TEM8在卵巢癌血管生成和侵襲遷移中的分子機(jī)制研究

張貴媛 羅翠華 李林株 吳玉燕 周素華

卵巢癌是我國(guó)較為常見女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，卵巢癌其發(fā)病原因可能與致癌物質(zhì)、自身免疫情況、體內(nèi)激素水平、遺傳、環(huán)境等多因素有關(guān)，其發(fā)病率與死亡率均處于較高水平[1]。且在一些流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)中，經(jīng)手術(shù)及化療、放療治療后患者5年生存期仍不足30%[2]，因此國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者也一直在積極尋找新的治療策略。其原因不僅是缺乏有效的治療手段，同時(shí)也是由于癌細(xì)胞的侵襲、遷移及造成大量腫瘤血管生成有關(guān)[3]。近些年來(lái)影響腫瘤血管生成已成為癌癥治療新的方向[4]。與VEGF不同，TEM8是一個(gè)在癌相關(guān)細(xì)胞中表達(dá)且在正常血管組織中未進(jìn)行表達(dá)的因子[5]，因此本研究旨在通過(guò)建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，探究TEM8在卵巢癌血管生成和侵襲遷移中的分子機(jī)制，具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

SPF級(jí)BALB/C裸鼠20只，由江蘇艾菱菲生物科技有限公司提供。按隨機(jī)原則將裸鼠分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，每組10只。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）為BALB/C雌性裸鼠；（2）體質(zhì)量為（20±3）g。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞5周或＜4周。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 TRIzol Reagent總 RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)英杰公司；PCR基因引物合成購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；Transwell小室（0.4 μm）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；siRNA-TEM8購(gòu)自北京華泰生物科技有限公司；BD Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京博蕾德生物科技有限公司；青霉素－鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Signa Alderich生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含1%青霉素、鏈霉素與10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在5% CO2、37 ℃恒溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代，其中部分細(xì)胞經(jīng)siRNA-TEM8轉(zhuǎn)染。

1.2.3 癌組織體積及重量 采用標(biāo)準(zhǔn)飼料與飲用水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度保持在（25±2）℃，相對(duì)濕度保持在（40±2）%?？偣策M(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組分別向裸鼠腋窩中部外側(cè)皮下接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常HUVEC細(xì)胞與沉默TEM8的HUVEC細(xì)胞100 μl建立卵巢癌皮下移植瘤模型，接種完成后繼續(xù)飼養(yǎng)14 d。飼養(yǎng)過(guò)程中對(duì)照組死亡2只，剔除；實(shí)驗(yàn)組有2只裸鼠未成瘤，剔除；最終每組選取8只動(dòng)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。待模型建立完成2周后處死裸鼠，通過(guò)游標(biāo)卡尺測(cè)量模型建立后各時(shí)期的腫瘤體積，隨后處死裸鼠并分離皮下卵巢癌腫瘤組織并稱重，根據(jù)組織腫瘤計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=[（對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time PCR） 將兩組卵巢癌組織分別置于液氮中磨碎，加入適量TRIzol試劑，通過(guò)勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理，隨后進(jìn)行分層、沉淀、清洗及溶解等步驟制得RNA備用。隨后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒與TEM8、VEGF及CD34上下游引物混合離心，隨后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號(hào)值（Ct值）進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物信息（5’-3’）：TEM8上游引物TGCTGCACCACTGGAATGAAATC，下游引物CTCCTCCTGGCAGAACTTTCTGG；VEGF上游引物TCGAGACCCTGGTGGACATC，下游引 物 CACACAGGACGGCTTGAAGA；CD34上 游引物TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC，下游引物AGTAAGGAGGAGGGGGAGAC；β-actin上游引物TCAGGTCATCACTATCGGCAAT；下游引物AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA。

1.2.5 血管生成實(shí)驗(yàn) 將BD Matrigel基質(zhì)膠提前1 d放入4 ℃冰箱過(guò)夜，使其復(fù)溶成液態(tài)，次日取出膠體以 1 200 r/min 離心 5 min。離心后加入 6 孔板，在37 ℃恒溫箱放置45 min。隨后將經(jīng)過(guò)處理的兩組細(xì)胞分別消化成細(xì)胞懸液后加入孔中，每孔200 ml，重復(fù)3孔，靜置一定時(shí)間，使所有細(xì)胞都沉淀至BD Matrigel基質(zhì)膠表面后放入37℃恒溫箱中孵育12 h，結(jié)束后通過(guò)顯微鏡觀察血管生成情況。

1.2.6 Transwell試驗(yàn) 將Transwell小室的上室中加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基并培養(yǎng)1 h使膜層親水，隨后棄去培養(yǎng)基，上室加入200 μl的HUVEC細(xì)胞懸液，隨后向下室按分組加入含有不同成分的培養(yǎng)基，每組設(shè)置5組復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中放置過(guò)夜。次日取出小室，用PBS清洗2次，加入濃度為5%的多聚甲醛在4 ℃條件下進(jìn)行固定，隨后再次使用PBS清洗2次，加入0.1%結(jié)晶紫室溫條件下開始染色，放置5 min后于顯微鏡下觀察聚碳酸酯膜表面上下左右和中間5個(gè)視野范圍的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，然后計(jì)算出每個(gè)視野范圍內(nèi)的平均值作為各組細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組腫瘤組織體積與重量比較

在建立模型2周內(nèi)，可見實(shí)驗(yàn)組裸鼠各時(shí)間點(diǎn)卵巢癌腫瘤體積均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、表1。模型建立2周后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤平均重量為（0.185±0.021）g，明顯低于對(duì)照組的（0.317±0.032）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其抑瘤率為（41.38±0.54）%。

圖1 各時(shí)間點(diǎn)兩組裸鼠卵巢癌腫瘤體積生長(zhǎng)曲線

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)裸鼠卵巢癌腫瘤體積比較[mm3，（±s）]

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)裸鼠卵巢癌腫瘤體積比較[mm3，（±s）]

組別 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d對(duì)照組（n=8） 128.6±5.5 138.1±6.4 169.2±6.5 190.2±13.7 201.6±16.3 236.9±12.1 255.8±29.8實(shí)驗(yàn)組（n=8） 119.3±4.2 113.5±6.7 129.0±9.8 143.9±8.4 150.7±18.5 167.3±16.6 172.4±20.6 t值 4.250 8.396 10.810 3.977 6.528 10.714 7.280 P值 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組卵巢癌組織中TEM8、VEGF及CD34水平比較

RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)TEM8沉默后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠卵巢癌組織中TEM8、VEGF與CD34水平均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組卵巢癌組織中TEM8、VEGF與CD34水平比較（±s）

表2 兩組卵巢癌組織中TEM8、VEGF與CD34水平比較（±s）

組別 TEM8 VEGF CD34對(duì)照組（n=8） 1.325±0.172 1.084±0.098 1.129±0.092實(shí)驗(yàn)組（n=8） 0.147±0.030 0.573±0.026 0.730±0.035 t值 19.083 14.255 11.465 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 兩組HUVEC細(xì)胞腫瘤血管生成比較

血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)處理的HUVEC細(xì)胞在BD Matrigel基質(zhì)膠中孵育后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)生成數(shù)量（22.5±4.4），明顯少于對(duì)照組的（53.7±8.2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.483，P＜0.05），見圖 2。

圖2 兩組細(xì)胞血管生成情況（×200）

2.4 兩組卵巢癌HUVEC細(xì)胞遷移與侵襲能力

Transwell結(jié)果顯示，沉默TEM8后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率為（12.5±2.3）%，與對(duì)照組細(xì)胞遷移率（32.7±6.2）%相比明顯較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.640，P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌細(xì)胞發(fā)生惡性增殖轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素、多機(jī)制參與的過(guò)程，這與細(xì)胞侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)[6]。卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率第三、死亡率第一的惡性腫瘤而受到廣大關(guān)注，通常情況下患者的5年生存率不超過(guò)45%。近些年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的腫瘤治療方法從基礎(chǔ)研究發(fā)展成為臨床療法。其中手術(shù)治療聯(lián)合化療作為傳統(tǒng)的卵巢癌臨床治療技術(shù)雖然已經(jīng)較為成熟，由于癥狀出現(xiàn)時(shí)往往是疾病的中晚期，因此卵巢癌的治療效果往往受到易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、新生血管生成等特點(diǎn)所產(chǎn)生的不良影響[7]，因此開發(fā)出新型的抗卵巢癌藥物，從靶點(diǎn)阻止卵巢癌血管生成與侵襲遷移是一種較為可行的辦法。

血管生成是指從現(xiàn)有的毛細(xì)血管生成新的血管的過(guò)程，血管生成是非常復(fù)雜而又重要的生物學(xué)過(guò)程，它是很多生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，包括血管的發(fā)展、再生和修復(fù)等。血管生成是機(jī)體發(fā)育的正常現(xiàn)象，但在腫瘤組織中，新生血管的生成往往與腫瘤發(fā)展具有緊密的聯(lián)系[8]。與正常的新生血管不同，腫瘤新生血管往往不具備完整的結(jié)構(gòu)，是由血管盲端與體內(nèi)動(dòng)靜脈短路形成，并會(huì)使血管壁通透性增強(qiáng)，向腫瘤組織延伸。且腫瘤組織新生血管雖然尤為密集，但缺少組織供氧，這些微環(huán)境的變化會(huì)繼而引起癌細(xì)胞的侵襲與遷移。

在一些研究中，新生腫瘤血管生成后會(huì)引起腫瘤組織加速增長(zhǎng)，且發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率隨著腫瘤血管的增加而增加，因此抑制腫瘤血管生成或許能夠作為腫瘤治療的新的方向[9]。目前VEGF是國(guó)內(nèi)外研究腫瘤血管生成的重要靶點(diǎn)[10]，與在血管中表達(dá)的VEGF及與在新生血管內(nèi)高表達(dá)的CD34不同[11-12]，TEM8是近些年來(lái)被發(fā)現(xiàn)僅僅表達(dá)于腫瘤相關(guān)血管中的因子，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，能夠與細(xì)胞骨架蛋白相互作用從而介導(dǎo)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)如增殖、遷移及血管的生成，且在一些研究中發(fā)現(xiàn)TEM8在卵巢癌組織中高表達(dá)[13]。在本研究中，筆者通過(guò)沉默卵巢癌HUVEC細(xì)胞中的TEM8，觀察其表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，沉默TEM8不僅能夠抑制腫瘤發(fā)展的速度與程度，同時(shí)能夠降低裸鼠卵巢癌組織中血管生成相關(guān)因子VEGF及CD34的表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣說(shuō)明，沉默TEM8后卵巢癌HUVEC細(xì)胞的血管生成及遷移侵襲能力受到了明顯的抑制。

綜上所述，在本研究中卵巢癌組織中TEM8表現(xiàn)出的高表達(dá)水平提示TEM8或許擁有作為卵巢癌的治療靶點(diǎn)的潛力，此外低水平的TEM8能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的血管生成與侵襲遷移能力，進(jìn)一步說(shuō)明了TEM8可能以促腫瘤因子的身份作為卵巢癌的治療靶點(diǎn)。本研究為卵巢癌的分子靶向治療提供了一定依據(jù)。