鏈霉菌Ahn75菌劑助劑的篩選及對(duì)水稻稻瘟病的防效研究

付祖姣，劉宇波，郭照輝，楊 華，羅容珺，劉 歡，畢世宇，肖 蓉，胡 展，劉萬鈞

（湖南省微生物研究院，長(zhǎng)沙 410009）

水稻是我國(guó)主要的糧食作物，常因稻瘟?。≧ice blast）的侵害導(dǎo)致稻谷減產(chǎn)、稻米品質(zhì)下降，程度嚴(yán)重時(shí)甚至稻谷絕收。稻瘟病是由半知菌類叢梗孢科、梨形孢屬稻梨孢菌（Magnaporthe oryzae）侵染水稻引起的病害，因侵染時(shí)期和部位的不同可分為苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟、谷粒瘟［1］。目前，水稻稻瘟病主要依靠化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期施用易誘發(fā)稻瘟病病原菌的抗藥性，且化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境、土壤會(huì)造成一定的污染，給食品安全和人類健康也帶來較大的隱患［2］。因此，開發(fā)新型高效生物農(nóng)藥，減少化學(xué)農(nóng)藥的施用，是滿足人類健康需求和可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的必要手段。

內(nèi)生鏈霉菌（endophyticStreptomyces）是新型的水稻稻瘟病生防資源，其獨(dú)特的內(nèi)生生境賦予了它豐富的抗生素生產(chǎn)能力和抗病能力。有研究人員從水稻中分離到了內(nèi)生吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）OsiSh-2，通過其分泌的抗生素、鐵載體和多種膜降解酶能抑制稻瘟病的生長(zhǎng)和繁殖，從而有效降低水稻葉瘟的發(fā)病率［3-5］。Patel等［6］發(fā)現(xiàn)，高粱內(nèi)生鏈霉菌SS1、SS5和SS8不僅能抑制水稻稻瘟病病原菌的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)水稻防御基因的表達(dá)上調(diào)，還能顯著促進(jìn)水稻莖的生長(zhǎng)。Ahn75是從海南水稻莖中分離的一株內(nèi)生灰褐色鏈霉菌（Streptomyces griseobrunneus），該菌株能高效抑制水稻稻瘟病菌的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，噴施水稻后能定殖在水稻的莖、葉和根部［7］，并有效降低水稻稻瘟病的發(fā)病率，提高稻谷產(chǎn)量，是一株具有較強(qiáng)生防和促生潛力的內(nèi)生鏈霉菌，可用于水稻的藥肥研制。但是，目前市場(chǎng)上還未見有效果較好的放線菌制劑出現(xiàn)，且內(nèi)生放線菌的田間防效與其定殖量密切相關(guān)，而其定殖水平又受環(huán)境、天氣和水稻生育期等多種因素的影響［8］。篩選能有效促進(jìn)放線菌孢子萌發(fā)、改善菌劑物理性能的助劑，對(duì)于提高放線菌的定殖水平和生防效果意義重大。

灰褐色鏈霉菌Ahn75在體外能高效抑制水稻稻瘟病病原菌12個(gè)不同生理小種的生長(zhǎng)，同時(shí)具有固氮、解鉀、產(chǎn)鐵載體等促生長(zhǎng)性能，還具有較強(qiáng)的鎘、砷和鉛耐受性能，是一株具有較大應(yīng)用潛力的生防菌株［9］。本研究以灰褐色鏈霉菌Ahn75為研究對(duì)象，通過分析不同的營(yíng)養(yǎng)物、分散劑、潤(rùn)濕劑、紫外保護(hù)劑和穩(wěn)定劑等對(duì)Ahn75孢子萌發(fā)、菌劑穩(wěn)定性和抗病效果的影響確定Ahn75菌劑的助劑優(yōu)化配比，為放線菌Ahn75菌劑的研制和產(chǎn)業(yè)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

拮抗菌株 Ahn75（登錄號(hào) ：CCTCC No. M 2019890）是本研究組從海南水稻健康莖中分離的內(nèi)生鏈霉菌。

1.1.2 水稻品種

選擇超優(yōu)千號(hào)系列‘湘兩優(yōu)900’用于稻瘟病拮抗菌株Ahn75的盆栽防效研究。該水稻品種是湖南年豐種業(yè)科技有限公司和湖南省雜交水稻研究中心培育的第五期超級(jí)稻高品質(zhì)軟米，稻瘟病綜合指數(shù)為5.3～5.8，穗瘟損失率最高級(jí)7級(jí)。

1.1.3 培養(yǎng)基

ISP2（international streptomyces program 2）培養(yǎng)基［10］：1%麥芽提取物（malt extract）、0.4%酵母提取物（yeast extract）、0.4%葡萄糖，pH 7.2。固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂，115℃高壓滅菌20 min，用于放線菌的培養(yǎng)。

燕麥培養(yǎng)基［11］：30 g 燕麥片用純水煮沸 1 h，4層紗布過濾除去沉淀，加入100 mL榨取的新鮮西紅柿汁和15 g瓊脂粉，純水定容至1 000 mL，pH 7.2，115℃高壓滅菌20 min。將其用于水稻稻瘟病病原真菌稻梨孢的孢子制備。

1.1.4 助劑

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括丙氨酸（alanine）、組氨酸（histi-dine）、酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨（peptone）、葉面肥（foliar fertilizer）；分散劑包括木質(zhì)素磺酸鈉（sodium lignosulfonate）、木質(zhì)素磺酸鈣（calcium lignosulfonate）、Morwet D425、吐溫80（Tween 80）；潤(rùn)濕劑包括拉開粉（Nekal）、Morwet EFW、十二烷基硫酸鈉（dodecyl sulfate，sodium salt，SDS）；紫外保護(hù)劑包括糊精（dextrin）、維生素C（VC）、維生素B2（VB2）、熒光素鈉（sodium fluorescein）；穩(wěn)定劑包括羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium）、海藻酸鈉（sodium alginate）、海藻酸鉀（potassium alginate）、黃原膠（xanthan gum）。所有助劑均為市售分析純或工業(yè)純。

1.2 研究方法

1.2.1 放線菌孢子懸浮液的制備

放線菌的孢子具有比菌絲更強(qiáng)的抗逆性能，且生存時(shí)間較長(zhǎng)，故本文選擇放線菌的孢子作為主要活性成分，用于放線菌劑助劑的篩選。

將放線菌Ahn75接入ISP2培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3～5 d，待培養(yǎng)皿上布滿孢子，用稱量勺刮取孢子粉至無菌的10 mL離心管中，用水溶液懸浮，配制Ahn75的孢子懸浮母液。對(duì)孢子懸浮母液進(jìn)行十倍梯度稀釋并涂布ISP2平板，3 d后統(tǒng)計(jì)平板菌落數(shù)，計(jì)算孢子懸浮母液中孢子的含量。使用時(shí)用無菌水將孢子懸浮液稀釋至合適的含量。

1.2.2 放線菌孢子促萌發(fā)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的篩選

丙氨酸、組氨酸等游離氨基酸和葉面肥可促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，常用作肥料或肥料添加劑，而麥芽提取物、酵母提取物和蛋白胨常用作放線菌、細(xì)菌培養(yǎng)的C/N源。本研究選擇這些可促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)或促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為研究對(duì)象，分析它們對(duì)Ahn75孢子萌發(fā)的影響，篩選適合放線菌孢子萌發(fā)的最佳營(yíng)養(yǎng)助劑。配置5.00%氨基酸、5.00%葉面肥、1.00%麥芽提取物、1.00%蛋白胨、0.50%酵母提取物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水溶液，均121℃高壓滅菌20 min。在 1.5 mL EP 管中分別加入 50 μL無菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水溶液、5 μL 109CFU/mL的孢子懸浮液、445 μL無菌水，混勻，28℃靜置培養(yǎng)，分別在24 和48 h取10 μL培養(yǎng)液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在相差顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)6個(gè)視野中萌發(fā)和未萌發(fā)的孢子數(shù)，并根據(jù)公式計(jì)算孢子的萌發(fā)率?？瞻讓?duì)照采用等體積無菌水替代營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其他處理方法與樣品處理一致。每個(gè)處理重復(fù)3次。

孢子萌發(fā)率按以下公式計(jì)算［12］：孢子萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)孢子數(shù)/（未萌發(fā)孢子數(shù)+萌發(fā)孢子數(shù)）×100。

1.2.3 放線菌菌劑潤(rùn)濕劑、分散劑的篩選

放線菌菌劑最佳分散劑、潤(rùn)濕劑根據(jù)劉振華等［13］、李姝江等［14］、王劍等［15］的研究選擇吐溫80、木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈣、Morwet D425、拉開粉、Morwet EFW、SDS進(jìn)行篩選。將不同種類的分散或潤(rùn)濕劑以0.50%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入ISP2培養(yǎng)基中，進(jìn)行高壓滅菌后制備該培養(yǎng)基的固體平板，然后取0.1 mL 102和103CFU/mL的孢子懸浮液分別涂布于含有不同潤(rùn)濕劑、分散劑的ISP2平板上28℃培養(yǎng)36～48 h。對(duì)照為不加其他物質(zhì)的ISP2平板，其余操作與處理一致。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)平板，記錄每個(gè)平板的菌落形成單位數(shù)（CFU值）。孢子萌發(fā)率（%）＝處理平板上的菌落數(shù)／對(duì)照平板上的菌落數(shù)×100。

根據(jù)含有不同潤(rùn)濕劑、分散劑平板上孢子萌發(fā)率水平的高低篩選有助于放線菌孢子萌發(fā)的最佳潤(rùn)濕劑和分散劑。

1.2.4 放線菌菌劑紫外保護(hù)劑的篩選

根據(jù)王劍等［15］、羅洋等［16］的研究分別檢測(cè)糊精、VC、VB2、熒光素鈉等紫外保護(hù)劑對(duì)鏈霉菌Ahn75孢子萌發(fā)及其對(duì)紫外線耐受性能的影響，篩選對(duì)Ahn75孢子萌發(fā)抑制小且可有效保護(hù)孢子抗紫外線照射的保護(hù)劑。

試驗(yàn)先將不同的紫外保護(hù)劑以0.50%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入ISP2培養(yǎng)基中，并制備該培養(yǎng)基的固體平板，然后取 0.1 mL 102和 103CFU/mL的孢子懸浮液涂布于該平板上，28℃培養(yǎng)36～48 h。對(duì)照為不加其他物質(zhì)的ISP2平板。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)平板，記錄每個(gè)平板的菌落形成單位數(shù)（CFU值）并根據(jù)1.2.3方法計(jì)算孢子的萌發(fā)率。

選擇萌發(fā)水平最高的紫外保護(hù)劑，分別以不同的質(zhì)量濃度加入ISP2培養(yǎng)基中進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)，篩選紫外保護(hù)劑的最佳促萌發(fā)質(zhì)量濃度。

同時(shí)，將各紫外保護(hù)劑分別按最佳促萌發(fā)質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入102～103CFU/mL的孢子懸浮液中，混合均勻后在超凈工作臺(tái)紫外燈（254 nm，15 W 光強(qiáng)，120 lx）下35 cm處照射2 min，取0.1 mL孢子懸浮液涂布于ISP2平板上，28℃培養(yǎng)36～48 h，記錄每個(gè)平板的菌落形成單位數(shù)（CFU值）。對(duì)照1取0.1 mL不加紫外保護(hù)劑且未經(jīng)紫外線照射的孢子懸浮液涂布ISP2平板，對(duì)照2取0.1 mL不加紫外保護(hù)劑但經(jīng)紫外線照射2 min的孢子懸浮液涂布ISP2平板。每個(gè)處理重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板的菌落形成單位數(shù)（CFU值），并根據(jù)1.2.3方法計(jì)算孢子萌發(fā)率，分析不同紫外保護(hù)劑處理下，孢子在紫外線照射下的萌發(fā)水平。

1.2.5 放線菌菌劑穩(wěn)定劑的篩選

根據(jù)張建萍等［17］的研究，選擇羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、海藻酸鉀、黃原膠等作為放線菌制劑的穩(wěn)定劑材料，分別將不同穩(wěn)定劑以0.15%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入ISP2培養(yǎng)基中，并制備該培養(yǎng)基的固體平板。取 0.1 mL 102和103CFU/mL 的孢子懸浮液涂布于該平板上，28℃培養(yǎng)36～48 h，記錄每個(gè)平板的菌落形成單位數(shù)（CFU值）。對(duì)照采用等體積無菌水代替穩(wěn)定劑。計(jì)算不同穩(wěn)定劑下Ahn75孢子的萌發(fā)率，分析不同穩(wěn)定劑對(duì)孢子萌發(fā)的影響。

將穩(wěn)定劑與109CFU/mL的孢子懸浮液混勻，在0～60 min內(nèi)的不同時(shí)間吸取懸浮液中段液體，測(cè)定其在370 nm 波長(zhǎng)處的吸光值，根據(jù)時(shí)間和吸光值的變化繪制圖表，并分析不同穩(wěn)定劑對(duì)孢子懸浮液的穩(wěn)定性能。

1.2.6 潤(rùn)濕劑和紫外保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

將促萌發(fā)效果最佳的潤(rùn)濕劑、分散劑分別以0.01%、0.02%、0.05%、0.10%、0.25%、0.50%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入ISP2固體培養(yǎng)基中，將最佳紫外保護(hù)劑分別按0.01%、0.02%、0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入ISP2固體培養(yǎng)基中，按1.2.3的方法進(jìn)行孢子萌發(fā)率的檢測(cè)，分析潤(rùn)濕劑、分散劑和紫外保護(hù)劑的最佳促萌發(fā)含量。

1.2.7 盆栽試驗(yàn)

將水稻種子在純水中浸泡30 min，剔除空秕粒后倒掉純水，用75%的乙醇表面消毒5 min，然后用1% NaClO浸泡5 min，無菌水清洗3～5次。將表面消毒后的種子裝入雙層塑料濾水籃的上層，加無菌水浸沒水稻種子，30℃催芽1 d。將催芽的種子轉(zhuǎn)移至每盆裝有800 g泥土的陶瓷盆中，每盆2顆，每個(gè)處理重復(fù)3次，以無菌水處理為空白對(duì)照。所有盆栽在自然狀態(tài)下培養(yǎng)。

分別將各種助劑按最佳質(zhì)量濃度與Ahn75孢子懸浮液混合，制備含有不同助劑的Ahn75菌劑，保持菌劑中Ahn75孢子含量不低于1×108CFU/mL。同時(shí)，按王玉雙等［18］的方法在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)水稻稻瘟病病原真菌稻梨孢菌株，待菌株充分產(chǎn)孢后，每皿用5 mL無菌水洗下孢子，制成每毫升105個(gè)病原真菌孢子的懸浮液。

將分蘗期水稻盆栽移至溫室中，分別將上述Ahn75菌劑噴施于不同的盆栽，空白處理以等體積純水代替。5 d后，將制備的稻瘟病孢子懸浮液噴施于所有盆栽，并保持90%以上濕度24 h以上，10 d后依據(jù)國(guó)際稻瘟病圃IRBN的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)各處理水稻葉瘟發(fā)病情況［19］，并根據(jù)以下公式計(jì)算水稻葉瘟發(fā)病率和病情指數(shù)，評(píng)估助劑協(xié)同Ahn75防治水稻葉瘟的效果。

發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100；

病情指數(shù) =［ Σ（ 各病級(jí)植株數(shù) × 各級(jí)代表數(shù)值）/調(diào)查總植株數(shù)×最高級(jí)別值］×100；

發(fā)病率防治效果（%） =［（對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率）/對(duì)照發(fā)病率］×100；

病情指數(shù)防治效果（%）=［（對(duì)照病指數(shù)-處理病指數(shù)）/對(duì)照病指數(shù)］×100。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)，采用SPSS19.0軟件（Duncan法）對(duì)不同處理間的差異進(jìn)行0.05和0.01水平顯著性分析。數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)放線菌孢子萌發(fā)的影響

分別檢測(cè)丙氨酸、組氨酸、麥芽提取物、酵母提取物、蛋白胨、水稻葉面肥對(duì)鏈霉菌Ahn75孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)Ahn75孢子的萌發(fā)有不同程度的促進(jìn)作用（圖1、表1）。培養(yǎng)24 h后，葉面肥處理下的孢子萌發(fā)顯著，肉眼可見培養(yǎng)液中有明顯的菌絲團(tuán)出現(xiàn)，相差顯微鏡下可觀察到數(shù)團(tuán)菌絲球。通過統(tǒng)計(jì)萌發(fā)孢子和未萌發(fā)孢子數(shù)量可得出葉面肥培養(yǎng)下的孢子萌發(fā)率達(dá)到（54.33±11.43）%。此外，與對(duì)照相比較，蛋白胨、酵母提取物、丙氨酸、組氨酸和麥芽提取物均能顯著促進(jìn)鏈霉菌孢子的萌發(fā)，但其促進(jìn)水平顯著低于葉面肥（表1）。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48 h時(shí)，酵母提取物的促孢子萌發(fā)效果與葉面肥相當(dāng)，均達(dá)到90%以上。兩者之間的萌發(fā)率經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，差異不顯著。其次為蛋白胨，0.10%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)的孢子萌發(fā)率為（67.92±8.29）%。0.50%組氨酸對(duì)孢子萌發(fā)的影響與0.10%的麥芽提取物效果相當(dāng)，并優(yōu)于0.50%的丙氨酸（表1）。綜合顯微觀察和統(tǒng)計(jì)的結(jié)果，可選擇葉面肥或酵母提取物作為Ahn75的營(yíng)養(yǎng)助劑。

圖1 不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)Ahn75孢子萌發(fā)的影響（400×）Fig. 1 Effects of different nutrients on Ahn75 spore germination (400×)

表1 不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)下鏈霉菌Ahn75孢子的萌發(fā)水平Tab. 1 The germination levels of Streptomyces Ahn75 spores cultured with different nutrients unit: %

2.2 不同潤(rùn)濕劑、分散劑對(duì)放線菌孢子萌發(fā)的影響

分別檢測(cè)4種分散劑和3種潤(rùn)濕劑對(duì)鏈霉菌Ahn75孢子萌發(fā)率的影響，結(jié)果顯示（表2），液體分散劑吐溫80、木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈣在0.50%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下均與Ahn75孢子具有較佳的生物相容性，孢子萌發(fā)率為93.50%～94.73%，其中吐溫80表現(xiàn)最佳，但三者處理下的孢子萌發(fā)率與對(duì)照的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示差異不顯著（P＞0.05），而0.50% Morwet D425則完全抑制了孢子的萌發(fā)，培養(yǎng)4 d后，孢子萌發(fā)率依然為0。在潤(rùn)濕劑中，3種被檢潤(rùn)濕劑對(duì)孢子萌發(fā)均有一定程度的抑制，其中，0.50%拉開粉對(duì)孢子萌發(fā)影響最小，其2 d的萌發(fā)率為（89.78±5.28）%；0.50% SDS處理下，孢子萌發(fā)率雖然與拉開粉處理下的孢子萌發(fā)率沒有顯著性差異，但其萌發(fā)時(shí)間與對(duì)照和拉開粉相比延長(zhǎng)了2 d；而Morwet EFW則完全抑制了鏈霉菌孢子的萌發(fā)，培養(yǎng)4 d后的孢子萌發(fā)率依然為0。因此，上述7種分散潤(rùn)濕劑中，吐溫80作為易獲得且對(duì)孢子萌發(fā)影響小的物質(zhì)，可選作Ahn75孢子的分散劑。

在此基礎(chǔ)上，本文繼續(xù)考察了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80對(duì)Ahn75孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果顯示（表3），當(dāng)吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.050%時(shí)，Ahn75孢子萌發(fā)率最高，達(dá)到（124.49±4.92）%，比對(duì)照萌發(fā)水平提高了24.49%。因此，吐溫80為Ahn75孢子分散劑的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.050%。

表3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80處理下Ahn75孢子的萌發(fā)水平Tab. 3 The germination levels of Ahn75 spores treated with different concentrations of Tween 80 unit: %

2.3 不同紫外保護(hù)劑對(duì)放線菌孢子萌發(fā)及紫外保護(hù)的影響

分別檢測(cè)了4種常規(guī)紫外保護(hù)劑對(duì)Ahn75鏈霉菌孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果顯示（表4），糊精和熒光素鈉能顯著促進(jìn)Ahn75孢子的萌發(fā)（P＜0.05），其中糊精的促萌發(fā)效果最顯著（P＜0.01），在0.50%糊精處理下，Ahn75孢子萌發(fā)率達(dá)到（141.77±4.76）%，比對(duì)照孢子萌發(fā)率提高了41.77%，而VC和VB2對(duì)孢子萌發(fā)的影響差不多，低于對(duì)照和其他處理，但與對(duì)照相比差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同紫外保護(hù)劑處理下Ahn75孢子的萌發(fā)水平Tab. 4 The germination levels of Ahn75 spores treated with different UV protective unit: %

通過檢測(cè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)糊精對(duì)Ahn75孢子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.50%以上時(shí)，能顯著促進(jìn)Ahn75孢子的萌發(fā)，且1.00%的糊精比0.50%的糊精具有更顯著的促孢子萌發(fā)效果（表5）。因此，可選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%的糊精作為紫外保護(hù)劑。

表5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的糊精處理下Ahn75孢子的萌發(fā)水平Tab. 5 The germination levels of Ahn75 spores treated with different concentrations of dextrin unit: %

考慮到紫外保護(hù)劑對(duì)菌劑更重要的作用是其對(duì)功能菌株的紫外保護(hù)功能，故本研究繼續(xù)考察了各紫外保護(hù)劑在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%時(shí)Ahn75孢子紫外線照射后的萌發(fā)水平，結(jié)果如表6所示。從表6中可知，與未經(jīng)紫外線照射的對(duì)照1相比，經(jīng)紫外線照射2 min后的對(duì)照2孢子萌發(fā)率顯著降低（P＜0.01），存活率僅為（45.31±3.93）%，但添加了糊精并經(jīng)紫外線照射后的孢子萌發(fā)率比未添加紫外保護(hù)劑但經(jīng)紫外線照射的CK2孢子萌發(fā)率顯著提高（P＜0.05），說明糊精能有效保護(hù)Ahn75孢子免受紫外線照射的傷害。此外，VB2的添加與CK2相比，孢子萌發(fā)差異不顯著，而VC和熒光素鈉的添加使Ahn75孢子萌發(fā)率顯著降低。由此可見，VB2、VC和熒光素鈉不能保護(hù)Ahn75孢子免受紫外線傷害。

表6 不同紫外保護(hù)劑對(duì)Ahn75孢子抗紫外線保護(hù)水平Tab. 6 The UV protection levels of different UV protective on Ahn75 spores unit: %

綜合各紫外保護(hù)劑對(duì)Ahn75孢子萌發(fā)及紫外線保護(hù)的水平，本文選擇糊精作為Ahn75菌劑的紫外保護(hù)劑。

2.4 不同穩(wěn)定劑對(duì)放線菌孢子萌發(fā)及孢子懸浮液穩(wěn)定性的影響

分別檢測(cè)羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、海藻酸鉀和黃原膠4種穩(wěn)定劑與Ahn75孢子的生物相容性，結(jié)果顯示，4種穩(wěn)定劑中，海藻酸鈉對(duì)鏈霉菌孢子的生物相容性最佳，當(dāng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的海藻酸鈉處理時(shí)，Ahn75孢子萌發(fā)率為（97.67±17.59）%，其次為海藻酸鉀和羧甲基纖維素鈉，黃原膠處理下孢子萌發(fā)率最低（表7）。但各穩(wěn)定劑處理后的孢子萌發(fā)率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均不顯著。

表7 不同穩(wěn)定劑處理下Ahn75孢子的萌發(fā)水平Tab. 7 The germination levels of Ahn75 spores treated with different stabilizers unit: %

根據(jù)生物相容性結(jié)果，本文選擇羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉和海藻酸鉀三種穩(wěn)定劑，分析了它們對(duì)孢子懸浮劑的穩(wěn)定性能，結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，加入海藻酸鈉后，孢子懸浮液在370 nm處的吸光度值下降最緩慢，30 min后才降至最低值，而加入羧甲基纖維素鈉和海藻酸鉀后，孢子懸浮劑的吸光度值分別在2 min和15 min內(nèi)降至最低值。該結(jié)果說明，加入海藻酸鈉的孢子懸浮液的穩(wěn)定性維持時(shí)間最長(zhǎng)，其次為羧甲基纖維素鈉和海藻酸鉀。

圖2 不同穩(wěn)定劑處理下Ahn75孢子懸浮液的吸光度變化曲線Fig. 2 The absorbance curves of Ahn75 spore suspension mixed with different stabilizers

綜合穩(wěn)定劑和Ahn75孢子的生物相容性及其對(duì)孢子懸浮液的穩(wěn)定水平，可選擇海藻酸鈉作為Ahn75孢子的穩(wěn)定劑。

2.5 Ahn75菌劑對(duì)水稻稻瘟病的生物防效

考慮到吐溫的分散促萌發(fā)效果較好，本文將Ahn75菌劑以適量孢子和0.05%的吐溫水溶液進(jìn)行基本配置，然后分別將葉面肥或酵母提取物、糊精和海藻酸鈉按最佳含量與Ahn75孢子吐溫懸浮液混合，配制成含0.50%葉面肥、0.05%酵母提取物、1.00%糊精、0.15%海藻酸鈉和混合助劑的Ahn75菌劑。分蘗期噴施處理盆栽水稻，發(fā)現(xiàn)葉面肥等助劑均能顯著降低水稻葉瘟的發(fā)病率和病情指數(shù)（表8），其中葉面肥、酵母提取物和混合助劑對(duì)葉瘟發(fā)病率的影響最顯著，生物防效達(dá)25.91%～31.81%，而酵母提取物、糊精和混合助劑對(duì)葉瘟病情指數(shù)影響最顯著，生物防效達(dá)31.36%～38.06%。

表8 添加不同助劑的Ahn75菌劑處理后水稻葉瘟發(fā)病情況Tab. 8 Incidence of rice leaf blast treated with Ahn75 agents with different adjuvants unit: %

3 討論

利用生防微生物活體對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治，不僅可以避免化學(xué)農(nóng)藥和農(nóng)用抗生素造成的自然選擇壓力，還可增加土壤有益微生物的豐度，有效改善土壤的微生態(tài)結(jié)構(gòu)，其前景廣闊［20］。但微生物制劑的防效受田間環(huán)境和定殖水平等因素影響存在不穩(wěn)定性［21］。選擇合適的微生物助劑，除了可改善微生物產(chǎn)品的分散性、懸浮率、穩(wěn)定性等性能［13］，還能增加制劑的表面張力和滲透能力［21］，最終提高功能微生物的藥效［22］，是潛力巨大的微生物產(chǎn)品能否走向市場(chǎng)最為關(guān)鍵的一步。

不過，對(duì)于以活菌為主要有效成分的微生物產(chǎn)品來說，功能微生物在制劑中的存活水平是其發(fā)揮作用的前提。為了更好地利用水稻內(nèi)生鏈霉菌Ahn75阻斷稻瘟病病原菌孢子在水稻葉片上的傳播，本研究以Ahn75的孢子為研究對(duì)象，通過液體和固體兩種培養(yǎng)方式檢測(cè)了不同助劑對(duì)鏈霉菌孢子萌發(fā)的影響，分析了紫外保護(hù)劑和穩(wěn)定劑對(duì)孢子懸浮液性能的影響，并評(píng)估了各助劑對(duì)Ahn75生物防效的影響。研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)普遍能促進(jìn)鏈霉菌孢子的萌發(fā)，以營(yíng)養(yǎng)成分豐富的葉面肥、酵母提取物的促萌發(fā)效果最顯著，而常用于放線菌和細(xì)菌培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分蛋白胨和麥芽提取物以及葉面肥中常出現(xiàn)的促生長(zhǎng)氨基酸組氨酸和丙氨酸雖也能促進(jìn)孢子的萌發(fā)，但效果卻遠(yuǎn)低于葉面肥和酵母提取物，可能營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的營(yíng)養(yǎng)成分更有助于孢子的萌發(fā)。此外，在幾種被檢的其他助劑中，大部分物質(zhì)對(duì)Ahn75的孢子未表現(xiàn)出顯著的促萌發(fā)和抑制萌發(fā)作用，但分別可用于分散劑和紫外保護(hù)劑的吐溫和糊精卻具有顯著的促孢子萌發(fā)作用。吐溫80是一種最常用的乳化劑，它不僅可以降低懸浮液的表面張力，提高孢子在水中的分散度, 而且能促進(jìn)某些真菌孢子的萌發(fā)［23］。張擁軍等［24］也發(fā)現(xiàn)糊精與粘帚霉孢子具有較好的生物相容性，且能有效保護(hù)其孢子免受紫外線的傷害。而兩個(gè)潤(rùn)濕劑候選物質(zhì)Morwet D425和EFW卻表現(xiàn)出了與其他研究者不一致的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，Morwet D425和EFW以0.50%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在時(shí)能完全抑制Ahn75孢子的萌發(fā)。潘以樓等［25］也發(fā)現(xiàn)，Morwet D425和EFW在12.5～100.0 g/L的質(zhì)量濃度下能完全殺滅短小芽孢桿菌TW-2的菌體和芽胞。但也有研究發(fā)現(xiàn)，Morwet D425和EFW與枯草芽孢桿菌B99-2、B5具有較好的生物相容性，并被用于這兩株生防菌可濕性粉劑的助劑［16，26］。由此可知，同樣的助劑不一定適配不同的功能微生物，對(duì)于每一種功能微生物來說，都需要篩選最合適的助劑。

此外，本文還進(jìn)一步通過盆栽試驗(yàn)證實(shí)了助劑對(duì)Ahn75孢子懸浮液的增效作用，特別是酵母提取物和混合助劑對(duì)鏈霉菌孢子抗稻瘟病的增效作用顯著高于其他單一助劑。綜合考慮各助劑對(duì)菌劑抗病性能和物理性狀的作用，可以確定將酵母提取物、吐溫、糊精和海藻酸鈉一起與鏈霉菌孢子進(jìn)行復(fù)配，是生產(chǎn)鏈霉菌菌劑的最佳選擇。

本文在微生物制劑主要性能檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，雖然助劑與鏈霉菌孢子生物相容性都表現(xiàn)出較好的效果，但助劑對(duì)菌劑性能，特別是抗紫外線性能和穩(wěn)定性能的改善還有待加強(qiáng)。與化學(xué)農(nóng)藥和其他微生物菌劑相比，該菌劑對(duì)水稻稻瘟病的防治效果還達(dá)不到市場(chǎng)應(yīng)用需求?？赡茉蛴腥阂皇寝卓咕杲臃N頻率過低，菌株在水稻內(nèi)部定殖數(shù)量可能有限，導(dǎo)致能在水稻體內(nèi)發(fā)揮作用的功能菌株豐度較低；二是本次助劑篩選范圍不夠廣，可用助劑的使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)有待進(jìn)一步優(yōu)化，特別是紫外保護(hù)劑對(duì)菌株的紫外防護(hù)功能還有待提升，能促進(jìn)鏈霉菌孢子定殖水稻組織的助劑還有待進(jìn)一步篩選；三是內(nèi)生鏈霉菌定殖水稻的最佳時(shí)期和環(huán)境條件等有待進(jìn)一步探究，獲得內(nèi)生菌定殖水稻的最佳條件可使用最少量的菌劑達(dá)到最大的生物防效，不僅節(jié)約了微生物菌劑的成本，還能提高其生物防效。

未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物產(chǎn)品的施用將主要依賴于無人機(jī)作業(yè)，以避免傳統(tǒng)人工噴施勞動(dòng)強(qiáng)度大、效率低等問題。因此，為潛在生防微生物菌株篩選能提高微生物液體菌劑的分散性、穩(wěn)定性、環(huán)境耐受性和定殖力的助劑將是未來生物制劑的主要研究方向之一。