植物源性降壓肽作用機制、制備與評價方式及相關(guān)研究進展

朱澤洋，李熔，袁字怡，薛勇,

（1.國家糧食產(chǎn)業(yè)（青稞深加工）技術(shù)創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.國家果蔬工程技術(shù)加工中心，中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

據(jù)《中國心血管健康與疾病報告2020》顯示，我國成人高血壓患者已達2.45 億，其中超半數(shù)合并血脂異常，使得其患心血管疾病風險顯著增加。高血壓主要依靠藥物控制、飲食調(diào)控等來治療或緩解。植物性食物中含有豐富的功能成分且安全性較高，能否從中獲取降壓組分是當前食品領(lǐng)域研究的熱點。生物活性肽又稱功能性多肽，是一種相對分子質(zhì)量小于6000 且具有多種生理功能的化合物。近年來，研究發(fā)現(xiàn)以食源性蛋白為原料制備的活性肽具有一系列健康功效，包括降壓、抗氧化、降糖、抗凝、抗血栓、抗炎、降膽固醇和免疫調(diào)節(jié)等。目前在小麥、大米、大豆、大蒜、紫菜等植物性食物中均發(fā)現(xiàn)活性肽，越來越多的活性肽被證實具有體內(nèi)外降壓作用。本文綜述了植物源性降壓肽的降壓機制、制備方法、評價方法以及最新的研究進展，以期為植物源性降壓肽的研究提供參考。

1 植物源性降壓肽的作用機制、制備和評價方法

1.1 植物源性降壓肽的作用機制

一般情況下，植物源性降壓肽是植物性蛋白在適宜的條件下經(jīng)蛋白酶水解而得到小分子肽段，相對分子量一般在1 kDa 以下，通過競爭性地結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）來抑制ACE 活性，繼而發(fā)揮降血壓的作用。正常人體血壓調(diào)節(jié)主要依賴腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Renin-Angiotensin System，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Kallikrein-kinin system，KKS），其中ACE 在腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)系統(tǒng)中具有重要影響。腎素可將血管緊張素原水解為血管緊張素Ⅰ（無活性），隨后在ACE 作用下，進一步轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ（有活性），導致心肌收縮加強和隨后的血壓增加。因此抑制ACE 活性，能夠有效降低血壓的增高。此外，血管舒緩激肽具有強烈的擴張血管作用，可抑制血管舒緩激肽的分解，防止末梢血管的收縮，使得血壓的升高得到抑制（圖1）。因此，通過抑制ACE 活性和血管舒緩激肽的分解，植物源性活性肽能夠有效地發(fā)揮降壓作用。

圖1 植物源性降壓肽的作用機理Fig.1 Mechanism of antihypertensive peptides derived from plant

1.2 植物源性降壓肽的制備方法

植物源性活性肽的制備方法通常有提取法、微生物發(fā)酵法和水解法。提取法是從植物體內(nèi)直接提取天然多肽類物質(zhì)的方法，分為物理提取法和化學提取法。物理提取法是不依靠化學試劑，僅通過超高壓連續(xù)流細胞破碎儀對植物組織進行破碎裂解，從而提取小分子活性肽。該方法對設(shè)備要求較高，單次處理量較少，多肽的得率不高，在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用較少。化學提取法是采用合適的緩沖液浸泡原料，使得其蛋白質(zhì)充分溶解，然后調(diào)節(jié)pH 或加入變性劑析出蛋白質(zhì)或多肽，再通過分子篩層析柱純化得到多肽。無論是物理提取法還是化學提取法，要求原材料中多肽含量豐富，但是植物中天然存在的肽類物質(zhì)數(shù)量非常有限，直接提取難以滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。

微生物發(fā)酵法是利用微生物生長過程中產(chǎn)生的各種酶催化劑，水解原料中的蛋白質(zhì)，繼而產(chǎn)生水解多肽過程。微生物發(fā)酵法制備多肽具有工藝簡單、成產(chǎn)效率高、成本低廉等優(yōu)點，更容易實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)，但是產(chǎn)生的多肽分離純化較為困難。王姣琳等利用紅曲霉和乳酸菌混合發(fā)酵藜麥，制備純化ACE 抑制肽，經(jīng)過條件優(yōu)化后，最終降壓肽的ACE 抑制率高達89.75%。目前常用于微生物發(fā)酵的菌種有枯草芽孢桿菌、乳酸菌、曲霉菌等。相比單菌發(fā)酵，復(fù)合菌含有的蛋白酶更多，對蛋白質(zhì)的切割位點多，通過微生物酵解產(chǎn)生的多肽種類更為豐富。

水解法可分為酸水解、堿水解和酶水解。在食品領(lǐng)域，由于酸堿試劑的腐蝕性，通常不采用直接的酸堿水解技術(shù)。相較之下，酶水解法具有特異性強、提取率高、成本低、產(chǎn)品安全性高、整個過程條件溫和、控制簡單等特點，可以很好地滿足實驗和生產(chǎn)的需要。師景雙等通過試驗確定多種酶的最佳水解條件，進一步優(yōu)化復(fù)合酶解條件，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白濃度為8%，且各種酶在最佳酶解條件下，依次加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，得到的蛋白水解率最高達39.98%。酶水解法一般使用單個或多個特異性或非特異性蛋白酶，包括胃蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶等。蛋白酶的活性隨環(huán)境條件的不同變化很大，要達到最適宜的酶解效果，溫度和pH 必須控制在最佳條件。此外，不同的反應(yīng)條件如底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時間、預(yù)處理條件等均會影響蛋白質(zhì)水解，進而影響多肽的得率。因此有必要結(jié)合水解底物和目標功能肽，對上述條件進行合理優(yōu)化。

1.3 植物源性肽降壓效果的評價方法

評價植物源性降壓肽效果方法主要有體外驗證、動物實驗和計算機輔助驗證（圖2）。

圖2 植物源性降壓肽的評價方法Fig.2 Evaluation methods for plant-derived antihypertensive peptides

體外驗證一般選用血管緊張素I 的體外類似物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL），HHL 可經(jīng)ACE 水解成馬尿酸（Hip）。當HHL 含量確定時，Hip 的生成量與ACE 含量呈線性相關(guān)。加入降壓肽后，ACE 的活性收到抑制，導致Hip 生成量降低。因此，通過對比實驗前后Hip 的產(chǎn)生量，可計算ACE 的活性，繼而分析出降壓肽的抑制活性。研究中通常用IC值來體現(xiàn)降壓肽的抑制效果，IC數(shù)值越小表明降壓肽的抑制活性越強。

動物實驗一般分為兩種，一種是對麻醉處理后的大鼠靜脈注射六甲銨（降壓藥），去除腎素-血管緊張素之外的影響，然后依次注射ACE 抑制劑和血管緊張素Ⅰ。通過和對照組的比較來反應(yīng)ACE 抑制肽的作用效果；另一種方法使用原發(fā)性高血壓的大鼠，測量ACE 抑制肽干預(yù)前后動脈血壓的變化，據(jù)此評價ACE 抑制肽的作用效果。第二種方法的給藥方式可以是灌胃，也可以是靜脈注射。

近年來，隨著計算機技術(shù)發(fā)展，通過生物信息學和計算生物學技術(shù)評價食源性功能肽逐漸成為研究的熱點。比如分子對接和人工智能技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用于功能肽篩選，該類技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)功能活性預(yù)測和構(gòu)效關(guān)系分析，將極大提高降壓肽的篩選效率。

2 植物源性降壓肽的應(yīng)用

食源性活性肽是ACE 抑制肽的重要來源，因其來源廣泛、毒副作用小等優(yōu)點受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。植物源性降壓肽廣泛存在于植物性蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物中，其分離、純化、鑒定和降壓效果是當前研究的重點和難點。

2.1 小麥降壓肽

小麥作為常見的糧食作物，在我國廣泛種植。蛋白質(zhì)約占小麥粉總質(zhì)量的11.5%～12.5%，是其第二大組分。如何提高水解肽的得率和ACE 抑制效果，是當前研究的熱點。有學者以麥胚蛋白或谷朊蛋白為原料制備多肽，發(fā)現(xiàn)超聲輔助酶解處理可增強水解肽的ACE 抑制效果，同時酶和底物的比例、酶解時間均會影響多肽的得率和ACE 抑制活性。此外，周存山等利用中性大孔樹脂對麥胚蛋白降壓肽進行脫鹽，發(fā)現(xiàn)處理后的降壓肽粗提物回收率和體外降壓活性均顯著提高。Peng 等在制備多肽時，結(jié)合酶解位點的特征，創(chuàng)新性地利用綠假單胞菌蛋白酶制備小麥谷朊蛋白ACE 抑制肽，體外實驗發(fā)現(xiàn)兩種羧基端含有色氨酸的肽SAGGYIW 和APATPSFW 對ACE 有較好的抑制效果。體外實驗雖證明小麥來源的降壓肽對ACE 的抑制效果，但是宿主體內(nèi)胃腸道環(huán)境相對復(fù)雜，尤其是胃酸和宿主蛋白酶對多肽穩(wěn)定性的影響，導致體外實驗的結(jié)果不能簡單推及到體內(nèi)。Zou 等采用自發(fā)性高血壓大鼠對麥麩蛋白水解物進行評價，發(fā)現(xiàn)麥麩多肽對大鼠的腎素和ACE 具有明顯的高抑制效果，且分子量<1 kDa 以下的多肽的抑制效果顯著高于分子量>1 kDa 的多肽?？梢?，麥麩多肽可以通過抑制ACE 及腎素的活性實現(xiàn)降壓功能，且小分子量多肽效果更好。綜合來看，小麥中含有蛋白質(zhì)種類較多，目前降壓肽的研究主要圍繞麥胚蛋白、谷朊蛋白、麥麩蛋白，雖然已經(jīng)鑒定出一些具有明顯ACE 抑制效果的多肽，但是對其作用位點和穩(wěn)定性的評價較少，體內(nèi)降壓效果也多是聚焦在混合水解肽，單一ACE 抑制肽能否在體內(nèi)發(fā)揮降血壓作用尚未可知。

2.2 玉米降壓肽

玉米蛋白粉是玉米濕磨法加工淀粉過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物之一，是制備玉米肽的原料。玉米肽具有易消化吸收的特性，已被國家食品藥品監(jiān)督管理局列入新資源食品清單，在醫(yī)藥、保健食品等領(lǐng)域顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。目前，玉米降壓肽氨基酸序列及作用機理已逐漸被解析。有研究表明肽段的ACE 抑制活性與其氨基酸組成和一級結(jié)構(gòu)有關(guān)：當肽C 末端為芳香族氨基酸（包括W、Y、F）和P 時，抑制肽的抑制活性增強；N 末端為疏水性的V、L、I 或堿性氨基酸（R、K、H）時，多肽與ACE 的親和力較強，抑制活性最高。周明等以玉米黃粉為原料，通過體外實驗發(fā)現(xiàn)4 種ACE 抑制肽，分別為AY、SAP、NAP、VNAP，和上述結(jié)論相符。相比小麥來源的降壓肽，通過體內(nèi)實驗評價玉米降壓肽的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)，玉米多肽（AY、MI、LPP）對自發(fā)性高血壓大鼠具有明顯的降壓效果，且其ACE 抑制活性在熱處理和模擬胃腸消化后仍能保持。除玉米可食部外，玉米花絲也能制備降壓肽。Li 等發(fā)現(xiàn)玉米花絲多肽（SKFDNLYGCR）可占據(jù)自發(fā)性高血壓大鼠ACE 的底物結(jié)合通道，通過氫鍵與ACE 相互作用，從而抑制ACE 活性，顯著降低模型大鼠的收縮壓水平且存在劑量反應(yīng)關(guān)系。綜上，目前對于玉米降壓肽的篩選不僅停留在體外實驗階段，動物實驗的應(yīng)用更能明確降壓肽的體內(nèi)作用效果，且對ACE 抑制機制的解析更能加深對降壓肽的理解?？紤]到玉米肽的商業(yè)應(yīng)用前景，與玉米降壓肽相關(guān)的人群干預(yù)可能成為未來研究的重點。

2.3 大豆降壓肽

大豆是膳食中植物性蛋白的主要來源之一，其蛋白質(zhì)含量豐富，約占36%～56%，是制備生物活性肽的良好原料。目前尚無大豆多肽引起不良反應(yīng)的報道，其在飲食和藥物中的應(yīng)用價值越來越被人們所重視。Giovanna 等用胃蛋白酶水解不同豆類的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)大豆水解產(chǎn)物相比其他豆類的ACE 抑制效果更為明顯，可見大豆是ACE 抑制肽的重要來源。研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白水解產(chǎn)生的GVRP、IIVTP、IY、YVVF、LVF、WMY、LVLL、FF 可能在ACE 抑制過程中起主要作用，還發(fā)現(xiàn)短肽與ACE形成的氫鍵越多，其抑制活性就越強。Xu 等進一步驗證大豆生物活性肽經(jīng)氫鍵抑制ACE 的機理，發(fā)現(xiàn)多肽YVVF 通過氫鍵與ACE 的C 域受體有最大親和力；通過體外模擬胃腸消化實驗，發(fā)現(xiàn)大豆多肽消化后對ACE 的抑制效果不降反增，為進一步的體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。Wang 等以去氧腎上腺素預(yù)收縮大鼠胸主動脈為試驗對象，驗證了大豆多肽QC、GPANV、PANV 的體內(nèi)ACE 抑制活性，并發(fā)現(xiàn)其還有血管舒張作用，從而提出大豆肽的降壓機制。此外，Song 等通過細胞實驗，發(fā)現(xiàn)大豆多肽LSW 可以通過修復(fù)血管平滑肌細胞中miRNA 的表達來保護血管內(nèi)皮細胞，減弱機體血管緊張素Ⅱ?qū)ρ軆?nèi)皮細胞的損害。綜上可知，大豆中存在多種降壓肽，這些降壓肽的分子作用機制逐漸被解析，有助于其在功能性食品中的應(yīng)用。

2.4 大米降壓肽

大米是我國居民膳食中不可或缺的組成部分，其食用量占產(chǎn)品的80%以上。全谷物大米含6%～8%的蛋白質(zhì)，氨基酸組成配比接近FAO/WHO 的推薦模式，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，也是制備生物活性肽的良好原料。徐珍珍等將大米多肽與市售大豆蛋白肽、魚膠原蛋白肽進行對比，發(fā)現(xiàn)大米多肽ACE 抑制IC最低，可見通過大米制備降壓肽具有潛在的優(yōu)勢。體外實驗證實大米多肽對ACE 的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)小于3 kDa 時ACE 抑制率最高，達91.95%±1.63%，其中起主要作用的肽為VVFFAAAL。為了增強大米多肽的ACE 抑制效果，楊雪等在模擬胃腸消化中，使用雙頻順序超聲輔助處理，發(fā)現(xiàn)能顯著提高大米多肽的ACE 抑制活性。大米多肽雖然對ACE 具有明顯的抑制效果，但并不意味著能在機體內(nèi)發(fā)揮降壓作用。封張萍等以人臍靜脈內(nèi)皮細胞模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)大米多肽VPFR 通過影響ACE 和ET-1 mRNA 表達量下調(diào)、ACE2 mRNA 表達量上調(diào)來抑制ACE 活性。Chen等通過動物實驗發(fā)現(xiàn)多肽VNP、VWP 可以競爭性抑制ACE 活性，降低自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓。除了大米能夠制備降壓肽，米糠等加工副產(chǎn)物也是降壓肽的重要來源。Shobako 等通過動物實驗發(fā)現(xiàn)米糠多肽LRA 對自發(fā)性高血壓大鼠的ACE 抑制性不強，但可以通過與NO 系統(tǒng)耦合的新途徑放松腸系膜動脈，繼而表現(xiàn)出血管舒張活性。Ogawa等通過隨機、雙盲、對照的臨床干預(yù)實驗，進一步確認了米糠降壓肽LRA 能夠顯著降低收縮壓，且未發(fā)現(xiàn)有嚴重的不良反應(yīng)。目前關(guān)于大米多肽的研究相對深入，從體外實驗、體內(nèi)實驗、臨床試驗均能證明大米多肽具有明顯的降壓效果，有助于大米多肽在功能性食品中的應(yīng)用。目前關(guān)于機制方面的研究相對較少，大米多肽如何在體內(nèi)發(fā)揮降壓作用可能是未來研究的熱點。

2.5 其他植物性食物降壓肽

植物源降壓肽的來源十分廣泛，除了上述提到的食物種類以外，綠豆、榛子、葵花籽、高粱籽、大蒜、番茄也含有降壓肽，并被證實具有良好的降壓效果（表1）。在糧食作物中，雜豆往往被認為富含功能成分。李慶波等以綠豆為原料制備ACE 抑制肽，發(fā)現(xiàn)1～3 kDa 多肽的ACE 抑制活性最高，其中主要起作用是FLVNPDDNENL、FLVNPDDNENLRII和KDNVISEIPTEVLDL。此外，堅果富含蛋白質(zhì)，也是降壓肽的潛在來源之一。Liu 等發(fā)現(xiàn)榛子多肽ACE 抑制活性可達82.03%±2.61%，主要起作用的多肽為AVKLVL、YLVR 和TLVGR。除雜豆、堅果等傳統(tǒng)食品原料外，植物種子也富含蛋白質(zhì)。張孟凡等以葵花籽粕蛋白為原料，模擬體內(nèi)消化后發(fā)現(xiàn)葵花籽粕ACE 抑制肽活性幾乎不受胃腸蛋白酶影響，ACE 抑制率始終保持在90%以上，可以很好作用于靶組織。Wu 等從甜高粱籽中獲取多肽TLS，發(fā)現(xiàn)其C 端的Ser 可與ACE 的S1、S2 口袋相互作用，從而抑制ACE 活性。此外，蔬菜中也存在降壓肽。Moayedi 等從番茄廢料中提取降壓肽，發(fā)現(xiàn)分子量為500～800 Da 的肽段有高ACE 抑制活性。宋凱強等發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)條件制備下，大蒜降壓肽的ACE 抑制率為83.91%±0.13%，且分子量3 kD 以下的多肽活性最佳。綜上可知，植物性食物中普遍存在降壓肽，對于主糧之外的植物源性降壓肽的挖掘也應(yīng)該得到關(guān)注。

表1 植物源性降壓肽Table 1 Plant-derived antihypertensive peptides

3 結(jié)語與展望

植物源性降壓肽是當前極具發(fā)展前景的食品功能因子，已經(jīng)引起世界各國科學家的高度重視，不同來源降壓肽的制備方法、結(jié)構(gòu)解析和降壓機理的研究得到快速發(fā)展。多種植物源性降壓肽得到開發(fā)，起關(guān)鍵發(fā)揮作用的多肽和潛在分子機制也越來越清晰。部分功能降壓肽已用于保健食品的開發(fā)，實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，為高血壓的預(yù)防和控制提供了新的手段。

然而，植物源性降壓肽的研究才剛起步，還有許多研究工作需要開展。比如酶水解的效率不高、酶切位點存在隨機性、降壓肽篩選效率低、降壓肽分離純化困難等問題限制著高活性降壓肽的制備和應(yīng)用。此外，諸多研究僅停留在體外實驗階段，人體的胃腸道消化環(huán)境極為復(fù)雜，體外ACE 抑制效果好的多肽能否在人體內(nèi)發(fā)揮作用尚不確定，需要更多的臨床數(shù)據(jù)加以支撐。隨著合成生物學和生物信息學的發(fā)展，對蛋白酶的改造有助于高活性降壓肽的制備。同時分子模擬技術(shù)和人工智能的技術(shù)的發(fā)展，復(fù)雜多肽的功能鑒定和構(gòu)效關(guān)系研究會變得越來越容易。