化學(xué)吸收劑單乙醇胺強(qiáng)化小球藻生長(zhǎng)代謝及固碳效應(yīng)的研究

張效銘，劉穎穎，崔紅利，張春輝，薛金愛(ài)，季春麗，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

工業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展和世界人口的劇增是全球溫室氣體濃度增加的主要原因。自工業(yè)革命以來(lái)，大氣中CO2濃度已從大約0.55 mg/m3上升到現(xiàn)在的0.79 mg/m3［1］。直到今天，世界一次能源需求仍由化石燃料（如煤、石油、天然氣等）滿(mǎn)足，同時(shí)在未來(lái)的很長(zhǎng)一段時(shí)間，化石能源還將繼續(xù)在能源結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位，這將導(dǎo)致化石燃料日益枯竭，CO2排放量持續(xù)增加?！疤歼_(dá)峰，碳中和”的任務(wù)目標(biāo)已被提出。應(yīng)對(duì)CO2排放這一問(wèn)題的有效途徑之一是以經(jīng)濟(jì)可行的形式對(duì)CO2進(jìn)行生物固定并轉(zhuǎn)化為高值產(chǎn)品，如生物柴油、多糖、活性蛋白等［2］。微藻長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是唯一有潛力替代化石柴油的生物柴油來(lái)源，是減少溫室氣體的主要碳匯原料。微藻具有較高的生長(zhǎng)速率和CO2固定能力，并富含多種高附加值產(chǎn)物，其CO2固定效率是C3植物的10～50倍。微藻還具有可利用發(fā)電廠煙道廢氣和其他工業(yè)尾氣為無(wú)機(jī)碳源，利用市政廢水和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢水為營(yíng)養(yǎng)源（N、P等）等優(yōu)點(diǎn)。因此，利用微藻固定煙氣CO2聯(lián)產(chǎn)高附加值產(chǎn)品構(gòu)建低碳、綠色的資源化利用的新能源體系，被列為我國(guó)面向2050年能源可持續(xù)發(fā)展的潛力研究方向之一［3］。

然而，微藻生物固碳的CO2捕獲率還比較低，這是因?yàn)镃O2在微藻培養(yǎng)體系中吸收傳質(zhì)效率較低，而CO2傳質(zhì)過(guò)程是影響微藻生長(zhǎng)及固碳效率的關(guān)鍵因素。而且大多數(shù)微藻在CO2體積分?jǐn)?shù)高于5%時(shí)生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，而工業(yè)煙氣中CO2含量在10%～20%，嚴(yán)重限制了微藻規(guī)?；潭–O2和高值產(chǎn)物的積累［4-5］。因此，選育能耐受高濃度CO2的優(yōu)良藻株、提高培養(yǎng)效率和降低培養(yǎng)成本是微藻固碳技術(shù)領(lǐng)域的首要任務(wù)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者在提高微藻CO2固定效率和產(chǎn)物積累方面做了廣泛深入的研究。在藻液中添加CO2吸收劑可以有效地改善培養(yǎng)液的氣體傳質(zhì)效率，緩解因高濃度CO2造成的培養(yǎng)液酸化問(wèn)題，促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)代謝，提高固碳效率。有研究者提出，在培養(yǎng)基中加入碳酸氫鈉（NaHCO3），通過(guò)連續(xù)供應(yīng)1%的CO2氣體，可以提高小球藻的生長(zhǎng)速率、CO2的利用率和油脂產(chǎn)率［6］。然而，大量碳酸鹽的加入不僅增加微藻的培養(yǎng)成本，還會(huì)導(dǎo)致pH值上升，超過(guò)微藻的最佳培養(yǎng)要求。微藻細(xì)胞易受高鹽度影響，從而不利于其生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致微藻同步高效固定CO2和積累代謝產(chǎn)物無(wú)法實(shí)現(xiàn)。將醇胺類(lèi)化合物等化學(xué)吸收劑添加至微藻培養(yǎng)體系中可有效避免上述問(wèn)題。醇胺類(lèi)化合物的添加可以提高培養(yǎng)液初始pH及平衡穩(wěn)定pH，使培養(yǎng)液具有pH緩沖能力。除此之外，其還可顯著地提高培養(yǎng)液無(wú)機(jī)碳溶解度，并改變?nèi)芙庑蕴荚葱螒B(tài)的比例，提高CO2在培養(yǎng)液中的溶解傳質(zhì)能力，進(jìn)而提高微藻固定CO2的效率和生物質(zhì)產(chǎn)率。因此，醇胺類(lèi)化合物在微藻培養(yǎng)體系中的應(yīng)用因其高效性、可資源化和多藻適用性而受到廣泛關(guān)注［7-9］。

本實(shí)驗(yàn)室從大同電廠附近水域分離純化出一株生長(zhǎng)速率快且能耐高濃度CO2的經(jīng)自然環(huán)境酸馴化的優(yōu)良小球藻種質(zhì)。該藻種可以在高濃度CO2下持續(xù)生長(zhǎng)，而在此條件下，添加化學(xué)吸收劑是否可以進(jìn)一步提高該藻的固碳能力及生物量和產(chǎn)物積累還有待驗(yàn)證。因此，本文以大同電廠小球藻為研究對(duì)象，探討在高濃度CO2下添加不同質(zhì)量濃度的單乙醇胺（monoethanolamine，MEA）對(duì)微藻生長(zhǎng)、油脂積累和光合活性等生理生化特征的影響，為深入理解微藻固碳機(jī)制和微藻高效固碳聯(lián)產(chǎn)高值產(chǎn)品應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藻株

試驗(yàn)所用小球藻Chlorellasp.為實(shí)驗(yàn)室從大同電廠附近水域篩選純化所得，保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)條件

將小球藻單藻落藻細(xì)胞接種于250 mL錐形瓶中，加入100 mL BG11培養(yǎng)基，將藻液放在連續(xù)光照強(qiáng)度為1 000 lx和溫度為25℃的環(huán)境中培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的50 mL藻液接種到裝有600 mL BG11培養(yǎng)基的柱狀光生物反應(yīng)器中，使得接種后的藻液質(zhì)量濃度為0.1 g/L。溫度設(shè)置為25℃，光照強(qiáng)度為6 000 lx，CO2體積分?jǐn)?shù)為20%，通氣比為0.33，連續(xù)通氣培養(yǎng)10 d，設(shè)置5組試驗(yàn)組，分別添加0、50、100、200、300 mg/L MEA，以 0 mg/L MEA為對(duì)照，每組設(shè)置3組平行。在接種后第2、4、6、8、10 d取樣測(cè)定培養(yǎng)液pH、生物量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)，在培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定色素和油脂含量。

1.3 生物量的測(cè)定

取一定體積的藻液V（mL），通過(guò)真空抽濾裝置將其過(guò)濾到預(yù)先稱(chēng)好的質(zhì)量為W0（g）的孔徑為0.45 μm的醋酸-硝酸纖維混合微孔濾膜（使用前沸水煮3次并烘干）上，然后將濾有藻細(xì)胞的濾膜放在烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)其重量記為W1（g）。根據(jù)公式（1）計(jì)算生物量密度C（ g/L）。

根據(jù)公式（2）計(jì)算生物量產(chǎn)率Poverall［g/（L·d）］。

C0（g/L）為初始生物量質(zhì)量濃度；Ct（g/L）為培養(yǎng)結(jié)束后生物量質(zhì)量濃度；t（d）為培養(yǎng)時(shí)間。

1.4 色素含量的測(cè)定

采用比色法測(cè)定微藻中色素的含量。取5 mL藻液 4 500 r/min 離心 10 min，棄上清液后向沉淀中加入與藻液等體積的95%乙醇，充分震蕩后置于 75℃水浴鍋水浴 15 min，冷卻后 4 500 r/min離心10 min，用分光光度計(jì)測(cè)上清液在665、649和470 nm的吸光度（optical density，OD），根據(jù)公式（3～5）［10］計(jì)算藻細(xì)胞中葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量濃度CChla、CChlb和CCa（rmg/L）。

根據(jù)藻液離心前的生物量密度以及加入量，可將各色素質(zhì)量濃度換算成色素含量（mg/g，細(xì)胞干重）。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

取3 mL藻液放入遮光比色皿，暗處理5 min后，使用Handy-PEA葉綠素?zé)晒鈨x（Hansatech Instruments Ltd，英國(guó)）測(cè)定其相關(guān)光合參數(shù)——最大光能轉(zhuǎn)換效率（maximum photochemical quantum yield of PSII，F(xiàn)v/Fm）、實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率［effective photo-chemical quantum yield of PSII，Y（Ⅱ）］、光化學(xué)淬滅系數(shù)（coefficient of photochemical fluorescence quenching，qP）和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（non-photochemical quenching，NPQ）。測(cè)定光反應(yīng)條件下Y（Ⅱ）'和光合有效輻射量（photo-synthetically active radiation，PAR）值，根據(jù)公式（6）計(jì)算相對(duì)電子傳遞速率（electron transport rate，ETR）值。各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的含義如表1所示。

表1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)Tab. 1 Chlorophyll fluorescence parameters

1.6 CO2固定率和CO2利用率的計(jì)算

根據(jù)公式（7）計(jì)算CO2固定率Fc［（g CO2/（L·d）］。

其中微藻生物量中的碳含量按50%估算［11］；12（g/mol）和44（g/mol）分別表示碳和CO2的相對(duì)分子質(zhì)量。

根據(jù)公式（8）計(jì)算CO2利用率Ec。

V（L）為藻液體積；mc1（g/d）為每天通入培養(yǎng)基中CO2的質(zhì)量；mc2（g/d）為每天通入培養(yǎng)基空氣中CO2的質(zhì)量。

1.7 總脂含量的測(cè)定

采用氯仿-甲醇萃取法測(cè)定微藻中的總脂含量。稱(chēng)取0.05 g左右的凍干藻粉A1（g）放入研缽并加入適量石英砂，在研缽中充分研磨后加入5 mL甲醇和2.5 mL氯仿，將混合物轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，并高速振蕩5 min使其均勻混合，然后將離心管密封置于37℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床24 h，之后取出離心管8 000 r/min離心5 min，收集上清液到新的離心管中；再向沉淀管中加入5 mL甲醇和2.5 mL氯仿，高速震蕩5 min后置于37℃搖床2 h，取出后再次離心，并取上清與之前收集的上清液合并。觀察藻渣顏色，如未抽提干凈，再重復(fù)上述步驟1～2次。向合并的上清液中加入5 mL氯仿和9 mL 1% NaCl溶液，漩渦震蕩混勻，保證最終體系為V（甲醇）∶V（氯仿）∶V（1% NaCl）=2.0∶2.0∶1.8。將混合液8 000 r/min離心 10 min，將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一預(yù)先稱(chēng)重A2（g）的玻璃管中，用氮吹儀在60℃下將溶液吹干，待氯仿?lián)]發(fā)干凈后，再將玻璃管置于55℃真空干燥箱中烘干3 h，冷卻后稱(chēng)其重量A3（g），根據(jù)公式（9）、（10）計(jì)算總脂含量TL（%）和產(chǎn)率PLipid［（mg（/L·d）］。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度MEA對(duì)培養(yǎng)基pH的影響

培養(yǎng)液pH是影響微藻生長(zhǎng)及CO2高效固定的重要因素。為了研究不同質(zhì)量濃度的MEA在20%CO2條件下對(duì)生物培養(yǎng)基pH的影響，本文測(cè)試了藻液pH隨時(shí)間的變化趨勢(shì)（圖1）。培養(yǎng)第0天時(shí)，不添加MEA的培養(yǎng)基在通入20% CO2后，pH下降到了5.35，隨著添加MEA質(zhì)量濃度的增加，pH也隨之升高，MEA質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，pH升高到6.22。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，藻液pH在不加MEA和加入低質(zhì)量濃度的MEA（50 mg/L）時(shí)呈現(xiàn)隨時(shí)間逐漸上升的趨勢(shì)，而加入較高質(zhì)量濃度的MEA（＞50 mg/L）時(shí)，藻液pH隨時(shí)間呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。但整體而言，加入MEA后藻液的pH在高濃度CO2下波動(dòng)范圍有所減小，由常規(guī)培養(yǎng)時(shí)的5.35～6.87（0 mg/L MEA）縮小為5.81～6.44（300 mg/L MEA）。

圖1 不同質(zhì)量濃度MEA對(duì)藻液pH的影響Fig. 1 Effects of different mass concentrations of MEA on the pH in the culture medium

2.2 不同質(zhì)量濃度MEA對(duì)小球藻生長(zhǎng)、固碳效應(yīng)及油脂積累的影響

干重是表征藻細(xì)胞生長(zhǎng)情況的重要指標(biāo)。從圖2可以看出：當(dāng)MEA質(zhì)量濃度由0 mg/L增加至100 mg/L時(shí)，小球藻生物量比對(duì)照顯著提高；當(dāng)MEA質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，培養(yǎng)10 d的小球藻干重達(dá)到最大值3.07 g/L，是對(duì)照組生物量的1.44倍；而MEA質(zhì)量濃度為200和300 mg/L時(shí)，培養(yǎng)10 d的小球藻生物量分別為2.08和1.63 g/L，較對(duì)照分別降低了2.5%和23.3%。這表明，適宜質(zhì)量濃度的MEA可促進(jìn)小球藻在高濃度CO2下的生長(zhǎng)，而高質(zhì)量濃度MEA卻會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng)。

圖2 不同質(zhì)量濃度MEA對(duì)小球藻干重的影響Fig. 2 Effects of different mass concentrations of MEA on the dry weight of Chlorella sp.

在不同質(zhì)量濃度MEA的作用下，小球藻對(duì)CO2固定效率差異顯著。如表2所示，小球藻在0～100 mg/L的MEA條件下，CO2固定效率顯著上升，MEA質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，CO2固定效率和CO2利用率達(dá)到最大值，分別為0.55 g/（L·d）和0.27%，比對(duì)照組分別提高了44.7%和42.1%。當(dāng)MEA質(zhì)量濃度提高至200～300 mg/L時(shí)，CO2固定效率較對(duì)照組顯著下降，且隨著質(zhì)量濃度的升高呈下降趨勢(shì)。這說(shuō)明，適宜質(zhì)量濃度的MEA在微藻培養(yǎng)體系中可提高小球藻的CO2固定效率和利用率。

表2 不同質(zhì)量濃度MEA培養(yǎng)的小球藻的最大生物量（Ct）、總生物量生產(chǎn)率（Poverall）、CO2固定率（Fc）和CO2利用率（Ec）Tab. 2 The maximum biomass concentration (Ct), overall biomass productivity (Poverall), CO2 fixation rates (Fc) and CO2 utilization efficiency(Ec) of Chlorella sp. under different MEA mass concentrations

油脂是微藻重要的代謝產(chǎn)物之一，添加適量質(zhì)量濃度的MEA可顯著增加微藻中的油脂含量，油脂產(chǎn)率也有較為顯著的提升。如圖3所示，當(dāng)MEA質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，油脂含量達(dá)到最大值23.5%，油脂產(chǎn)率達(dá)到71 mg/（L·d），分別比對(duì)照組高21.7%和77.5%。

圖3 不同質(zhì)量濃度MEA對(duì)小球藻總脂含量和產(chǎn)率的影響Fig. 3 Effects of different mass concentrations of MEA on the lipid content and productivity of Chlorella sp.

2.3 不同質(zhì)量濃度MEA對(duì)小球藻色素積累和光合特性的影響

MEA的添加對(duì)小球藻的色素積累和光合特性也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。從圖4可以看出，隨著MEA質(zhì)量濃度的升高，小球藻的色素積累呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。從色素質(zhì)量濃度來(lái)看，在50 mg/L的MEA質(zhì)量濃度下色素積累最多，葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量濃度分別為23.6、9.2和6.9 mg/L，分別是對(duì)照組的1.42、1.51和1.35倍。當(dāng)MEA質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，色素積累呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在200和300 mg/L MEA質(zhì)量濃度下，色素積累量相比對(duì)照組明顯下降，當(dāng)MEA質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素的含量分別比對(duì)照組下降了40.0%、37.8%和46.9%。從色素含量來(lái)看，在50 mg/L的MEA質(zhì)量濃度下色素含量最多，葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素的含量分別為7.7、3.3和2.4 mg/g，分別是對(duì)照組的1.11、1.18和1.04倍，當(dāng)MEA質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素的含量分別比對(duì)照組下降了18.8%、15.7%和30.8%。

圖4 不同質(zhì)量濃度MEA對(duì)小球藻色素質(zhì)量濃度的影響Fig. 4 Effects of different mass concentrations of MEA on pigment content of Chlorella sp.

不同質(zhì)量濃度的MEA對(duì)小球藻光合特性的影響如圖5所示，在培養(yǎng)的第0天（通入CO2后），Y（Ⅱ）和qP趨近于0，F(xiàn)v/Fm值為0.50左右，低于正常值0.65，而NPQ值較高。這是因?yàn)楦邼舛菴O2對(duì)小球藻的生長(zhǎng)有抑制作用。小球藻通過(guò)提高熱耗散保護(hù)處于脅迫下的光合作用系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)2 d的延滯期后，其光合活性逐漸恢復(fù)。第4天小球藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)和ETR達(dá)到最高，隨后逐漸降低。就整體趨勢(shì)而言，添加50和100 mg/L MEA的小球藻光合活性要高于對(duì)照組，而添加200和300 mg/L MEA的小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)低于對(duì)照組。MEA質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，小球藻的光合活性最強(qiáng)，固碳的電子傳遞速率最快，F(xiàn)v/Fm、Y（Ⅱ）、qP和ETR值達(dá)到最大，說(shuō)明適量質(zhì)量濃度的MEA可以提高小球藻的光合活性。

圖5 不同質(zhì)量濃度MEA對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig. 5 Effects of different mass concentrations of MEA on chlorophyll fluorescence parameters of Chlorella sp.

3 討論

3.1 MEA對(duì)藻液pH的影響

pH是影響微藻生長(zhǎng)和CO2生物固定的重要生理參數(shù)，這是因?yàn)閜H決定了培養(yǎng)基中用于微藻生長(zhǎng)碳源的形態(tài)比例分布和濃度［12-13］，其中和 CO2是微藻代謝優(yōu)先吸收的碳源［14］。小球藻培養(yǎng)的理想pH接近中性（7.00～8.00），而本試驗(yàn)對(duì)照組的pH值在5.20左右時(shí)（圖1），小球藻依然可以正常生長(zhǎng)。從大同電廠附近水域分離得到的小球藻Chlorellasp.比其他小球藻更耐高濃度CO2，即使在酸性更高的培養(yǎng)基中也能保持生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)樵撛逯晔菑呐欧潘嵝詮U氣廢水的電廠附近分離出來(lái)的，生境的特殊性決定了其對(duì)高濃度CO2和酸性環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。pH還會(huì)調(diào)控培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素（如磷酸鹽、鐵和銨等）的形態(tài)，這同樣是影響微藻生長(zhǎng)代謝的原因之一［15-16］。圖1的pH變化趨勢(shì)表明，添加50 mg/L MEA的處理組pH值維持在5.7左右，因此，添加適當(dāng)質(zhì)量濃度的MEA可使培養(yǎng)液具有pH緩沖能力，使培養(yǎng)液pH維持在適宜微藻生長(zhǎng)的范圍內(nèi)，為微藻創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)環(huán)境。

3.2 MEA對(duì)小球藻生長(zhǎng)、固碳效應(yīng)及油脂積累的影響

醇胺類(lèi)化合物作為一類(lèi)具有優(yōu)異的吸收活性和高效的CO2脫除效率的化學(xué)吸收劑頗受關(guān)注［17］，在微藻固碳領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用。王兆印等［18］和Cardias等［19］研究發(fā)現(xiàn)，添加適當(dāng)濃度的二乙醇胺（diethanolamine，DEA）可以提高培養(yǎng)液的氣液傳質(zhì)系數(shù)，增大CO2氣液傳質(zhì)速率，從而使藻細(xì)胞生物量和CO2固定效率較未添加DEA的對(duì)照組提高25.6%和41.2%。孫中亮［20］研究了MEA、DEA、三乙醇胺（triethanolamine，TEA）、N-甲基二乙醇胺（N-methyldiethanolamine，MDEA）對(duì)二形柵藻（Scenedesmus dimorphus）生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，添加MEA、DEA、TEA、MDEA與對(duì)照（0.62 d-1）相比，生長(zhǎng)速率均有提高，分別為0.65、0.63、0.66和0.65 d-1。與其他醇胺類(lèi)吸收劑相比，MEA與培養(yǎng)基中的CO2發(fā)生反應(yīng)更有利于碳酸氫鹽離子的穩(wěn)定生成［21］，從而進(jìn)一步促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，添加適宜質(zhì)量濃度的MEA對(duì)小球藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且CO2固定效率和CO2利用率均得到顯著的提升。但高質(zhì)量濃度的MEA對(duì)小球藻的生長(zhǎng)卻產(chǎn)生抑制作用（圖2），這與Rosa等［8］的研究結(jié)果相似。其研究結(jié)果顯示：添加100和200 mg/L的MEA對(duì)ChlorellafuscaLEB 111生長(zhǎng)有抑制作用 ；在300 mg/L MEA的條件下，生物量質(zhì)量濃度在培養(yǎng)1 d后就開(kāi)始下降。這可能是由于培養(yǎng)體系中高質(zhì)量濃度MEA會(huì)與CO2反應(yīng)生成過(guò)量的有毒中間體氨基甲酸酯及MEA本身的胺腐蝕效應(yīng)所致，其反應(yīng)原理如下所示。反應(yīng)（1）是MEA與CO2在物質(zhì)的量的比為2∶1的條件下反應(yīng)生成氨基甲酸酯的步驟，反應(yīng)（2）是氨基甲酸酯中間體的水解步驟，生成碳酸氫鹽離子

碳向微藻生物質(zhì)組分的轉(zhuǎn)化取決于培養(yǎng)環(huán)境和條件，如CO2濃度、溫度、光照強(qiáng)度和營(yíng)養(yǎng)元素濃度等。通常情況下，微藻在營(yíng)養(yǎng)缺乏等不利環(huán)境條件脅迫下，其細(xì)胞傾向于將具有更高能量密度的脂質(zhì)作為一種長(zhǎng)期的能量?jī)?chǔ)存形式［23-24］。本研究結(jié)果顯示，在 CO2體積分?jǐn)?shù)為20%的條件下，添加50和100 mg/L的MEA時(shí)，小球藻的油脂含量都要高于對(duì)照，高碳環(huán)境和化學(xué)吸收劑的聯(lián)合作用可能會(huì)對(duì)微藻培養(yǎng)體系造成一定程度的脅迫，從而改變微藻細(xì)胞內(nèi)油脂代謝途徑，使其積累更多的油脂。有研究表明：在高碳條件脅迫下，參與合成油脂的丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase complex，PDHC）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl coA carboxylase，ACC）相關(guān)的基因表達(dá)均有所上調(diào)；中間產(chǎn)物丙酮酸鹽能更多地轉(zhuǎn)移到丙二酰輔酶A和丙二酰載體蛋白上，與短碳鏈反應(yīng)生成長(zhǎng)碳鏈，強(qiáng)化了脂肪酸合成途徑，從而使微藻中油脂含量增加［25］。Zhu等［26］研究了在15% CO2下聚乙二醇200（polyethylene glycol 200，PEG200）對(duì)微擬球藻積累油脂的影響，結(jié)果表明，1 mmol/L PEG200濃度下脂質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到最大值0.44 g/L。PEG200的加入會(huì)提高微藻生長(zhǎng)前期的比生長(zhǎng)速率，導(dǎo)致培養(yǎng)液氮缺乏，氮饑餓脅迫環(huán)境會(huì)促進(jìn)微藻細(xì)胞油脂的積累。

3.3 MEA對(duì)小球藻色素積累和光合特性的影響

微藻培養(yǎng)體系中CO2濃度對(duì)微藻生長(zhǎng)代謝具有重要的影響［27］，適當(dāng)?shù)腃O2濃度有利于微藻對(duì)培養(yǎng)體系中無(wú)機(jī)碳的光合同化，從而促進(jìn)微藻生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累，而高濃度的CO2會(huì)抑制小球藻的光合作用。CO2的體積分?jǐn)?shù)超過(guò)10%對(duì)大部分的微藻生長(zhǎng)具有抑制作用［28］，這可能是由高濃度CO2導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化造成的。而細(xì)胞內(nèi)的酸化可能是由碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）失活導(dǎo)致的，CA是微藻CO2濃縮機(jī)制（CO2-concentrating mechanism，CCM）的關(guān)鍵限速酶，具有維持酸堿平衡、CO2及碳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)等功能［29］。在高濃度CO2條件下，CA活性受到抑制［30］，胞內(nèi)酸堿度失衡，進(jìn)而導(dǎo)致卡爾文循環(huán)中碳同化速率降低。

在微藻生長(zhǎng)過(guò)程中，藻體顏色的變化是其生理變化的宏觀體現(xiàn)。為了探究在高碳環(huán)境下不同MEA質(zhì)量濃度對(duì)小球藻光合作用的影響，本研究首先對(duì)小球藻色素積累進(jìn)行了測(cè)定。色素是植物光合作用的基礎(chǔ)，其含量的高低可反映植物光合功能的強(qiáng)弱［31-32］。微藻細(xì)胞體內(nèi)的色素種類(lèi)可依據(jù)在光合作用過(guò)程中的作用分為捕光色素和光保護(hù)色素。葉綠素a、葉綠素b為捕光色素，可以將吸收的光能有效地傳遞到相關(guān)的反應(yīng)中心轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，而類(lèi)胡蘿卜素作為光保護(hù)色素可將剩余能量吸收，避免膜體受傷，從而達(dá)到光保護(hù)作用，通過(guò)光合作用產(chǎn)生的色素含量的多少可以判斷藻類(lèi)的生理狀態(tài)［33-34］。本研究結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的MEA造成了小球藻色素含量產(chǎn)生較大差異，在50和100 mg/L MEA條件下，色素含量較無(wú)MEA處理組有所提高，而200和300 mg/L MEA的添加卻抑制了小球藻色素的積累。

為了進(jìn)一步探究在高濃度CO2條件下MEA對(duì)小球藻光合作用的影響，我們對(duì)其葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行了測(cè)定。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)是分析植物光合活性及外界因素對(duì)其產(chǎn)生影響的鑒定技術(shù)［35］，能在一定程度上反應(yīng)藻細(xì)胞的光合活性和固碳電子傳遞效率狀況。常見(jiàn)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)有Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP、NPQ和ETR等。在正常條件下，F(xiàn)v/Fm值變化幅度較小，且不受物種和生長(zhǎng)條件的影響，受到脅迫時(shí)該值顯著降低［36］。本研究發(fā)現(xiàn)，MEA的添加會(huì)影響微藻的光合特性，添加50和100 mg/L MEA可以緩解高濃度CO2對(duì)微藻光合造成的抑制作用。但隨著MEA質(zhì)量濃度的進(jìn)一步升高，微藻的光合活性卻有所下降，F(xiàn)v/Fm、qP、Y（Ⅱ）、ETR值逐漸降低，表明高質(zhì)量濃度的MEA使光系統(tǒng)的開(kāi)放程度和電子傳遞效率降低，吸收、捕獲及傳遞電子的能力減弱。MEA與CO2反應(yīng)生成的氨基甲酸酯是一類(lèi)基于受體結(jié)構(gòu)的光合作用光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑，其作用靶標(biāo)是質(zhì)體醌還原前的PSⅡ與PSⅠ之間QA與PQ間的電子傳遞體β蛋白，氨基甲酸酯與其結(jié)合后會(huì)改變蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)構(gòu)，抑制電子從束縛性質(zhì)體醌QA向質(zhì)體醌QB傳遞，影響光合電子傳遞，從而影響藻細(xì)胞光合活性［37-38］。而NPQ值逐漸增大，微藻吸收的能量一部分用于光合作用，一部分多余的能量以熱能的形式耗散掉［39］，此現(xiàn)象利于保護(hù)光合結(jié)構(gòu)，使得藻細(xì)胞對(duì)脅迫環(huán)境做出了一定的自我保護(hù)，增加對(duì)脅迫環(huán)境的適應(yīng)性［40］。

利用微藻固定并轉(zhuǎn)化CO2是控制煙氣碳排放和緩解溫室效應(yīng)的一項(xiàng)非常有前景的技術(shù)。選育可耐受高濃度CO2的藻種是實(shí)現(xiàn)微藻固碳產(chǎn)業(yè)的首要前提，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高微藻固碳效率和高效積累微藻碳代謝產(chǎn)物是推動(dòng)微藻固碳聯(lián)產(chǎn)高附加值產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。本試驗(yàn)以在火力發(fā)電電廠附件自然水域中篩選獲得的一株可耐高濃度CO2的小球藻（Chlorellasp.）為研究對(duì)象，研究了添加不同質(zhì)量濃度化學(xué)吸收劑MEA對(duì)小球藻生長(zhǎng)、生理和油脂積累的影響。研究結(jié)果表明，添加MEA可以緩解因高濃度CO2造成的培養(yǎng)基酸化現(xiàn)象，在50 mg/L的MEA處理下，小球藻生物量、油脂含量及產(chǎn)率、固碳效率均顯著升高。因此，基于化學(xué)吸收劑的微藻生長(zhǎng)代謝及固碳性能強(qiáng)化策略是同時(shí)實(shí)現(xiàn)生物能源生產(chǎn)與廢氣資源化利用的有效途徑。但化學(xué)吸收劑在強(qiáng)化微藻固碳方面的具體作用機(jī)制，如化學(xué)吸收劑強(qiáng)化作用下微藻細(xì)胞內(nèi)部固碳代謝途徑變化、微藻固碳動(dòng)力學(xué)研究及不同吸收劑間的協(xié)同作用機(jī)理等尚不清楚，在今后的工作中應(yīng)針對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行多角度逐層揭示。