基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)及其在感染性疾病分子診斷中的應(yīng)用

方楓玲(綜述)，郭紹彬，傅亞，林曹瑞，劉燦，歐啟水(審校)

感染性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，也是臨床工作的主要難題之一。分子診斷是感染性疾病診斷的重要部分。臨床上常用的分子診斷方法為聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，但其對(duì)儀器、場(chǎng)地、人員的專業(yè)性要求限制了它在感染性疾病診斷中的應(yīng)用。近年來，RNA調(diào)節(jié)系統(tǒng)被開發(fā)應(yīng)用于分子診斷的研究日益增多[1-2]。立足開關(guān)(toehold switch)屬于RNA核糖調(diào)控元件，它通過與目標(biāo)RNA序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)來控制基因表達(dá)[3]。2014年，哈佛大學(xué)GREEN團(tuán)隊(duì)[4]成功設(shè)計(jì)了立足開關(guān)，使其與無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯(cell-free transcription-translation，TX-TL)系統(tǒng)相結(jié)合，開創(chuàng)了分子診斷新的領(lǐng)域，成功實(shí)現(xiàn)了多種病毒性感染疾病相關(guān)病原體(如埃博拉病毒和寨卡病毒)的分子診斷[5-6]。

隨著立足開關(guān)性能的提高，人們還將基于立足開關(guān)的體外無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)與紙基平臺(tái)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)分子診斷的即時(shí)檢驗(yàn)(point-of-care testing，POCT)[5-10]。隨著立足開關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，該技術(shù)必將給感染性疾病的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷帶來重大變革。

1 基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)

立足開關(guān)是一類基于RNA的從頭設(shè)計(jì)的可編程原核生物核糖調(diào)控元件，其通過與任意序列的同源RNA相互作用進(jìn)而誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)。立足開關(guān)具有寬的動(dòng)態(tài)范圍、正交性和可編程性，通過聯(lián)合無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，可作為一種分子診斷方法應(yīng)用于多種病原體的檢測(cè)[4]。

1.1 立足開關(guān)的基本結(jié)構(gòu) 傳統(tǒng)的核糖調(diào)控系統(tǒng)通過自身RNA序列在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，RBS)區(qū)域形成堿基互補(bǔ)配對(duì)來阻止核糖體結(jié)合，從而抑制基因的翻譯。當(dāng)與觸發(fā)RNA(trigger RNA)結(jié)合時(shí)，RBS序列釋放，啟動(dòng)基因的翻譯。但是，由于抑制基因翻譯是通過RBS序列結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，因此觸發(fā)RNA就必須含有RBS的序列，才能將抑制序列替換出來[4,11]。

GREEN團(tuán)隊(duì)[4]提出一種解決方案，即設(shè)計(jì)立足開關(guān)，其可以結(jié)合和感知任意特定的RNA序列。立足開關(guān)是一個(gè) RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)5’末端的單鏈區(qū)域稱為立足序列，可與觸發(fā)RNA互補(bǔ)配對(duì)。開關(guān)包含受調(diào)控基因的編碼序列，該編碼序列的上游是基于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的信息處理模塊，包含RBS和起始密碼子，二者分別排列在一個(gè)環(huán)和一個(gè)凸起中，其后緊接一個(gè)具有21個(gè)核苷酸的連接序列(圖1)。

RBS：核糖體結(jié)合位點(diǎn)；AUG：起始密碼子。圖1 立足開關(guān)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic view of the design of the toehold switch

與傳統(tǒng)的核糖調(diào)控元件不同，立足開關(guān)通過在發(fā)夾環(huán)中隔離起始密碼子(AUG)和RBS來阻斷下游基因翻譯，這個(gè)特性使立足序列不受限制，可設(shè)計(jì)任意的立足序列，用于不同病原體的分子診斷[4]。通過合理設(shè)計(jì)立足開關(guān)，使其結(jié)合任意特定的觸發(fā)RNA序列，激活蛋白翻譯，這不僅大大提高了序列的正交性，降低了串?dāng)_，而且觸發(fā)RNA可靶向任意RNA序列的特性，顯著拓展了立足開關(guān)的應(yīng)用范圍。

1.2 立足開關(guān)的設(shè)計(jì)原則 基于合成生物學(xué)的分子診斷系統(tǒng)通常由3個(gè)部分組成：傳感器模塊、信號(hào)處理器模塊和報(bào)告模塊[12]。對(duì)于立足開關(guān)而言，立足區(qū)域是傳感器模塊，中間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)是信號(hào)處理模塊，下游的特定蛋白編碼基因是報(bào)告模塊。立足區(qū)域和報(bào)告基因可以根據(jù)所檢測(cè)的病原體需求合理調(diào)整，并可以整合為更高復(fù)雜性的系統(tǒng)組件[5]。

設(shè)計(jì)立足開關(guān)應(yīng)參照以下原則：(1)立足開關(guān)本身應(yīng)形成一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，隔離RBS和起始密碼子，避免在沒有觸發(fā)RNA存在的情況下激活下游基因表達(dá)而造成信號(hào)泄露；(2)與單獨(dú)存在的立足開關(guān)和觸發(fā)RNA相比，立足開關(guān)-觸發(fā)RNA復(fù)合體應(yīng)有一個(gè)更穩(wěn)定的能量狀態(tài)，通過相互作用促進(jìn)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的展開和下游基因的激活；(3)立足開關(guān)序列中不能包含禁止下游基因翻譯的終止密碼子；(4)立足開關(guān)識(shí)別的觸發(fā)RNA序列應(yīng)是這個(gè)立足開關(guān)RNA特有的，以防止脫靶效應(yīng)[13]。

1.3 立足開關(guān)的作用機(jī)制 當(dāng)僅有立足開關(guān)存在時(shí)，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)將RBS與起始密碼子AUG隔離，阻斷下游編碼基因翻譯；當(dāng)觸發(fā)RNA(病原體RNA)存在時(shí)，其與開關(guān)的立足區(qū)域結(jié)合，通過線性-線性雜交相互作用[14]，啟動(dòng) RNA-RNA鏈置換相互作用，打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，釋放RBS，從而激活基因并啟始翻譯[4]。通過將受調(diào)控的基因設(shè)計(jì)為報(bào)告基因，如GFP和lacZ基因，就可以可視化檢測(cè)目標(biāo)觸發(fā)RNA分子的存在，這就是立足開關(guān)系統(tǒng)的分子診斷基礎(chǔ)。

立足開關(guān)解決了傳統(tǒng)核糖調(diào)控元件的設(shè)計(jì)局限性，具有寬動(dòng)態(tài)范圍、高正交性和高度可編程性。通過引入線性-線性雜交相互作用，而不是環(huán)-環(huán)或者環(huán)-線性作用，使得立足開關(guān)在動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)上比傳統(tǒng)的核糖調(diào)控元件更有優(yōu)勢(shì)[4]?？梢葬槍?duì)特定的病原體任意設(shè)計(jì)立足開關(guān)的立足序列，這種高靈活性有利于立足開關(guān)在分子診斷中的應(yīng)用[15]。

1.4 無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng) 無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)可以在體外控制平臺(tái)上模擬體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯的環(huán)境，從而在生物體外對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行原型設(shè)計(jì)和工程改造[16]。近年來，無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)為體外蛋白質(zhì)表達(dá)以及 DNA調(diào)控元件、基因回路和代謝途徑的原型設(shè)計(jì)提供了一個(gè)快速而有力的平臺(tái)[17]。

無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)包含了體外基因表達(dá)所需的所有必要成分：(1)細(xì)胞提取物。主要通過細(xì)胞裂解并去除細(xì)胞碎片獲得，包含核糖體、RNA聚合酶和其他從源菌株提取的轉(zhuǎn)錄翻譯過程必需的蛋白質(zhì)(如σ因子、起始因子和延伸因子)。(2)反應(yīng)混合液。主要是蛋白合成的補(bǔ)充輔因子，包括氨基酸、核苷酸、鹽、多胺和能量物質(zhì)、擁擠試劑(如聚乙二醇或Ficoll)、代謝輔因子、緩沖液、轉(zhuǎn)運(yùn) RNA(transfer RNA，tRNA)和其他代謝添加劑(例如谷胱甘肽)。(3)DNA模板。質(zhì)?；蛘呔€性表達(dá)模板(linear expression template，LET)。將3種成分混合并在16～37 ℃下孵育，體外DNA表達(dá)模板即可在細(xì)胞提取物和反應(yīng)混合液的共同作用下，轉(zhuǎn)錄生成 mRNA，隨后翻譯成蛋白質(zhì)，此過程通常需要1～24 h[18]。通過運(yùn)用冷凍干燥技術(shù)，將配置好的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯體系和基因模板分別固定在紙基或其他多孔材料上，在室溫下可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)1 a[9]，易于運(yùn)輸攜帶。當(dāng)二者混合并加水活化，基因模板便會(huì)在體系中表達(dá)，合成蛋白質(zhì)[6]。

無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)：(1)可大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉；(2)可使用環(huán)狀或易獲取的PCR線性DNA模板；可靈活利用各種輔助組分優(yōu)化反應(yīng)體系；(3)體系可做成干粉狀，易于儲(chǔ)存和攜帶[6,19]。這些優(yōu)勢(shì)使無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)為核酸分子診斷平臺(tái)提供一個(gè)強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，大大提高了分子診斷技術(shù)的靈活性和便攜性。目前，無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于一些分子診斷領(lǐng)域，如寨卡病毒和呼吸道合胞病毒的分子診斷[1-2,5,10]。

1.5 基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)的工作原理 研究表明，立足開關(guān)常常在無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)中開發(fā)[5-6,8-9,20-21]。立足開關(guān)具有可以結(jié)合任意特定的RNA分子的能力，無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)具有在體外合成蛋白的能力，二者相結(jié)合，具有開發(fā)成分子診斷工具的潛力。將編碼立足開關(guān)RNA的質(zhì)粒DNA模板與無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)共同冷凍干燥至紙基上，加水活化后，質(zhì)粒作為模板，在無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成分作用下，轉(zhuǎn)錄生成立足開關(guān)RNA。立足開關(guān)中的RBS被隔離，下游的報(bào)告基因處于抑制狀態(tài)，在靶核酸存在的情況下，立足開關(guān)RNA與靶RNA互補(bǔ)配對(duì)，RBS被釋放，激活下游的報(bào)告基因，在無細(xì)胞翻譯成分的作用下，報(bào)告基因在體外翻譯表達(dá)，通過聯(lián)合不同的檢測(cè)平臺(tái)如熒光、比色和電化學(xué)等輸出[4-6,22]，在滿足不同系統(tǒng)的要求下，便可以直觀地檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)(圖2)。根據(jù)以上工作原理，該系統(tǒng)已被開發(fā)應(yīng)用于感染性疾病的分子診斷。

RBS：核糖體結(jié)合位點(diǎn)；AUG：起始密碼子。圖2 立足開關(guān)工作原理圖Fig.2 Schematic view of the operating principle of the toehold switch

2 基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)在感染性疾病分子診斷中的應(yīng)用

根據(jù)基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)作為分子診斷工具的工作原理，該系統(tǒng)已被開發(fā)成分子診斷技術(shù)，用于診斷多種感染性病原體，如埃博拉病毒、寨卡病毒和諾如病毒等[5-6,21]，為感染性疾病的快速便攜診斷提供了新的契機(jī)。

2014年，埃博拉疫情在西非爆發(fā)。PARDEE團(tuán)隊(duì)[6]開發(fā)了一種將無細(xì)胞基因合成網(wǎng)絡(luò)嵌入到紙張的便攜式低成本的診斷方法，通過將針對(duì)埃博拉病毒的立足開關(guān)傳感器和無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯體系冷凍干燥在紙基上來快速檢測(cè)埃博拉病毒。此開關(guān)僅需60～120 min 即可檢測(cè)到埃博拉病毒RNA。另一方面，紙基傳感器制造成本低廉，將其引入檢測(cè)系統(tǒng)，使操作簡(jiǎn)單方便，可直接肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果。

2015年，PARDEE團(tuán)隊(duì)[5]在無細(xì)胞紙基平臺(tái)上開發(fā)了基于立足開關(guān)的RNA傳感器，用于檢測(cè)寨卡病毒。同時(shí)引入了一種可以與凍干傳感器平臺(tái)兼容的提供單堿基識(shí)別的檢測(cè)方法，即NASBA-CRISPR裂解法(NASBA-CRISPR Cleavage，NASBACC)，利用依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(nuclear acid sequence-based amplification，NASBA)的高效等溫?cái)U(kuò)增和CRISPR/Cas9的序列特異性核酸酶活性來快速區(qū)分寨卡病毒的美洲譜系和非洲譜系。此外，該系統(tǒng)只需將病毒樣品煮沸2 min，通過NASBA 擴(kuò)增3 h，30 min便可以檢測(cè)到獼猴血漿中病毒載量低至2.8×10-15mol/L的寨卡病毒。通過結(jié)合等溫RNA擴(kuò)增和凍干紙基平臺(tái)，不僅提高了便攜性，還降低了成本，該技術(shù)的檢測(cè)試劑成本遠(yuǎn)低于目前臨床核酸檢測(cè)常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitative real-time PCR，qPCR)，解決了基于核酸的分子診斷技術(shù)應(yīng)用的局限性。以上這些優(yōu)勢(shì)使這項(xiàng)診斷技術(shù)以低廉的價(jià)格在資源匱乏地區(qū)的實(shí)施成為可能。

2018年，該團(tuán)隊(duì)在之前研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建了新的方法，該方法可以在 3～5 h內(nèi)特異性檢測(cè)人類腸道微生物組中的10種細(xì)菌。通過結(jié)合NASBA，可以半定量檢測(cè)艱難梭菌毒素的mRNA水平，因此可以快速區(qū)分艱難梭菌攜帶狀態(tài)和艱難梭菌感染性腹瀉[8]。同年，MA團(tuán)隊(duì)開發(fā)了另一種基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯檢測(cè)系統(tǒng)，可以從人類糞便標(biāo)本中檢測(cè)諾如病毒 GII.4型 Sydney流行株[21]，在此基礎(chǔ)上結(jié)合同源體的病毒富集和磁珠，將結(jié)合磁珠的檢測(cè)限降低到2.7×10-19mol/L(靈敏度提高1 000倍)。2021年，PARK團(tuán)隊(duì)將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)結(jié)合到立足開關(guān)系統(tǒng)中，全程 70 min即可完成檢測(cè)，檢測(cè)限為120拷貝數(shù)/反應(yīng)，達(dá)到了臨床檢測(cè)新型冠狀病毒樣本所需的靈敏度[7,23]。最近，國(guó)內(nèi)的CAO和SUN團(tuán)隊(duì)基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，開發(fā)出多項(xiàng)可通過肉眼查看紙基顯色、判斷是否感染呼吸道合胞病毒以及區(qū)分其亞型的分子診斷技術(shù)[10,20]。

這些應(yīng)用證明了基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)在感染性疾病的分子診斷方面具有巨大潛力。相比臨床上常用的qPCR技術(shù)，基于立足開關(guān)聯(lián)合無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)的分子診斷平臺(tái)，不僅表現(xiàn)出同樣的特異度和靈敏度，而且不需要專門的檢測(cè)儀器、專業(yè)的技術(shù)人員以及試劑的冷鏈運(yùn)輸條件，更加便攜、快速、低成本[5-8,10,21]，還能開發(fā)為試紙用于POCT，這些優(yōu)勢(shì)更加貼合感染性疾病診斷的要求。

3 總結(jié)與展望

目前，基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯平臺(tái)作為一種新興的分子診斷技術(shù)，以便攜、低成本、快速及高靈敏度等優(yōu)勢(shì)取得了較大進(jìn)展，但該診斷技術(shù)也存在一些局限性，如立足開關(guān)的信號(hào)泄露，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生；檢測(cè)平臺(tái)無法實(shí)現(xiàn)完全定量。當(dāng)前相關(guān)研究成果僅在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的環(huán)境中呈現(xiàn)，如果要將這種技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室引入臨床，并提供有效的診斷能力，還需要完善立足開關(guān)的設(shè)計(jì)、測(cè)試大規(guī)模樣本，以及通過多學(xué)科整合對(duì)其效率和穩(wěn)定性進(jìn)行綜合性評(píng)估。

目前，人們正在研究計(jì)算方法，以改進(jìn)立足開關(guān)的設(shè)計(jì)方案和性能[24]，通過多學(xué)科聯(lián)合發(fā)展，不斷地將新興技術(shù)與該技術(shù)聯(lián)合實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，以促進(jìn)該診斷系統(tǒng)在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，基于立足開關(guān)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)將使得針對(duì)臨床常見感染性病原體，如生殖道感染病原體、呼吸道感染病原體等的快速檢測(cè)成為可能，有利于我國(guó)POCT分子診斷的開發(fā)和應(yīng)用，促進(jìn)公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展。