HEK293T細胞中NLRP3炎性小體活化體系的構建

羅 玲，趙 鍇

（中南大學湘雅三醫(yī)院血液科，長沙 410013）

NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性小體是一類存在于巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等免疫細胞胞漿中的多聚蛋白復合體，由NLRP3、凋亡相關點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC ）和胱冬肽酶-1（Cas-pase-1）三種蛋白組成［1-3］。NLRP3炎性小體作為天然免疫系統(tǒng)重要的組成部分［4-5］，在多種生理、病理過程中發(fā)揮著關鍵作用，可被入侵機體的病原微生物，如病毒、細菌、真菌等活化，同時也對損傷細胞釋放出來的自身物質(zhì)（如脂肪酸、ATP）和環(huán)境中的顆粒（如二氧化硅顆粒）等產(chǎn)生應答。該復合體活化后可通過Caspase-1誘導促炎細胞因子白細胞介素1β前體（pro-IL-1β）和白介素18前體（pro-IL-18）的成熟和分泌，同時激活打孔蛋白消皮素D（gasdermin D，GSDMD），促使GSDMD釋放出活性N端蛋白，隨后聚集在細胞膜上造成細胞膜孔形成，從而引起細胞焦亡［6-7］。研究表明，NLRP3炎性小體的異?；罨c關節(jié)炎、膿毒癥、痛風、硅肺、阿尓茨海默病、2型糖尿病、肥胖等急慢性炎癥疾病以及自身免疫性疾病密切相關［8-10］，因此，NLRP3炎性小體的活化調(diào)節(jié)機制以及靶向藥物開發(fā)一直是本領域關注的前沿熱點。

目前已有不少研究者提供了NLRP3炎性小體活化的研究方法，其中在HEK293T細胞中重建NLRP3炎性小體活化體系是一種簡便可行的方法［11-12］。由于HEK293T細胞中不表達NLRP3炎性小體組分，故轉(zhuǎn)染過表達該組分可以促使NLRP3炎性小體組裝并活化［11-12］。該重建方法為研究NLRP3炎性小體活化的調(diào)控機制（如蛋白間相互作用、翻譯后修飾［13-15］等）以及相關藥物的篩選提供了一個簡化的研究平臺。本研究旨在建立一種HEK293T細胞NLRP3炎性小體活化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與質(zhì)粒

HEK293T細胞凍存于本實驗室，原購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

質(zhì)粒pcDNA3.1（-）B-Flag-pro-IL-1β、pcDNA3.1（-）B-Flag-pro-Caspase-1、pcDNA3.1（-）B-Flag-ASC、pcDNA3.1（-）B-Myc-NLRP3為本實驗室常規(guī)構建［16］。

1.1.2 試劑耗材與儀器

試劑耗材有胎牛血清（Gibco）、培養(yǎng)基Dulbecco改良 Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（Gibco）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Trypsin-EDTA solution，0.25%）（Thermo fisher）、Nigericin（invivogen）、轉(zhuǎn)染試劑Linear Polyethylenimine 25000（Polysciences）、改良的 Minimal Essential Medium減血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）（Gibco）、Anti-IL-1β抗體（RD systems）、Anti-β-actin抗體（Cell Signaling Technology）、Anti-Flag-tag（Cell Signaling Technology）、Anti-Myc-tag（Cell Signaling Technol ogy）、細胞裂解液（Cell Lysis Buffer，CLB）（Cell signaling Technology）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（Thermo fisher）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）試劑盒（eBioscience）。儀器有37℃恒溫培養(yǎng)箱（Thermo fisher）、離心機（eppendorf）、洗脫搖床（江蘇榮華儀器制造有限公司）、酶標儀（Thermo Scientific）和ChemiDoc高靈敏度化學發(fā)光成像儀（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 HEK293T細胞培養(yǎng)

用DMEM完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）培養(yǎng)HEK293T細胞。于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行孵育，待細胞密度長至80%～90%后，經(jīng)0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃下消化3 min后，加入1 mL 293T細胞培養(yǎng)基停止消化過程，再以800 r/min離心細胞懸液5 min。重懸細胞并計數(shù)后，將293T細胞接種于細胞培養(yǎng)皿（24 孔板：4×105個/孔）中過夜，待細胞密度達到70%～80%時準備轉(zhuǎn)染工作。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在 1.5 mL Eppendorf中混勻質(zhì)粒 pro-IL-1β（每孔200 ng）、pro-Caspase-1（每孔100 ng）、ASC（每孔20 ng）、NLRP3（每孔100 ng）與Opti-MEM培基（每孔 50 μL）。在另一個 1.5 mL Eppendorf管中混勻Opti-MEM培養(yǎng)基（每孔50 μL）與Linear Polyethylenimine 25000轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染試劑按照3 μL轉(zhuǎn)染試劑對應1 μg質(zhì)粒的比例加入。再將稀釋的質(zhì)粒和稀釋的轉(zhuǎn)染試劑混合在一起，室溫下靜置15～20 min。將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合物逐滴滴入細胞中，并輕輕搖動細胞板，以避免局部出現(xiàn)高濃度轉(zhuǎn)染物，影響細胞活力。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細胞蛋白用于Western blot檢測，或者用250 μL DMEM完全培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后，加入10 μmol/L Nigericin，刺激1 h，收集細胞上清，2 000 r/min離心5 min去除細胞殘渣和碎屑，取50 μL利用ELISA檢測IL-1β的量。

1.2.3 Western blot檢測

將轉(zhuǎn)染處理后的細胞加入預冷的裂解液（CLB細胞裂解液、100 ×蛋白酶抑制劑PMSF和100 ×蛋白酶抑制劑cocktail）中收取蛋白樣本，BCA法測定蛋白濃度，將各蛋白樣品調(diào)整至等質(zhì)量，加入5 ×上樣緩沖液后，100℃煮10 min使蛋白變性。12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）上樣，電泳分離蛋白質(zhì)，再在260 mA穩(wěn)流中將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯［poly（vinylidene fluoride），PVDF］膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h后，一抗于4℃孵育過夜。TBST（50 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl和0.1% Tween-20配制而成）液洗膜3遍，每次10 min，再用對應二抗分別室溫孵育1 h，TBST液洗膜3遍，每遍10 min。最后用ChemiDoc高靈敏度化學發(fā)光成像儀顯出蛋白條帶。

1.2.4 ELISA

按照制造商的說明進行ELISA，檢測細胞上清液中IL-1β的含量。

1.2.5 統(tǒng)計分析

本試驗結果利用GraphPad Prism 9.0進行統(tǒng)計分析，試驗得到的數(shù)據(jù)通過單因素方差分析（One-Way ANOVA）計算得到P值，統(tǒng)計學顯著差異用*表示，其含義分別是*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.000 1。當*P＜0.05時，為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 HEK293T中驗證質(zhì)粒的表達

首先驗證構建質(zhì)粒的表達。將pro-IL-1β、pro-Caspase-1、ASC、NLRP3質(zhì)粒以及空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，24 h后，收取細胞總蛋白，通過Western blot檢測表達。結果顯示，所有質(zhì)粒均表達（圖1）。

圖1 Western blot驗證HEK293T細胞中質(zhì)粒的表達Fig. 1 The expression of plasmid in HEK293T cells was verified by Western blot

2.2 HEK293T中NLRP3炎性小體活性的檢測

NLRP3炎性小體活化的標志之一是產(chǎn)生成熟的IL-1β。IL-1β的前體（pro-IL-1β，相對分子質(zhì)量約為37 kD）可被Caspase-1切割形成成熟體（相對分質(zhì)子量為17 kD），成熟體通過細胞孔道釋放到細胞外，發(fā)揮生物活性［17］。因此，我們可利用Western blot 以及ELISA分別檢測細胞蛋白和上清中的IL-1β成熟體。

通過Western blot發(fā)現(xiàn)，只轉(zhuǎn)染pro-IL-1β或者只轉(zhuǎn)染部分NLRP3炎性小體組分（轉(zhuǎn)染ASC，或NLRP3和ASC共轉(zhuǎn)染）的細胞總蛋白中檢測不到IL-1β成熟體，只有轉(zhuǎn)染了NLRP3炎性小體全部組分的細胞總蛋白可檢測到IL-1β成熟體（圖2）。同時，利用ELISA檢測細胞上清中的IL-1β，得到的結果和Western blot檢測一樣（圖3）。以上結果說明，在HEK293T中構建NLRP3炎性小體活化體系成功。

圖2 Western blot檢測重建NLRP3炎性小體組分的HEK293T細胞總蛋白中的IL-1β成熟體Fig. 2 Detection of mature IL-1β in cell lysates from HEK293T cells reconstituted with NLRP3 inflammasome components by Western blot

圖3 ELISA檢測重建NLRP3炎性小體組分的HEK293T細胞上清中的IL-1βFig. 3 Detection of IL-1β in supernatants of HEK293T cells reconstituted with NLRP3 in flammasome components

2.3 NLRP3轉(zhuǎn)染量與NLRP3炎性小體活性正相關

為了進一步研究HEK293T中NLRP3炎性小體活化體系，我們固定ASC、Caspase-1以及pro-IL-1β的轉(zhuǎn)染量，同時轉(zhuǎn)染不同量的NLRP3（50、100、200 ng），發(fā)現(xiàn)隨著NLRP3轉(zhuǎn)染量的提高，無論是細胞中或者上清中IL-1β的成熟體都是逐漸增加的（圖4、5），并呈一個正相關的趨勢。以上結果說明，改變NLRP3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量可調(diào)整HEK293T中炎性小體活化的強度。

圖4 Western blot檢測不同NLRP3轉(zhuǎn)染量對HEK293T中重建炎性小體的影響Fig. 4 The effects of transfected NLRP3 amounts in reconstruction of inflammasome in HEK293T cells by Western blot

3 討論

HEK293T細胞來源于人胚胎腎上皮細胞，是一個研究外源基因表達的常用細胞系［18-20］。HEK293T細胞中不表達NLRP3炎性小體組分，自2006年首次報道在該細胞系中構建炎性小體活化體系后［21］，其逐漸成為用于體外研究NLRP3炎性小體活化的常規(guī)工具細胞系［11-12］。本研究首先驗證了質(zhì)粒NLRP3、ASC、Caspase-1以及pro-1β的表達，接著將不同量的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T中構建NLRP3炎性小體活化體系，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染缺少完整炎性小體組分的HEK293T細胞中幾乎檢測不到IL-1β成熟體，而轉(zhuǎn)染了NLRP3炎性小體所有組分后，則可檢測到IL-1β成熟體，說明NLRP3、ASC和Caspases-1是體外構建NLRP3炎性小體活化體系必不可少的元件，這也與之前的文獻報道相一致［11-12］。同時，我們在此基礎上對該體系進行了進一步的探索，發(fā)現(xiàn)在不改變ASC、Caspase-1以及pro-IL-1β的轉(zhuǎn)染量的情況下，增加NLRP3轉(zhuǎn)染量可促進更多IL-1β成熟體的產(chǎn)生。該結果提示，改變NLRP3轉(zhuǎn)染量可調(diào)控HEK293T細胞中炎性小體活化的強度，這也為不同實驗室在各自研究體系下優(yōu)化該系統(tǒng)提供了一定的參考。另外，我們還介紹了通過Western blot以及ELISA兩種方法檢測HEK293T中NLRP3炎性小體活化的情況，通過比對兩種方法的檢測效果可以發(fā)現(xiàn)，兩者提供的檢測效能較一致，因此，其他實驗室也可選擇任何一種方式來檢測炎性小體的活化。在這里，我們更推薦使用ELISA方法檢測，因為Western blot的操作流程復雜，完成一次操作的試驗時間較ELISA檢測更長，且ELISA的檢測結果是以數(shù)字形式呈現(xiàn)的，用于結果定量更加方便。綜上所述，我們提供了在HEK293T細胞中建立NLRP3炎性小體活化體系的方法，該方法的建立為后期進一步研究NLRP3炎性小體的調(diào)控機制奠定了基礎。

圖5 ELISA檢測不同NLRP3轉(zhuǎn)染量對HEK293T中重建炎性小體的影響Fig. 5 The effects of transfected NLRP3 amounts in reconstruction of inflammasome in HEK293T cells by ELISA