā)展中所起的不同作用可能與自噬程度、自噬持續(xù)時間有關(guān)。本研究中我們證實T2DM大鼠心肌自噬水平下調(diào),LRG干預(yù)能夠上調(diào)自噬相關(guān)基因表達(dá),明確了LRG對T2DM大鼠的心臟保護(hù)作用與其促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。然而,自噬的調(diào)控涉及胞內(nèi)多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

AMPK/mTOR是調(diào)控細(xì)胞生長、能量代謝和自噬的關(guān)鍵通路,應(yīng)激狀態(tài)或耗能增加導(dǎo)致AMPK激活,后者可通過TSC2的活化轉(zhuǎn)而抑制mTOR活性,從而促進(jìn)自噬[13-14]。Yang等[15]采用二甲雙胍干預(yù)糖尿病小鼠和高糖培養(yǎng)的新生小鼠心肌細(xì)胞,結(jié)果顯示二甲雙胍通過上調(diào)AMPK/mTOR信號介導(dǎo)的自噬抑制NLRP3炎癥小體活化和細(xì)胞焦亡,從而改善糖尿病小鼠心肌肥厚和纖維化。Wu等[16]研究指出,Vaspin減輕糖尿病心肌損傷與其上調(diào)AMPK/mTOR/p70S6K信號通路,增強(qiáng)心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。然而,LRG能否激活A(yù)MPK/mTOR自噬信號發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用呢？既往體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),LRG可通過調(diào)控AMPK途徑或mTOR/ULK1介導(dǎo)的自噬途徑緩解高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷[17-18]。但目前尚缺乏體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證LRG對糖尿病心肌AMPK/mTOR通路的作用。本研究發(fā)現(xiàn),LRG處理能夠上調(diào)T2DM大鼠心肌p-AMPK/AMPK表達(dá),下調(diào)p-mTOR/mTOR表達(dá),給予AMPK抑制劑Compound C可逆轉(zhuǎn)LRG對AMPK/mTOR通路的作用,明確了LRG對AMPK/mTOR通路的促進(jìn)作用。同樣,AMPK抑制劑Compound C能夠抵消LRG對T2DM大鼠心肌炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的改善作用,進(jìn)一步證實LRG是通過靶向AMPK/mTOR自噬信號從而改善T2DM大鼠心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷。

臨床研究顯示,LRG具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用,從而改善糖尿病導(dǎo)致的心功能障礙。本研究在動物在體實驗中證實了LRG對糖尿病心肌損傷的保護(hù)作用,機(jī)制與上調(diào)AMPK/mTOR信號增強(qiáng)細(xì)胞自噬,進(jìn)一步減輕心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究結(jié)果初步闡明了LRG在DCM中的作用,進(jìn)一步豐富了糖尿病心肌損傷的發(fā)生機(jī)制。LRG在防治糖尿病心血管并發(fā)癥方面具有一定優(yōu)勢,為未來利用LRG改善糖尿病患者心肌損傷,延緩DCM發(fā)生發(fā)展及改善患者預(yù)后具有重要意義。