多花黃精須根營養(yǎng)成分及抗氧化活性研究

高海燕，余歡迎，金傳山*，許鳳清，劉軍玲，柳春風，李雷（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，合肥 230012；2.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點實驗室，合肥 230012；3.安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥 23001；.金寨潤元生物科技有限公司，安徽 六安 237300；.金寨森灃農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，安徽 六安 237000）

《中國藥典》2020年版規(guī)定黃精為百合科黃精屬黃精（

Polygonatum

sibiricum

）、滇黃精（

Polygonatum kingianum

）和多花黃精（

Polygonatum cyrtonema

）的干燥根莖，味甘、性平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效，用于脾胃氣虛、體倦乏力、肺虛燥咳、精血不足、須發(fā)早白等。研究表明，黃精的主要化學成分為甾體皂苷類、多糖類、黃酮類、生物堿、木脂素以及多種對人體有用的氨基酸等化合物，藥理作用包括抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲勞等。其中氨基酸是黃精補益強壯作用和增強免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，可作為疾病防治過程中減輕藥物毒副作用的補充替代品。目前，多花黃精以根莖入藥，其研究也集中于根莖的炮制加工、活性成分提取及藥理藥效等方面，而須根在采收產(chǎn)地加工過程中常作為雜質(zhì)除去。據(jù)統(tǒng)計，多花黃精須根約占根莖總重量的10%，有研究表明黃精須根和根莖中的成分基本相同，含多糖、氨基酸、微量元素等，所以有望作為新資源進行開發(fā)和利用。王天梅等測定多花黃精根、莖、葉、花和嫩芽5 個部位提取液的DPPH 自由基、羥基自由基以及亞硝酸鹽的清除率，結(jié)果表明，提取物的抗氧化能力為葉＞嫩芽＞花＞根。周東月等采用水提醇沉法提取黃精中的多糖類化合物，并探討黃精多糖的抗氧化活性，結(jié)果表明，黃精多糖具有較好的還原能力以及清除DPPH 自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力。本實驗以多花黃精須根為研究對象，測定其浸出物、多糖和氨基酸含量，且采用同一提取方式對多花黃精須根的醇溶性成分進行提取，對其不同極性部位的體外抗氧化活性進行測定分析，為合理利用須根資源提供了理論依據(jù)。

1 材料

L-8800 全自動氨基酸分析儀（日本日立公司）；FD240 電熱恒溫干燥箱（德國Binder 公司）；UV-2700 紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Multiskan spectrum 全波長酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；ML204 萬分之一分析天平（瑞士Mettle-Toledo 公司）；XMTE-205數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；Simplicity-185 超純水儀（美國默克密理博公司）。

多花黃精由安徽金寨潤元生物科技有限公司提供，9 批分別采集于金寨縣鄉(xiāng)村：張沖鄉(xiāng)（XG1）、油坊店鄉(xiāng)（XG2）、花石鄉(xiāng)大灣村（XG3）、花石鄉(xiāng)花石村（XG4）、長嶺鄉(xiāng)（XG5）、槐樹灣鄉(xiāng)（XG6）、桃?guī)X鄉(xiāng)桃?guī)X村（XG7）、桃?guī)X鄉(xiāng)牌坊村（XG8）、沙河鄉(xiāng)（XG9），由安徽中醫(yī)藥大學藥學院劉守金教授鑒定為百合科植物多花黃精的帶須根莖，除去泥土，洗凈，蒸至透心，干燥，收集黃精根莖以及須根。氨基酸混合標準溶液（日本日立公司），DPPH、ABTS 和抗壞血酸（阿拉丁試劑有限公司）；

D

-無水葡萄糖（純度：98%，上海源葉生物科技有限公司）；水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 浸出物含量測定

按照2020年版《中國藥典》中醇溶性浸出物法（通則2201）項下的熱浸法測定，重復實驗3次，取平均值。

2.2 多糖含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取

D

-無水葡萄糖對照品適量，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 中含無水葡萄糖0.3316 mg 的對照品溶液。2.2.2 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于10 mL 具塞刻度試管中，各加水至2.0 mL，搖勻，在冰浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應試劑為空白。照紫外-可見分光度法（通則0401），在582 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，

Y

＝3.360

X

＋0.2165，

R

＝0.9994，線性范圍為0.0332 ～0.1990 mg·mL。

2.3 氨基酸含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 分別精密移取17 種氨基酸對照品適量，用0.02 mol·L鹽酸溶解至一定濃度（胱氨酸為1.25

μmol·mL，其他氨基酸均為2.50

μmol·mL）作為母液備用。取適量母液，按一定梯度比例稀釋，采用自動在線衍生化方法進行衍生化檢測。

2.3.2 供試品溶液的制備 取須根樣品粉末0.1 g，精密稱定，置10 mL 頂空瓶中，精密加入濃鹽酸和水各2 mL，封口，將頂空瓶放入150℃恒溫干燥箱中，水解1 h，冷卻，移入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣加0.02 mol·L鹽酸溶液定容至50 mL 量瓶中，搖勻，過0.22 μm 水相微孔濾膜，即得。

2.3.3 氨基酸自動分析儀分析條件 色譜柱：INCH 離子交換柱（4.6 mm×60 mm）； 柱溫57 ℃；衍生反應器溫度135℃；檢測波長：脯氨酸440 nm，其他氨基酸570 nm；進樣量20 μL；緩沖液流速0.400 mL·min；緩沖液泵壓0 ～30 MPa；茚三酮流速0.350 mL·min；茚三酮泵壓0 ～3.5 MPa；緩沖液改變次數(shù)6 次；分析時間53 min，取混合氨基酸對照品溶液和樣品溶液各20 μL 注入氨基酸自動分析儀，記錄各氨基酸的峰面積，按照外標法計算含量。

2.4 體外抗氧化活性

2.4.1 樣品的制備 醇提物制備：參照文獻并稍作改動。稱取須根粉末200 g，加10 倍量50%乙醇水浸泡1 h 后，加熱回流提取3 次，每次2 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，冷凍干燥。不同極性萃取部位的制備：取醇提物，加入100 mL 溫水溶解，依次用等體積的乙酸乙酯、正丁醇溶液分別萃取3 次，減壓回收溶劑，得到各萃取部位，稱重。分別精密稱取須根的乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位、剩余水部位以及醇提物，加蒸餾水溶解，制得1.0 mg·mL的樣品溶液；將陽性對照品維生素C 配制成1.0 mg·mL的溶液，避光冷藏。依次將樣品和維生素C 對照品稀釋成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL6 個質(zhì)量濃度。

2.4.2 DPPH 自由基清除率測定 參照文獻的方法，并作適當改動。取不同濃度的樣品溶液1.0 mL 與2.0 mL 0.2 mmol·L的DPPH 溶液混合，充分振蕩，室溫暗處反應30 min，在517 nm波長下測定吸光度，記為

A

，平行重復3 次。以蒸餾水代替樣品作為空白對照（

A

），以蒸餾水代替反應液記為

A

，以維生素C 作為陽性對照，計算公式（1）如下：

2.4.3 ABTS自由基清除能力的測定將7 mmol·LABTS 溶液與2.45 mmol·L過硫酸銨混合避光氧化12 h，用PBS 稀釋ABTS 混合液，在734 nm 波長下測定吸光度值為（0.80±0.02）。取不同部位的樣品溶液及維生素C 對照品1 mL 與2 mL ABTS 混合液混合，室溫放置6 min，在734 nm 波長下測吸光度值，重復3 次。按公式（1）計算清除率。

2.5 統(tǒng)計學處理方法

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0 繪圖和SPSS 25.0 軟件進行處理，均為3 次重復測定結(jié)果的平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 多花黃精須根成分含量

多花黃精須根的浸出物、多糖含量見表1。須根浸出物含量在42.48%～ 55.76%，平均值為49.26%，約為文獻報道中黃精浸出物的66.7%。黃精藥用價值和營養(yǎng)保健主要集中在多糖含量上，而須根的多糖含量為7.12%～9.36%，與文獻報道的黃精多糖含量相近。

表1 多花黃精須根含量分析結(jié)果(%)
Tab 1 Content of fibrous root ofHua (%)

樣品浸出物多糖XG145.069.36 XG242.488.43 XG345.467.12 XG455.768.16 XG549.358.42 XG652.198.63 XG754.088.67 XG849.858.90 XG949.088.34均值49.268.45

3.2 氨基酸組成分析

從多花黃精須根中鑒定出17 種氨基酸成分，結(jié)果見表2。須根氨基酸總量（TAA）為6.09%～10.43%，平均值為8.08%。其中，谷氨酸含量最高，為1.49%～2.44%，平均含量為1.86%；其次為精氨酸、門冬氨酸，平均含量分別為1.04%、0.80%。

表2 多花黃精須根中氨基酸組成和含量(%)
Tab 2 Amino acid in fibrous root of Hua (%)

注：為必需氨基酸。
Note： means essential amino acid.

種類產(chǎn)地門冬氨酸（Asp）蘇氨酸*（Thr）絲氨酸（Ser）谷氨酸（Glu）甘氨酸（Gly）丙氨酸（Ala）胱氨酸（Cys）纈氨酸*（Val）甲硫氨酸*（Met）異亮氨酸*（Ile）亮氨酸*（Leu）酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸*（Phe）賴氨酸*（Lys）組氨酸（His）精氨酸（Arg）脯氨酸（Pro）TAA EAA NAAEAA/TAA XG1 0.92 0.34 0.55 2.11 0.39 0.52 1.02 0.40 0.08 0.29 0.55 0.33 0.32 0.61 0.24 1.23 0.52 10.43 2.59 7.83 24.86 XG2 1.01 0.36 0.59 2.10 0.40 0.53 0.65 0.39 0.08 0.28 0.55 0.34 0.32 0.59 0.24 1.10 0.54 10.07 2.57 7.50 25.52 XG3 0.91 0.31 0.49 1.79 0.34 0.46 0.57 0.24 0.08 0.15 0.4 0.25 0.29 0.45 0.19 1.01 0.45 8.38 1.92 6.46 22.91 XG4 0.94 0.34 0.55 2.44 0.33 0.46 0.64 0.29 0.07 0.20 0.44 0.29 0.27 0.50 0.20 1.36 0.44 9.76 2.11 7.65 21.62 XG5 0.82 0.36 0.44 1.98 0.29 0.42 0.56 0.21 0.05 0.12 0.34 0.25 0.28 0.36 0.15 1.11 0.36 8.10 1.72 6.38 21.23 XG6 0.70 0.44 0.35 1.82 0.26 0.37 0.44 0.16 0.04 0.08 0.24 0.20 0.29 0.27 0.12 0.98 0.24 7.00 1.52 5.48 21.71 XG7 0.64 0.31 0.30 1.49 0.25 0.34 0.52 0.15 0.04 0.08 0.24 0.19 0.28 0.26 0.11 0.93 0.25 6.38 1.36 5.02 21.32 XG8 0.68 0.33 0.32 1.50 0.26 0.37 0.47 0.16 0.04 0.08 0.25 0.23 0.30 0.27 0.11 0.88 0.27 6.52 1.43 5.09 21.93 XG9 0.60 0.12 0.29 1.55 0.25 0.36 0.62 0.16 0.04 0.08 0.23 0.17 0.27 0.25 0.09 0.78 0.24 6.09 1.15 4.95 18.85均值 0.80 0.32 0.43 1.86 0.31 0.43 0.61 0.24 0.06 0.15 0.36 0.25 0.29 0.40 0.16 1.04 0.37 8.08 1.82 6.26 22.52

相對于植物，人類和動物均需要通過食物蛋白來攝取某些氨基酸，這些人體中無法合成的氨基酸稱為必需氨基酸（EAA），多花黃精須根中檢測出EAA 7 個，非必需氨基酸（NAA）10 個。須根EAA 質(zhì)量分數(shù)在1.15%～2.59%，平均值為1.82%，其中XG9 中EAA 質(zhì)量分數(shù)最小，XG1 質(zhì)量分數(shù)最高。根據(jù)世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織（WHO/FAO）頒布的理想蛋白質(zhì)必需氨基酸模式譜，EAA/TAA 的標準比值為40%，須根中EAA/TAA 的比值范圍為18.85%～25.52%，與WHO/FAO 氨基酸標準值40%有一定差距。

3.3 自由基清除能力

3.3.1 DPPH 自由基的清除能力 結(jié)果顯示多花黃精須根各極性萃取部位能良好地清除DPPH 自由基，且存在量效關(guān)系。須根各極性萃取相清除能力由大到小依次為乙酸乙酯相＞醇提物＞水相＞正丁醇相（見表3 及圖1）。

圖1 多花黃精須根不同極性部位對DPPH 自由基清除能力Fig 1 In vitro antioxidant activities of Polygonatum cyrtonema Hua’s different polar extracts evaluated by the DPPH radicals scavenging abilities

3.3.2 ABTS自由基的清除能力 結(jié)果顯示，須根各極性萃取相清除能力由大到小依次為乙酸乙酯相＞水相＞醇提物＞正丁醇相。在質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL時，不同極性萃取部位中乙酸乙酯相清除能力最強，清除率達到97.86%，其

IC

值為0.59 mg·mL（見表3 及圖2）。

圖2 多花黃精須根不同極性部位對ABTS 陽離子自由基清除能力Fig 2 In vitro antioxidant activities of Polygonatum cyrtonema Hua’s different polar extracts evaluated by the ABTS radicals scavenging abilities

表3 不同極性萃取部位抗氧化活性
Tab 3 Antioxidant activity of extracts with different polarity

部位DPPH 自由基/（mg·mL－1）ABTS＋自由基/（mg·mL－1）乙酸乙酯相0.780.59正丁醇相0.920.75水相0.860.62醇提物0.820.68

3.3.3 醇提物抗氧化活性與多糖含量的相關(guān)性 采用SPSS 25.0 軟件對醇提物中多糖含量與DPPH 自由基清除率和ABTS自由基清除率進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，多糖含量與DPPH 自由基清除率顯著相關(guān)（

P

＝0.005）；多糖含量與ABTS自由基清除率顯著相關(guān)（

P

＝0.002）。

4 討論與結(jié)論

多花黃精須根中含有豐富的多糖、氨基酸等，其中浸出物含量為42.48%～55.76%；多糖含量為7.12%～9.36%；須根中鑒定出17 種氨基酸，總氨基酸含量為6.09%～10.43%，而谷氨酸含量最高，為1.49%～2.44%，該結(jié)果與王曙東等研究黃精根莖及須根的氨基酸分析結(jié)果一致。雖然須根中EAA/TAA 的比值范圍為18.85%～25.52%，與WHO/FAO 氨基酸標準值40%有一定差距，但是WHO/FAO 規(guī)定的標準并非針對植物蛋白，目前研究表明完全符合此標準的植物蛋白并不多，如木芙蓉花為22.33%～37.51%，蝶豆花為34.91%，重樓為26.12%～41.08%。黃精多糖具有調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化等重要功能，夏曉凱等探討黃精多糖的體內(nèi)外抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)黃精多糖的體外能抑制自發(fā)的和誘導的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量，王愛梅等的研究表明黃精一方面可以抑制大腦里氧自由基的生成，另一方面可以強化大腦對氧自由基清除的力度，發(fā)揮抗氧化作用。氨基酸是黃精補益作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，谷氨酸作為一種功能性氨基酸，不僅參與蛋白質(zhì)的合成和氧化功能，而且具有改善腸道完整性、增強腸道屏障功能和抗氧化能力。纈氨酸治療腎功能衰竭、敗血癥及加快外科創(chuàng)傷愈合；亮氨酸可降低血糖，緩解肥胖、代謝綜合征，調(diào)節(jié)機體免疫等。本研究表明須根具有較強的抗氧化活性，與須根多糖含量明顯相關(guān)。不同極性萃取相在抗氧化檢測中均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性，且存在一定的量效關(guān)系。乙酸乙酯相清除DPPH自由基能力和ABTS自由基能力最強，

IC

值分別為0.78 mg·mL和0.59 mg·mL，不同極性萃取部位抗氧化能力趨勢一致，但是結(jié)果差別較大，表明多花黃精須根不同極性部位的抗氧化活性存在差異，其原因可能與不同極性部位中主要活性成分的含量不同有關(guān)。

目前使用的中藥材往往取自植物的某一部分，其余非藥用部分常作為廢料而丟棄，這不僅不利于中藥資源的綜合利用，還造成了資源浪費和環(huán)境污染。有研究表明，藥用植物的非藥用部位具有與傳統(tǒng)藥用部位相同或相近的化學成分及作用，尤其是抗氧化活性。本研究發(fā)現(xiàn)，多花黃精須根的提取物具有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力與濃度有關(guān)，因此，后續(xù)可從優(yōu)化提取活性成分的角度，將多花黃精須根作為試樣，進行進一步提取工藝考察，可為多花黃精須根資源再利用提供理論依據(jù)。