鄭時玉,郭亞男
(寧波市臨床病理診斷中心組織病理科,浙江 寧波 315000)
甲狀腺癌(thyroid carcinoma)是臨床十分常見的惡性腫瘤,約占所有內(nèi)分泌腫瘤的95%。甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。在甲狀腺癌的分型中,甲狀腺乳頭狀癌(PTC)約占所有甲狀腺癌的80%,其發(fā)病率遠高于其他病理類型。雖然大部分患者經(jīng)手術(shù)、放射碘治療后預(yù)后較好,但仍有少數(shù)患者會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。因此,有必要進一步深入研究甲狀腺癌的致病機理及其相關(guān)分子機制,為甲狀腺癌的治療提供新的靶點和方向。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)是2009 年Ulrike S等[1]用差異RT-PCR 的方法分析結(jié)腸黏膜、結(jié)腸癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶之間基因表達的異同,進而發(fā)現(xiàn)了新基因MACC1。c-Met 是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體,它與HGF 結(jié)合后,胞內(nèi)區(qū)發(fā)生自身磷酸化,從而激活下游信號通路,導(dǎo)致細胞發(fā)生增殖、侵襲等生物學(xué)行為。MACC1 在細胞核內(nèi)與c-Met 的啟動子結(jié)合后可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)c-Met 的表達[1]。目前,c-Met 及MACC1 蛋白已被報道在胃癌[2]、肺癌[3]、結(jié)腸癌[4]、聲門癌[5]、骨肉瘤[6]等中存在高表達水平,并被證實與患者病理參數(shù)密切相關(guān);然而在甲狀腺乳頭狀癌中表達較少,尤其是MACC1 在甲狀腺癌中的表達罕見報道。本研究通過檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中c-Met 及MACC1 蛋白的表達,旨在探討其與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關(guān)性。
1.1 材料 收集2014 年1 月-2020 年6 月寧波市臨床病理診斷中心的甲狀腺石蠟標本90 例,其中甲狀腺乳頭狀癌60 例,良性甲狀腺疾病30 例(甲狀腺腺瘤15 例,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫15 例)。甲狀腺癌患者年齡26~74 歲,其中男15 例,女45 例。所有抽取病例術(shù)前均未進行放化療及免疫治療。本研究已通過中心倫理委員會批準,取得患者知情同意,并簽署知情同意書。
1.2 主要試劑 c-Met 兔抗人多克隆抗體及MACC1兔抗人多克隆抗體均為abcam 公司產(chǎn)品。SP 試劑及DAB 顯色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
1.3 方法 所有石蠟以4 μm 厚度進行連續(xù)切片,經(jīng)脫蠟至水。免疫組化染色采用EnVison 兩步法:檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù),PBS 浸洗2 次,各5 min,0.3%H2O2室溫孵育10 min,抗原熱修復(fù),以1∶200 稀釋比例滴加c-Met 兔抗人多克隆抗體或MACC1 兔抗人多克隆抗體后4 ℃過夜,PBS 浸洗3 次,各5 min,滴加生物素標記二抗室溫孵育30 min,PBS 浸洗3 次,各5 min,DAB 顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水,用中性樹脂封片。分別以膀胱癌及結(jié)腸癌石蠟組織作為陽性對照,以PBS 代替一抗作為陰性對照。
1.4 結(jié)果判定 c-Met 及MACC1 蛋白的陽性染色呈棕黃色或棕褐色,c-Met 蛋白主要定位于細胞膜和細胞質(zhì),MACC1 蛋白主要定位于細胞質(zhì)。染色強度計分:0 分為無染色,1 分為淡黃色,2 分為棕黃色,3分為棕褐色;染色范圍計分:無染色細胞為0 分,<25%為1 分,25%~50%為2 分,>50%為3 分;總分為兩者相加,0~2 分記為陰性(-),3~6 分記為陽性(+)。染色結(jié)果判讀由2 位病理醫(yī)師獨立完成。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。免疫組化結(jié)果表達強度的比較及與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗。表達結(jié)果的相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 c-Met 及MACC1 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達c-Met 蛋白主要定位于甲狀腺濾泡上皮細胞的細胞膜及細胞質(zhì),見圖1。甲狀腺乳頭狀癌中c-Met 蛋白陽性率為51/60(85.00%),高于良性甲狀腺疾病中的6/30(20.00%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.388,P<0.05);MACC1 蛋白主要定位于甲狀腺濾泡上皮細胞的細胞質(zhì),見圖2。甲狀腺乳頭狀癌中MACC1 蛋白表達陽性率為40/60(66.67%),高于良性甲狀腺疾病中的2/30(6.67%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=28.929,P<0.05)。
圖1 c-Met 在甲狀腺乳頭狀癌及良性甲狀腺組織中的表達(EnVision×100)
圖2 MACC1 在甲狀腺乳頭狀癌及良性甲狀腺組織中的表達(EnVision×100)
2.2 c-Met 蛋白及MACC1 蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中表達的相關(guān)性 Spearman 相關(guān)性檢驗顯示,在甲狀腺乳頭狀癌中c-Met 蛋白與MACC1 蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.394,P<0.05),見表1。
表1 c-Met 和MACC1 表達的相關(guān)性
2.3 c-Met 蛋白及MACC1 蛋白與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關(guān)系 MACC1 蛋白在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌的陽性表達率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);c-Met 蛋白在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌的陽性表達率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而不同年齡、性別、腫塊大小c-Met 蛋白及MACC1 蛋白陽性表達率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。
表2 c-Met 和MACC1 在不同患者中的表達(n,%)
c-Met 基因定位于人7 號染色體長臂(7q31),其編碼產(chǎn)物主要存在于上皮細胞膜和細胞質(zhì)中,是受體酪氨酸蛋白激酶家族中的成員,包含7 個外顯子和6 個內(nèi)含子。MACC1 作為HGF/c-Met 信號通路的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在細胞核內(nèi)與c-Met 的啟動子結(jié)合后可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)c-Met 的表達[1]。近幾年國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),MACC1、c-Met 蛋白在結(jié)腸癌[4]、胃癌[2]、肺癌[3]、骨肉瘤[6]等多種常見腫瘤中高表達,且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性。另外最近幾年,針對c-Met 及MACC1 與疾病發(fā)生的具體機制也在做深入的研究[7-10],胃癌及膽管癌中MACC1 可以通過TWIST1/VEGF-A 信號通路促使血管形成,從而誘導(dǎo)腫瘤的進展[11,12];Zheng D 等[13]證實LncRNA MACC1-AS1/MACC1 通過調(diào)節(jié)新陳代謝活動促進膠質(zhì)瘤的發(fā)展。還發(fā)現(xiàn)MACC1 除了之前發(fā)現(xiàn)的和HGF/MET 通路的關(guān)系外,還與SP1[14]等其他信號分子相關(guān)。Hohmann T 等[15]發(fā)現(xiàn)MACC1 還可以促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞運動的改變。還有學(xué)者探討了MACC1 的多態(tài)性對肝細胞肝癌的影響及臨床參數(shù)相關(guān)性[16]。國內(nèi)也有報道證實c-Met 在甲狀腺乳頭狀癌中高表達[17,18]。馬澤忠等[19]發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌的血清中MACC1 高表達。也有文獻報道在乳腺癌中血清MACC1 是一個新的預(yù)測指標[20]。但MACC1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌石蠟切片中的表達罕見報道。
本研究結(jié)果顯示,c-Met 及MACC1 蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性表達率均高于良性甲狀腺疾病,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Spearman 相關(guān)性檢驗結(jié)果表明,c-Met 與MACC1 蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達呈正相關(guān)(r=0.394,P<0.05);MACC1 蛋白在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌的陽性表達率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而不同年齡、性別、腫塊大小c-Met 蛋白及MACC1 蛋白陽性表達率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);c-Met 蛋白在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌的陽性表達率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。既往的文獻報道均顯示c-Met 在甲狀腺乳頭狀癌中高表達,但c-Met與不同臨床病理參數(shù)如之間的關(guān)系不同,分析原因可能與選取標本不同、試劑廠商不同、實驗條件不同等多因素相關(guān),今后還需要收集更多標本及用更多論文數(shù)據(jù)來綜合分析判斷。c-Met 和MACC1 二者在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體協(xié)作機制有待進一步研究。
綜上所述,MACC1 及c-Met 蛋白可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展過程,在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生及演進過程中發(fā)揮重要的作用,MACC1 的發(fā)現(xiàn)為HGF/c-Met 通路研究提供了新的思路,為今后甲狀腺癌的診斷及靶向治療提供新的方向。