山楂、烏梅、葡萄皮、枸杞、桑葚復(fù)方組合物的體內(nèi)降血脂作用

李 瑩，吳莎莎，曹璨，徐建文，劉影

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，黑龍江哈爾濱 150001）

血脂異常（Dyslipidemias），又稱高脂血癥，是指血漿中的脂質(zhì)成分和含量發(fā)生改變的一種代謝性疾病。通常表現(xiàn)為血清總膽固醇（TC）和（或）甘油三酯（TG）升高，也包括高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低或低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高。2018 年發(fā)表的中國(guó)慢性病及危險(xiǎn)因素監(jiān)測(cè)研究顯示，中國(guó)18 歲以上成人中高總膽固醇、高甘油三酯、低HDLC、高LDL-C 患病率分別達(dá)到了6.9%、13.8%、20.4%、8.1%。目前臨床上大多采用西藥治療，其療效快，但易產(chǎn)生惡心、腹脹等不良反應(yīng)，長(zhǎng)期使用還會(huì)造成肝腎損傷。因此，開(kāi)發(fā)更加安全無(wú)毒副作用的降脂產(chǎn)品逐漸成為新的趨勢(shì)。

山楂是我國(guó)特有的藥果兼用樹(shù)種，運(yùn)用高通量代謝組學(xué)的技術(shù)，Hu 等對(duì)高脂血癥大鼠脂肪組織的代謝變化進(jìn)行了非靶向分析，發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)高脂飲食時(shí)許多內(nèi)源性分子發(fā)生改變，而在山楂提取物干預(yù)后恢復(fù)；烏梅作為一種傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，其葉提取物可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清TG 水平；葡萄皮中含有白藜蘆醇、單寧、花青素等物質(zhì)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酶活性、增加抗氧化能力、減少過(guò)渡金屬以及自由基來(lái)改善血脂異常；枸杞中的枸杞多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)大鼠的腎臟損傷及脂質(zhì)沉淀具有保護(hù)作用，其果實(shí)中的花青素可以通過(guò)改善小鼠的炎癥和氧化應(yīng)激水平來(lái)改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗；桑葚提取物可以通過(guò)調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)來(lái)減輕內(nèi)皮功能障礙，從而改善血脂異常。同時(shí)以上食物或藥物均屬于入藥典的食藥兼用品或食物，安全無(wú)毒，適合長(zhǎng)期服用。目前，國(guó)內(nèi)以山楂、烏梅、葡萄皮、枸杞、桑葚為復(fù)合原料的保健食品的研究尚未報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)山楂、烏梅、葡萄皮等食物或藥物進(jìn)行科學(xué)組方，制備出一種具有輔助降血脂功能保健食品，并通過(guò)建立血脂異常大鼠模型，探究該組合物調(diào)節(jié)血脂的作用，以期提供一種更為安全，無(wú)毒副作用的調(diào)節(jié)血脂的新思路，并為其使用提供初步指導(dǎo)，進(jìn)一步為新型降脂保健食品的開(kāi)發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠 50 只，體重200±20 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001；在SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（屏障環(huán)境）飼養(yǎng)（許可證號(hào)：SYXK（黑）2011007），溫度21～23 ℃，濕度55%～58%；試驗(yàn)動(dòng)物所用的清潔級(jí)飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0012）；其中維持飼料配方：粗蛋白≥18%，粗脂肪≥4%，粗纖維≤5%，粗灰分≤8%，鈣1.0%～1.8%，總磷0.6%～1.2%，水分≤10%；模型飼料配方：在維持飼料中添加20%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等，除了粗脂肪外，模型飼料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、鈣：磷均要達(dá)到維持飼料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；山楂、烏梅、葡萄皮、枸杞、桑葚 哈爾濱世一堂藥店。

動(dòng)物天平、電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；Allegra64R 低溫高速離心機(jī) Beckman 公司；550 nm 酶標(biāo)儀 BIO-RAD 公司；電熱恒溫水浴鍋上海精宏醫(yī)療器械廠；TC、TG、LDL-C、HDL-C 試劑盒及脂蛋白脂肪酶、肝脂酶盒 北京中生生物工程高技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 受試樣品制備及劑量設(shè)計(jì) 取山楂40 重量份、烏梅40 重量份、葡萄皮30 重量份、枸杞30 重量份、桑葚20 重量份，此復(fù)方的配制比例根據(jù)本研究團(tuán)隊(duì)前期配方優(yōu)化研究確定。將各原料清洗去雜，60 ℃下干燥5 h，干燥后磨粉，過(guò)4 號(hào)篩混合均勻，輻照殺菌即得，得到的受試物為棕色粉末。感官檢查依據(jù)GB 16740-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 保健食品》，取適量受試物置于白色瓷盤中，在自然光下觀察色澤和狀態(tài)，嗅其氣味，用溫開(kāi)水漱口，品其滋味，未見(jiàn)異常。分別以人體每日推薦劑量（0.05 g/kg·BW）的30 倍、10 倍、5 倍為高劑量組（1.5 g/kg·BW）、中劑量組（0.5 g/kg·BW）和低劑量組（0.25 g/kg·BW）。

取150 g 受試物粉末，加蒸餾水至1000 mL，配成0.15 g/mL 的溶液，用于高劑量組給藥；取50 g 受試物粉末，加蒸餾水至1000 mL，配成0.05 g/mL 的溶液，用于中劑量組給藥；取25 g 受試物粉末，加蒸餾水至1000 mL，配成0.025 g/mL 的溶液，用于低劑量組給藥。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 屏障系統(tǒng)下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分成2 組，10 只大鼠給予維持飼料作為空白對(duì)照組，40 只給予模型飼料作為模型組。每周稱量體重1 次。模型組給予模型飼料2 周后，空白對(duì)照組和模型組大鼠不禁食采血（尾部），采血后盡快分離血清，測(cè)定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。根據(jù)TC、TG 水平將模型組40 只動(dòng)物隨機(jī)分成4 組，即高、中、低劑量組（1.5、0.5、0.25 g/kg·BW）和模型對(duì)照組，每組10 只。分組后3 個(gè)劑量組每天按照10 mL/kg·BW 經(jīng)口給予受試樣品，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組同時(shí)給予同體積的蒸餾水；空白對(duì)照組繼續(xù)給予維持飼料，模型對(duì)照組及三個(gè)劑量組繼續(xù)給予模型飼料。動(dòng)物自由攝食及飲水，每周記錄動(dòng)物體重。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 連續(xù)灌胃30 d 后，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)不禁食采血，采血后盡快分離血清，按照試劑盒操作步驟，測(cè)定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平。采血后處死，立即取出并稱重肝組織，測(cè)定肝臟系數(shù)。取部分肝組織勻漿，按照試劑盒操作步驟，測(cè)定肝脂肪酶（HL）、脂蛋白脂肪酶（LPL）活性。取肝右葉，10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟脂肪變性程度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間均數(shù)比較進(jìn)行單因素方差分析，組間比較使用LSD 事后檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試物對(duì)大鼠體重的影響

由表1 可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)前及造模后，各劑量組與模型對(duì)照組相比，大鼠體重均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量的受試物給予大鼠灌胃30 d 后，所有組動(dòng)物生長(zhǎng)、活動(dòng)正常，各劑量組動(dòng)物與模型對(duì)照組相比體重?zé)o顯著性差別（>0.05）。

表1 受試物對(duì)大鼠體重的影響（，n=10）Table 1 Influence of the test substance on the body weight of rats (,n=10)

2.2 受試物對(duì)大鼠血清總膽固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的影響

由表2 可見(jiàn)，模型對(duì)照組的血清TC（<0.05）和TG 水平始終高于空白對(duì)照組，說(shuō)明高脂模型是成功的。血清總膽固醇是血液中各脂蛋白所含膽固醇的總和，過(guò)高的TC 是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一；血清TG 升高常見(jiàn)于代謝綜合癥，研究顯示輕度或中度TG 升高會(huì)增加患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量受試物干預(yù)30 d 后，高、中劑量組血清的TC 與模型對(duì)照組相比分別下降了28.27%、16.35%，且差異顯著（<0.05）；高、中劑量組血清TG 與模型對(duì)照組比分別下降了27.91%、15.12%，且差異顯著（<0.05），說(shuō)明該組合物可以起到調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的作用。血液中的TC、TG 需要與載脂蛋白結(jié)合進(jìn)行運(yùn)輸。LDL 是膽固醇含量最高的脂蛋白，同時(shí)也是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的因素；HDL 則被證實(shí)能將外周組織的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行分解代謝，提示了其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。高、中劑量組血清的HDL-C 與模型對(duì)照組相比分別上升了65.72%、41.30%，且差異極顯著（<0.01），高、中劑量組血清的LDL-C 與模型對(duì)照組相比分別下降了40.28%、15.28%，且差異顯著（<0.05），說(shuō)明該組合物可以調(diào)節(jié)血脂并抑制脂質(zhì)的沉積，進(jìn)而降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Han 等通過(guò)給予肝損傷小鼠山楂果皮提取物，發(fā)現(xiàn)其血清TG、TG、LDLC 水平下降，HDL-C 水平上升，Mahmoudi 等也發(fā)現(xiàn)葡萄皮與葡萄籽提取物可以降低TC 水平，提高HDL-C 水平，這也與本文的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果表明，本研究將這些食物或藥物進(jìn)行科學(xué)組方，得到的組合物具有一定的調(diào)節(jié)血脂作用，且各組分均屬于藥食同源的中藥，更兼顧了使用的安全性、規(guī)范性及方便性。

表2 受試物對(duì)大鼠血清總膽固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的影響（，n=10）Table 2 Effects of test substances on serum total cholesterol,serum triglyceride,serum high-density lipoprotein cholesterol and serum low-density lipoprotein cholesterol in rats (,n=10)

2.3 受試物對(duì)大鼠肝臟系數(shù)和肝酯酶（HL）、脂蛋白脂肪酶（LPL）活性的影響

肝臟系數(shù)為肝臟重量與體重的比值，由表3 可見(jiàn)，以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量的受試物給予大鼠灌胃30 d 后，除空白對(duì)照組外，各組肝臟系數(shù)無(wú)明顯差異（>0.05），但各劑量組與模型對(duì)照組相比有一定的下降趨勢(shì)，提示該組合物可能對(duì)于緩解大鼠肝臟脂肪堆積有一定作用。

表3 受試物對(duì)大鼠肝臟系數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effect of test substance on liver coefficient of rats(,n=10)

肝脂肪酶（HL）是一種主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪分解酶，在HDL 代謝中起重要作用。HL 不僅能水解HDL 中的甘油三酯和磷脂，還能刺激肝細(xì)胞對(duì)HDL-C 的攝取。脂蛋白脂肪酶（LPL）則是甘油三酯水解的限速酶，負(fù)責(zé)分解血液中的甘油三酯，同時(shí)還以不同方式促進(jìn)不同組織的脂質(zhì)和能量代謝。HL 及LPL 的活性降低會(huì)導(dǎo)致HDL-C 水平降低以及TG 水平上升，引起高脂血癥。由表4 可見(jiàn)，以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量的受試物給予大鼠灌胃30 d 后，高劑量組的HL、LPL 活性與模型對(duì)照組相比極顯著升高（<0.01），提示該組合物可能通過(guò)提高HL 和LPL 活性加速脂質(zhì)代謝，從而起到調(diào)節(jié)血脂的作用。此外，本研究結(jié)果顯示，該組合物在低、中劑量時(shí)，對(duì)HL 及LPL 活性影響較小，提示其通過(guò)提高酶活性改善血脂代謝的作用可能需要在較為充足的劑量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)。

表4 受試物對(duì)大鼠肝酯酶（HL）和脂蛋白脂肪酶（LPL）活性的影響（，n=10）Table 4 Effects of test substances on rat liver esterase and lipoprotein lipase activities (,n=10)

2.4 受試物對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

由圖1 可見(jiàn)，空白對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞內(nèi)基本無(wú)脂滴分布。模型對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的脂變，且脂滴較大，說(shuō)明高脂模型是成功的，造模大鼠的肝臟內(nèi)存在脂肪堆積現(xiàn)象。而以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量的受試物給予大鼠灌胃30 d 后，與模型對(duì)照組比，高、中劑量組脂滴空泡明顯減少、脂滴泡縮小，低劑量組則略微減輕。肝臟吸收血液中的脂肪酸，并將其酯化為中性脂肪，而肝脂肪變通常是由于脂蛋白合成障礙等原因脂肪運(yùn)輸障礙，或?qū)χ纠孟陆翟斐傻?，因此該結(jié)果提示了組合物具有一定代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪的作用。

圖1 HE 染色各組大鼠肝組織病理形態(tài)（100×）Fig.1 Pathological morphology of rat liver tissues in each group by HE staining (100×)

3 結(jié)論與討論

血脂異常是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，尤其與動(dòng)脈粥樣硬化息息相關(guān)。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2010 年我國(guó)45 歲及以上人群的血脂異?；疾÷蔬_(dá)到了42.84%，但其知曉率、治療率和控制率僅為20.27%、14.41%、4.94%。研究表明，植物性保健食品中含有的許多生物活性成分，如類黃酮、生物堿、多糖、多酚等均具有調(diào)節(jié)血脂的作用。而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中部分中藥屬藥食同源中藥，既具有調(diào)節(jié)血脂的作用，同時(shí)更兼顧了使用的安全性、規(guī)范性及方便性，提示可以將這些藥物用于血脂異常的日常保健及預(yù)防。

本實(shí)驗(yàn)首次將山楂、烏梅、葡萄皮、枸杞、桑葚這些藥物或食物進(jìn)行科學(xué)配比，制備出一種具有輔助降血脂功能保健食品。通過(guò)構(gòu)建高脂大鼠模型，探究該組合物的調(diào)節(jié)血脂作用。研究結(jié)果表明，該組合物能降低高、中劑量組大鼠血清總膽固醇、甘油三酯，低密度脂蛋白膽固醇水平，提高血清高密度脂蛋白膽固醇水平，提高肝酯酶、脂蛋白脂肪酶活性，改善肝細(xì)胞變性，具有調(diào)節(jié)血脂的作用。推測(cè)該組合物輔助調(diào)節(jié)血脂的機(jī)制可能為：該組合物中，山楂、烏梅及葡萄皮主要起到抗氧化的作用，調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激水平，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的血管炎癥，這種作用可能與山楂提取物的主要成分山楂黃酮、葡萄皮中富含的多酚、花青素及烏梅中所含的有機(jī)酸有關(guān)。與本文的研究結(jié)果相似，Shatoor 等發(fā)現(xiàn)，山楂提取物可以通過(guò)抗氧化機(jī)制及調(diào)節(jié)血清氧化低密度脂蛋白的水平；鄧婉婷等研究了烏梅總有機(jī)酸提取物的抗氧化效果，結(jié)果表明其對(duì)DPPH 有較強(qiáng)的清除能力，提示了烏梅的抗氧化的能力；而葡萄皮中富含的多酚可以通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素敏感性和GLUT4 表達(dá)、預(yù)防骨骼肌和脂肪組織中的氧化應(yīng)激來(lái)對(duì)肥胖和高脂飲食引起的相關(guān)代謝紊亂產(chǎn)生有益影響。同時(shí)，組合物中添加了枸杞、桑葚，這兩種組分均具有減輕內(nèi)臟脂質(zhì)堆積的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，枸杞中的枸杞多糖作為一種潛在益生元，可以通過(guò)增加腸道菌群多樣性，尤其是降低了厚壁菌/擬桿菌的比例，改善脂質(zhì)代謝和腸道疾病；桑葚果實(shí)可以防止食欲亢進(jìn)，降低高脂血癥帶來(lái)的體重增加和內(nèi)臟脂肪堆積，降低血清TG 及HDL-C 水平。該組合物中的成分相結(jié)合，從調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平、減輕內(nèi)臟脂質(zhì)堆積等方面共同作用，與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“寒溫并用，消補(bǔ)同施”的理念相符合，共同起到輔助調(diào)節(jié)血脂的作用。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種組合物可以起到輔助調(diào)節(jié)血脂的作用，但其具體機(jī)制尚未明確。同時(shí)該結(jié)果與動(dòng)物模型的造模嚴(yán)重程度及動(dòng)物個(gè)體差異有關(guān)，該組合物在人體中能否發(fā)揮同樣的作用，以及在未來(lái)推廣使用中可能存在的潛在問(wèn)題都有待于進(jìn)一步的研究。綜上所述，本研究結(jié)果提供了一種更為安全無(wú)毒副作用的調(diào)節(jié)血脂新思路，并為其使用提供初步指導(dǎo)，進(jìn)一步為新型降脂保健食品的開(kāi)發(fā)提供支持。