鼻咽血管纖維瘤中GLUT-1與PCNA表達及其起源

張秋韻，林昶

關(guān)于鼻咽血管纖維瘤(juvenile nasopharyngeal angiofibroma,JNA)的本質(zhì)，部分學(xué)者認為是先天性胚胎殘余的血管增殖畸形，也有學(xué)者認為是血管性錯構(gòu)瘤、血管源性腫瘤或血管畸形[1-3]，目前尚缺乏統(tǒng)一認識。MULLIKEN等[4]提出，血管病變可分為具有內(nèi)皮細胞增殖特征的血管瘤和具有正常內(nèi)皮細胞的血管畸形兩大類。血管畸形是血管先天性形態(tài)發(fā)育差錯造成的結(jié)構(gòu)異常，出生時即存在，隨生長發(fā)育逐漸成比例長大，不會自然消退，在特殊情況下也可快速增大。真性血管瘤常于出生后1個月內(nèi)出現(xiàn)，在6個月內(nèi)快速增長，此后漸入消退期，逐漸停止增長并開始緩慢消退直至消退完成期，約80%的血管瘤可在2～10 a自然消退[5]。血管瘤的快速增長和自然消退是區(qū)分血管瘤與血管畸形的特征。

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucose transporter-1，GLUT-1)是分布在哺乳動物細胞膜上的一類跨膜糖蛋白，是區(qū)分血管瘤與血管畸形的特征性標(biāo)志物[6]。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)，作為一項評估細胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究。在血管性疾病中，血管內(nèi)皮細胞是否增殖是確定其性質(zhì)的關(guān)鍵。真性血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖、合成、分泌功能活躍，而先天性血管畸形的內(nèi)皮細胞不具備以上功能。本研究通過檢測JNA、血管畸形、嬰幼兒血管瘤組織中GLUT-1和PCNA的表達，探討JNA的本質(zhì)是胚胎殘留的血管畸形還是血管瘤，報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2006年7月—2017年12月診治的JNA患者20例、血管畸形(頭面部)患者20例、嬰幼兒血管瘤(頭面部)患者9例、鼻息肉患者15例?；颊吲R床資料均齊全，術(shù)后均經(jīng)病理證實。20例JNA中，男性19例，女性1例，年齡中位數(shù)19歲(13～33歲)，其中未成年人12例(<18歲)；9例嬰幼兒血管瘤(頭面部)中，男性4例，女性5例，年齡中位數(shù)11個月(2～120個月)；20例血管畸形(頭面部)中，男性9例，女性11例，年齡中位數(shù)44歲(1月～75歲)；15例鼻息肉中，男性10例，女性5例，年齡中位數(shù)51歲(25～50歲)。

1.2 方法

1.2.1 試劑 GLUT-1抗體(北京中杉金橋公司)；PCNA抗體(美國Abcam公司)；二步法試劑盒(PV9000鼠、兔通用型，北京中杉金橋公司)。

1.2.2 取材和H-E染色 取患者的新鮮手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)10%甲醛固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋，3.5 μm連續(xù)組織切片。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining,IHC) 采用IHC二步法染色技術(shù)，切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精(濃度逐漸降低)遞減到水，分別以GLUT-1、PCNA抗體為一抗(均為濃縮型)，稀釋倍數(shù)1∶10、1∶100、1∶200，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。顯微鏡下觀察、拍照。每次實驗均采用已確定的陽性標(biāo)本為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1 IHC陽性結(jié)果判斷 陽性細胞：GLUT-1定位于細胞質(zhì)或細胞膜，陽性細胞胞質(zhì)內(nèi)見棕黃色顆粒狀或斑片狀染色，細胞核經(jīng)蘇木精襯染為淡藍色；PCNA定位于細胞核，見棕黃色染色。

1.3.2 IHC陽性評分標(biāo)準(zhǔn) 光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片選取不相重疊的10個部位，400×倍鏡視野下計數(shù)，分別計數(shù)血管內(nèi)皮細胞100個細胞，按陽性細胞數(shù)占總細胞的比例和染色深度進行評分并分級[7]。GLUT-1染色強度分級：無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色及更深顏色為2分；陽性細胞數(shù)分級：陽性細胞數(shù)≤50%為0分，51%～75%為1分，≥76%為2分。兩項得分相加，<2分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3分為陽性(++)，4分為強陽性(+++)表達病例。

PCNA分級程度判定：陰性(-)，陽性細胞數(shù)<25%，無陽性細胞或背景同陰性對照者；弱陽性(+)，陽性細胞數(shù)26%～50%；陽性(++)，陽性細胞數(shù)51%～75%；強陽性(+++)，陽性細胞數(shù)76%～100%。間質(zhì)細胞用相同計數(shù)方法，分別計數(shù)4組標(biāo)本中血管內(nèi)皮細胞和間質(zhì)細胞的陽性細胞標(biāo)識率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用秩和檢驗(Kruskal-Wallis法、Mann-Whitney法)，所有結(jié)果均以雙尾檢驗P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 JNA的組織學(xué)表現(xiàn) 20例JNA中，分級(Radkowski staging system)Ⅰa 0例，Ⅰb 1例，Ⅱa 2例，Ⅱb 2例，Ⅱc 4例，Ⅲa 5例，Ⅲb 6例。H-E染色觀察JNA的組織學(xué)：由大量薄壁的血管和細胞稀疏的纖維性間質(zhì)組成。纖維性間質(zhì)內(nèi)的細胞呈梭形或星形，無異型性，核分裂像罕見。血管的數(shù)量和形狀不一，裂隙樣或擴張狀，血管壁平滑肌薄或不完整，缺乏彈力纖維。

2.2 GLUT-1在不同組織的表達 GLUT-1在嬰幼兒血管瘤組中的表達明顯高于JNA組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；JNA組與血管畸形組和鼻息肉組的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1，圖1)。

表1 GLUT-1在不同組織的表達Tab.1 Expression of GLUT-1 in different tissues

GLUT-1：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1。A：鼻咽血管纖維瘤，血管內(nèi)皮細胞(箭頭所示)GLUT-1表達陰性，紅細胞染色陽性；B：血管瘤，血管內(nèi)皮細胞(箭頭所示)GLUT-1表達陽性；C：血管畸形，血管內(nèi)皮細胞(箭頭所示)GLUT-1表達陰性，紅細胞染色陽性；D：鼻息肉，血管內(nèi)皮細胞(黑色箭頭所示)GLUT-1表達陰性，紅細胞染色陽性，周圍神經(jīng)鞘染色陽性(紅箭頭所示)。圖1 GLUT-1在不同組織的表達( ×200)Fig.1 Expression of GLUT-1 in different tissues ( ×200)

2.3 PCNA在不同組織內(nèi)皮細胞的表達 PCNA在嬰幼兒血管瘤組中的表達明顯高于JNA組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)；JNA組與血管畸形組和鼻息肉組的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2，圖2)。

表2 PCNA在不同組織內(nèi)皮細胞的表達Tab.2 Expression of PCNA in endothelial cells of different tissues

3 討 論

JNA的發(fā)病率僅占整個頭頸部腫瘤的0.05%，絕大多數(shù)發(fā)生于青少年男性，極少數(shù)老年男性及女性發(fā)病。部分JNA會自然停止生長或在成年后消退，少數(shù)病例報道其惡變可能[8-9]。

PCNA：增殖細胞核抗原。A：鼻咽血管纖維瘤，血管內(nèi)皮細胞PCNA表達陰性(黑色箭頭所示)，間質(zhì)成纖維細胞成梭形或多角形，可見部分表達PCNA(紅箭頭所示)；B：血管瘤，血管內(nèi)皮細胞(箭頭)PCNA表達陽性；C：血管畸形，血管內(nèi)皮細胞PCNA表達陰性；D：鼻息肉，血管內(nèi)皮細胞PCNA表達陰性。圖2 PCNA在不同組織內(nèi)皮細胞的表達( ×200)Fig.2 Expression of PCNA in endothelial cells in different tissues ( ×200)

JNA病理上雖屬良性，但生物學(xué)特性傾向于惡性。迄今為止，學(xué)者們對JNA的致病原因作了大量的推測及探索。STERNBERG[10]認為，JNA是一種特殊類型的血管瘤；DANE[11]認為，JNA是由雌激素過多引起的；SCHIFF[12]認為，JNA是因性激素不平衡引起，通過垂體—性腺軸作用，可提高性激素的分泌水平，從而刺激異位增殖血管組織的增生。MAURICE等[13]通過比較JNA和生殖勃起組織的組織學(xué)特點，發(fā)現(xiàn)兩者有很大的相似性，認為JNA是胚胎發(fā)育過程中生殖勃起組織異位遺留在鼻咽部，在青春期雄激素的刺激下生長而產(chǎn)生的腫瘤。SCHICK等[14]認為，由于第一鰓弓動脈退化不完全，以及青春期生長發(fā)育的刺激，使得殘留的鰓弓動脈發(fā)展為血管纖維瘤，該動脈在胚胎發(fā)育中的22～24 d 期間形成，并且在腹側(cè)和背側(cè)主動脈弓之間形成暫時連接。該動脈通常退化并形成血管叢，可能留下殘余物，從而發(fā)生JNA。JNA血管表達層粘連蛋白α2被認為是早期胚胎血管生成的標(biāo)志物[15]。多種亞型的層粘連蛋白在鼻甲組織和JNA中表達相似，而層粘連蛋白α2和α3只在血管纖維瘤表達，下鼻甲組織則不表達，表明早期發(fā)育階段的血管存在于血管纖維瘤中，進一步支持血管纖維瘤由第一個鰓弓動脈的殘體發(fā)展而來的觀點。此外，GRAMANN等[16]發(fā)現(xiàn)，在JNA中Ⅳ型膠原蛋白表達較明顯，該蛋白是一種神經(jīng)嵴細胞外基質(zhì)富含的成分，并且可能參與來自第一動脈叢殘余物的JNA的發(fā)展。JNA是起源于第一鰓弓動脈回旋處的血管叢的殘腔，這或許可以解釋盡管大多數(shù)腫瘤的供血動脈來源于頸外動脈系統(tǒng)，但腫瘤的血液供應(yīng)也可能來源于頸內(nèi)動脈系統(tǒng)。

本研究嘗試探究JNA是否為血管瘤來源的腫瘤。2000年，NORTH等[17]首次報道了GLUT-1是嬰幼兒血管瘤特殊的細胞標(biāo)志物，提出了血管瘤胎盤起源的假設(shè)，為血管瘤的基礎(chǔ)研究及臨床診斷和治療提供了重要的依據(jù)。GLUT-1低水平表達于哺乳動物的胚胎和成熟組織中，但在缺氧環(huán)境中，其表達明顯增加，尤其見于惡性腫瘤細胞，且與腫瘤大小、侵襲程度、遠處轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有著密切關(guān)系。大多數(shù)學(xué)者認為，GLUT-1為區(qū)分血管瘤與血管畸形的特征性標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，JNA中GLUT-1的表達水平與血管畸形和鼻息肉的表達水平均無差異，與血管瘤的表達水平有明顯差異。GLUT-1主要位于JNA血管內(nèi)皮細胞中，提示鼻咽血管纖維瘤的本質(zhì)為一種血管畸形，可將其作為區(qū)別血管瘤與血管畸形的生物學(xué)指標(biāo)之一。

本研究同時對比了PCNA在JNA與血管瘤、血管畸形中的表達的異同，PCNA主要在細胞核內(nèi)合成表達，是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，參與調(diào)節(jié)DNA的合成，與細胞的增殖周期密切相關(guān)。PCNA能敏感地表現(xiàn)細胞的增殖狀態(tài)，高表達則說明細胞增殖越強，腫瘤侵襲性高[18]。探討血管瘤血管內(nèi)皮細胞PCNA表達的研究多認為，PCNA在血管瘤增殖期、消退早期和晚期的表達陽性率是依次遞減的，而在血管畸形標(biāo)本及正常血管標(biāo)本中均未見PCNA陽性表達。本實驗檢測了20例JNA組織中PCNA的表達，其在血管內(nèi)皮細胞中呈陰性表達，與血管畸形組和鼻息肉組無差異，與血管瘤組有明顯差異。從血管內(nèi)皮細胞的角度來看，PCNA的表達JNA與血管畸形和鼻息肉無差異。這一結(jié)果也支持JNA第一鰓弓起源的學(xué)說，JNA的本質(zhì)是先天性胚胎殘余的血管增殖畸形，而不是一種血管源性腫瘤。

既往研究顯示，從間質(zhì)細胞的角度看，JNA間質(zhì)成纖維細胞中PCNA的表達明顯高于血管畸形；JNA間質(zhì)成纖維組織部分細胞核表達PCNA，提示JNA中成纖維細胞具有增殖活性比血管畸形強的趨勢。這并不能反映前述的血管畸形的特征，可能與多因素參與腫瘤的發(fā)生過程有關(guān)。與此結(jié)論不同，本研究中JNA的間質(zhì)成纖維細胞見部分細胞核表達PCNA，但計數(shù)細胞的百分比后仍屬于表達陰性。尚不能表明JNA間質(zhì)成纖維細胞中PCNA的表達明顯高于血管畸形。

本研究尚存在一定的局限性，受發(fā)病率限制，收集的標(biāo)本數(shù)量尚不夠多，今后將收集更多JNA的病例，繼續(xù)深入探索其發(fā)病機制。總而言之，本研究表明，JNA的本質(zhì)為一種血管畸形，區(qū)別于血管瘤，可能是由先天性胚胎殘余的血管增殖畸形發(fā)生、發(fā)展而來，對于進一步預(yù)防及治療起到重要作用。