正交試驗(yàn)優(yōu)選羽扇豆醇提取工藝及液相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用(LC-MS)與氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用檢測(cè)比較

任天和 潘年松 羅 俊

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng)，550004；2 遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，遵義，563006)

馬棘(Indigofera Pseudotinctoria)是豆科，木藍(lán)屬小灌木。主要分布于云南、貴州、四川、湖南、湖北等地，也是優(yōu)質(zhì)的青飼料[1]。有研究發(fā)現(xiàn)在馬棘提取物石油醚層鑒定出羽扇烯酮，在同豆科的截葉鐵掃帚中，測(cè)得羽扇烯酮和羽扇豆醇含量均為主要成分[2-3]。羽扇豆醇屬于五環(huán)羽扇豆烷型三萜類(lèi)化合物，廣泛存在于無(wú)花果、葡萄、大豆等多種水果蔬菜中，具有抗腫瘤、抗氧化、降糖、抗炎、護(hù)肝等藥理活性[4-5]。

氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用(Liquid Chromatograph-mass Spectrographyr，LC-MS)和氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用(Gas Chromatography-mass Spectrography，GC-MS)均有很高的靈敏度與專(zhuān)屬性，結(jié)合質(zhì)譜對(duì)不同離子的響應(yīng)，可以快速定性分離化合物成分信息。在眾多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，在代謝組學(xué)中更是互為補(bǔ)充[6]。

1 材料

1.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品 馬棘種子(遵義綠普森農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司)；羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)品(成都普思生物科技股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：PS020067)。

1.2 儀器 液質(zhì)聯(lián)用儀(AB，美國(guó)，型號(hào)：SCIEX 4000Q trap LC-MS/MS)；LC色譜柱(AcclaimTM，美國(guó)，型號(hào)：120 C18 4.6 mm×150 mm 5 μm)；氣質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo ScientificTM，美國(guó)，型號(hào)：ISQTM7000單四極桿GC-MS)；GC色譜柱(Thermo，美國(guó)，型號(hào)：TG-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

2 方法

2.1 單因素試驗(yàn)

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)[7-11]報(bào)道，選取溶劑與時(shí)間2個(gè)因素，進(jìn)行馬棘種子提取單因素試驗(yàn)，烘干溶劑得浸膏。通過(guò)LC-MS檢測(cè)計(jì)算羽扇豆醇含量。

2.1.1 LC-MS含量檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品制備：精密稱(chēng)取4.0 mg樣品，溶解于1 mL甲醇中，超聲溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，4 ℃保存?zhèn)溆?。精密稱(chēng)取1.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于1 mL甲醇中，配成1 mg/mL濃度，過(guò)0.22 μm濾膜。并依次稀釋至320 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 LC-MS條件 流動(dòng)相：0.1%甲酸甲醇(0.1%甲酸水=90∶10)，進(jìn)樣量：1 μL，流速：0.8 mL/min。羽扇豆醇的準(zhǔn)確分子質(zhì)量：426.4，母離子：453.2，子離子：435.4，DP：102，CE：32。

2.2 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)。烘干樣品后通過(guò)GC-MS檢測(cè)分析羽扇豆醇最佳提取方案及影響因素。見(jiàn)表1。

表1 羽扇豆醇浸提工藝因素水平

2.2.1 GC-MS成分檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品制備：精密稱(chēng)取各樣品20 mg，溶于1 mL乙醚中，震蕩溶解后過(guò)0.45 μm濾膜，4 ℃保存?zhèn)溆?。精密稱(chēng)取1.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于1 mL乙醚中，過(guò)0.45 μm濾膜，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

GC-MS條件：根據(jù)唐超等[3]試驗(yàn)方法稍作調(diào)整，初始溫度40 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升溫至260 ℃，保持1 min，再以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min；氣化室溫度250 ℃；離子源溫度300 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為高純度氦氣；體積流量：1.0 mL/min；離子化模式：EI；電子能量：70 eV；溶劑延遲：12 min。質(zhì)譜掃描范圍：m/z 40～500。

2.2.2 羽扇豆醇定性及半定量分析 通過(guò)LC-MS檢測(cè)，對(duì)相同工藝提取的GC-MS檢測(cè)結(jié)果峰面積進(jìn)行等量代換，并對(duì)LC-MS檢測(cè)的其他峰面積進(jìn)行推導(dǎo)計(jì)算含量(M：浸膏總重；Y：稱(chēng)取重量)。

3 結(jié)果

3.1 LC-MS檢測(cè)單因素分析 LC-MS檢測(cè)結(jié)果計(jì)算含量顯示，羽扇豆醇在10倍液料比情況下比較溶劑與浸提時(shí)間2個(gè)因素。石油醚、浸提5 d、10倍液料比情況下羽扇豆醇含量最高。見(jiàn)表2。

表2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 GC-MS檢測(cè)正交試驗(yàn)分析

3.2.1 定性分析 如圖1所示羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)品A(18.37)與樣品B的保留時(shí)間大致相同，向樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品后出峰時(shí)間C(18.29)稍有提前。

表3 GC-MS半定量推導(dǎo)含量

采用中位數(shù)檢驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)排除第27號(hào)工藝后，對(duì)剩下26份數(shù)據(jù)按照羽扇豆醇含量降序排列，若數(shù)據(jù)為偶數(shù)，則中位數(shù)選取最中間2個(gè)數(shù)據(jù)(即第13號(hào)和第14號(hào))，求得其平均值，即中位數(shù)值為4 503.66 μg；工藝分別為95%乙醇、15 d、10倍液料比和95%乙醇、10 d、5倍液料比。根據(jù)降序排列可以看出最大提取含量工藝為石油醚，5 d、5倍液料比，最小值為95%乙醇、5 d、5倍液料比。且羽扇豆醇含量前25%基本均為石油醚作為溶劑所提取的工藝。

表4 LC-MS與GC-MS相同工藝下羽扇豆醇峰面積及含量

表5 LC-MS與GC-MS相同工藝檢測(cè)結(jié)果Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)結(jié)果

4 討論

采用提取方法包括水浴、熱回流、超聲、超臨界萃取等[12-16]，溶劑包括乙醇、甲醇、氯仿等浸膏中均檢測(cè)出羽扇豆醇[14-15,17]。但在高婷[14]的研究提到對(duì)山楂采用超聲提取羽扇豆醇，并對(duì)溶劑(氯仿、甲醇、80%乙醇)及用量與超聲時(shí)間進(jìn)行單因素考察發(fā)現(xiàn)，在40 mL氯仿中超聲45 min時(shí)提取效果最佳；并在枸骨葉中提取羽扇豆醇也通過(guò)單因素考察了溶劑(氯仿、乙酸乙酯、甲醇)及用量與提取方法[18]，最后發(fā)現(xiàn)用20 mL甲醇在40 ℃水浴16 h后超聲30 min時(shí)提取率最佳。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)馬棘種子提取羽扇豆醇的工藝進(jìn)行研究，采用了溶劑(95%乙醇、乙酸乙酯、石油醚)、時(shí)間(5 d、10 d、15 d)、液料比(5倍、10倍、20倍)3種因素對(duì)馬棘種子進(jìn)行提取率考察。以提取羽扇豆醇含量從大到小排序發(fā)現(xiàn)，其中含量前25%均為石油醚作為溶劑提取，但第27號(hào)樣品因石油醚提取，導(dǎo)致油脂含量過(guò)高，羽扇豆醇無(wú)法準(zhǔn)確被檢測(cè)。初步確定最佳工藝為石油醚、5倍液料比浸提5 d。但石油醚具有毒性，且難以回收，考慮對(duì)環(huán)境污染，及工業(yè)化大生產(chǎn)，不作為優(yōu)選考慮的溶劑。排除石油醚對(duì)應(yīng)的組別后，乙醇與乙酸乙酯相互交替，未見(jiàn)明顯區(qū)別。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)中采用95%乙醇提取，基本比乙酸乙酯作為溶劑提取率更高，且乙醇易回收，因此選取95%乙醇作為溶劑，在比較正交實(shí)驗(yàn)中，也同時(shí)與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相聯(lián)系。綜合上述考慮后得出馬棘提取羽扇豆醇工藝為95%乙醇、15 d、10倍液料比。

此外，對(duì)于LC-MS與GC-MS檢測(cè)結(jié)果的比較，在對(duì)肝臟及血清樣本的分析中，GC-MS比LC-MS多分離鑒定出50%的化合物[19]。且在檢測(cè)生物檢材中甲基異柳磷在LC-MS對(duì)樣品的處理比GC-MS檢測(cè)更為煩瑣[20]。對(duì)丙烯酰胺的含量檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)GC-MS/MS和LC-MS/MS 2種方法都具有定量限低、精密度好的特點(diǎn)[21]。但在相關(guān)文獻(xiàn)中并沒(méi)有對(duì)2種檢測(cè)方法結(jié)果的比較。而本實(shí)驗(yàn)采用了在相同工藝下的樣品，用LC-MS所測(cè)的含量與GC-MS峰面積進(jìn)行比較，推導(dǎo)其GC-MS所測(cè)羽扇豆醇的含量計(jì)算公式，以計(jì)算正交實(shí)驗(yàn)中羽扇豆醇含量的方法。本實(shí)驗(yàn)首次嘗試了對(duì)LC-MS與GC-MS所測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較及推導(dǎo)的方法，所計(jì)算結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但不同溶劑間對(duì)應(yīng)的比值有所差異。GC-MS一般是定性某成分的有無(wú)，不作為定量依據(jù)，其優(yōu)點(diǎn)是一次檢測(cè)可以獲得很多種物質(zhì)的信息，其缺點(diǎn)是定量不準(zhǔn)確。LC-MS值一般是作為定量依據(jù)，其優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，其缺點(diǎn)是1次只能檢測(cè)1個(gè)成分的含量。從本實(shí)驗(yàn)看，GC-MS的峰面積值似可以與LC-MS進(jìn)行大體含量推導(dǎo)。這為初步判斷GC-MS峰面積值提供了一個(gè)便捷方法，值得進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)，找出規(guī)律。