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    CCL2 高表達(dá)與低級別膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的相關(guān)性

    2022-09-09 10:13:34黃志杰馬月龍陳雅娟
    醫(yī)學(xué)信息 2022年15期
    關(guān)鍵詞:共表達(dá)趨化因子膠質(zhì)瘤

    黃志杰,馬月龍,陳雅娟

    (福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350108)

    低級別膠質(zhì)瘤(low-grade gliomas,LGG)又稱腦膠質(zhì)瘤,簡稱膠質(zhì)瘤,是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)上皮腫瘤[1],具有進(jìn)展快、預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高、致死率高的特點(diǎn)。2021 年世界衛(wèi)生組織將膠質(zhì)瘤從Ⅰ級(最低級別)到Ⅳ級(最高級別)進(jìn)行分類,LGG通常包括Ⅰ級膠質(zhì)瘤和Ⅱ級膠質(zhì)瘤[2]。LGG 約占原發(fā)性腦腫瘤的20%,典型的LGG 患者為年齡在30~40 歲的年輕人,多因癲癇發(fā)作而就醫(yī)[3]。LGG 患者具有生存期長、自然病史長、彌散性生長、臨床預(yù)后差異性大等特點(diǎn),使得觀察與積極干預(yù)的治療決策至關(guān)重要。促使LGG 獲得全面高效治療的措施成為目前神經(jīng)腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。趨化因子是一類能夠趨化細(xì)胞定向移動的小分子分泌蛋白,趨化因子配體2 [chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2]又名單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1,MCP-1),是趨化因子中的一員,由于其在癌癥免疫治療中起著重要的作用[4],因此成為趨化因子中CC 亞族的重要成員。CCL2 于1989 年從單核細(xì)胞中純化和克隆得到[5]。研究表明,CCL2 不僅對單核細(xì)胞,還對巨噬細(xì)胞[6]、記憶T 細(xì)胞[7]、自然殺傷(NK)細(xì)胞都具有趨化活性,從而將這些細(xì)胞募集到組織損傷和炎癥反應(yīng)的部位[8]。CCL2 在許多類型的細(xì)胞中表達(dá),這些細(xì)胞在外周循環(huán)和組織中的抗病毒免疫反應(yīng)中具有重要作用[9]。近年來,關(guān)于趨化因子與癌癥進(jìn)展之間關(guān)系的報(bào)道日益增多。CCR2 是CCL2 在人體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的最主要受體。有研究發(fā)現(xiàn)[10],CCL2-CCR2 在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、創(chuàng)造腫瘤微環(huán)境(TME)過程中具有多種作用。且已有研究表明,CCL2-CCR2 信號軸參與了包括乳腺癌[11]、前列腺癌[12]、肺癌[13]、肝細(xì)胞癌[14]、胰腺癌[15]、膀胱癌[6]、鼻咽癌[16]和腎癌[17]的發(fā)生和進(jìn)展。因此,許多臨床研究已將CCL2-CCR2 軸確定為早期診斷和不良預(yù)后的預(yù)測依據(jù)[18]。同時(shí)也有研究在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中趨化因子的表達(dá)中檢測到CCL2 信使RNA[19]。但目前CCL2 在LGG 進(jìn)展中的具體作用機(jī)制以及預(yù)后價(jià)值尚缺乏相關(guān)的研究報(bào)道。本研究主要關(guān)注CCL2 在LGG 中的表達(dá)及預(yù)后,同時(shí)研究CCL2 共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò),分析其在LGG 中的潛在作用機(jī)制,構(gòu)建CCL2 相關(guān)基因的LGG 患者預(yù)后模型,旨在為LGG 臨床預(yù)后診斷提供支持。

    1 資料與方法

    1.1 CCL2 基因表達(dá)分析 基于GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)的TCGA 癌癥數(shù)據(jù)分析LGG 組織與正常組織中CCL2 基因的mRNA 表達(dá)差異(http://gepia.cancer-pku.cn/)。其中LGG 組織樣本有518 例,正常組織有207 例。|log2FC≥1|和P<0.05 被認(rèn)為存在顯著性差異。

    1.2 CCL2 基因生存分析 下載TCGA 數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中的LGG 樣本信息,使用R包“survival”進(jìn)行CCL2 表達(dá)的生存分析,并通過“survivalROC”分析ROC 曲線。其中用于生存分析具有完整臨床信息的樣本有506 例。對數(shù)秩檢驗(yàn)P值(Log-rankP)<0.05 被認(rèn)為存在顯著性差異。

    1.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted correlation network analysis,WGCNA)使用R 語言中的“WGCNA”包進(jìn)行分析。選擇β=5 的冪和無標(biāo)度R2=0.95作為軟閾值參數(shù),構(gòu)建共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)。

    1.4 CCL2 相關(guān)基因功能富集分析 為了進(jìn)一步分析CCL2 共表達(dá)基因的潛在功能,本研究利用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 通路分析和GO-BP 功能富集分析。

    1.5 預(yù)后模型構(gòu)建 通過TCGA 數(shù)據(jù)庫中的LGG 數(shù)據(jù),應(yīng)用最小絕對收縮和選擇算子(LASSO)構(gòu)建CCL2 相關(guān)基因特征。一個CCL2 相關(guān)基因特征的風(fēng)險(xiǎn)評分公式是通過包括由其LASSO Cox 系數(shù)加權(quán)的個體歸一化基因表達(dá)值來建立的:∑iCoefficient(mRNAi)×Expression(mRNAi)。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用t檢驗(yàn)分析LGG 與癌旁組織中CCL2 基因的差異表達(dá)。P<0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CCL2 在LGG 組織中的表達(dá)與LGG 患者預(yù)后相關(guān)性GEPIA 網(wǎng)站分析 CCL2 在LGG 患者組織及正常組織中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示CCL2 在LGG 患者組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(圖1A);TCGA 數(shù)據(jù)庫中的LGG 患者樣本進(jìn)行生存分析,結(jié)果顯示CCL2 高表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于CCL2 低表達(dá)患者的生存時(shí)間,見圖1B。

    圖1 CCL2 在LGG 患者中的表達(dá)及預(yù)后分析

    2.2 構(gòu)建CCL2 基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 通過WGCNA 對TCGA 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析,以分析LGG 組織中與CCL2 存在共表達(dá)關(guān)系的基因。結(jié)果顯示與CCL2 存在共表達(dá)關(guān)系的有1333 個基因,屬于blue module,見圖2A、圖2B。為進(jìn)一步研究CCL2 共表達(dá)基因與腫瘤信號通路的關(guān)系,利用DAVID 網(wǎng)站對這些基因進(jìn)行KEGG-pathway 及GO-BP 富集分析,KEGGpathway 結(jié)果顯示,以上基因富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、結(jié)核、破骨細(xì)胞分化、金黃色葡萄球菌感染、用于IgA 生產(chǎn)的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、Th17細(xì)胞分化、B 細(xì)胞受體信號通路、炎癥性腸?。↖BD)、T 細(xì)胞受體信號通路及PD-L1 在癌癥中的表達(dá)和PD-1 檢查點(diǎn)通路,見圖2C。GO-BP 分析結(jié)果表明以上基因富集在防御反應(yīng)、細(xì)胞活化、免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、對生物刺激的反應(yīng)、免疫效應(yīng)過程、免疫系統(tǒng)過程的正向調(diào)節(jié)、參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞活化、骨髓白細(xì)胞活化、T 細(xì)胞活化及T 細(xì)胞增殖,見圖2D。

    圖2 WGCNA 鑒定CCL2 共表達(dá)基因

    2.3 構(gòu)建CCL2 相關(guān)基因的LGG 患者風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型 利用Cytoscape 及MCODE 分析了1333 個CCL2 相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示在1333個相關(guān)基因的蛋白互作圖中與CCL2 存在互作的蛋白有55 個,見圖3。

    圖3 MCODE 分析CCL2 的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)

    2.4 構(gòu)建CCL2 互作基因在LGG 中的Cox 單因素生存模型 為了建立CCL2 相關(guān)的LGG 患者的風(fēng)險(xiǎn)模型,對55 個CCL2 互作基因在LGG 中的預(yù)后進(jìn)行Cox 單因素生存分析。結(jié)果顯示有45 個基因與LGG患者預(yù)后相關(guān),見圖4A。

    在這45 個基因中,通過LASSO Cox 回歸分析進(jìn)一步選擇潛在的預(yù)后模型相關(guān)基因?;?0 倍交叉驗(yàn)證,選擇值0.0066 作為λ 的最小標(biāo)準(zhǔn)見圖4B,并且獲得了31 個非零系數(shù)的基因,見圖4C?;诰哂蟹橇阆禂?shù)的基因,根據(jù)每個基因表達(dá)的線性組合乘以LASSO 系數(shù)計(jì)算每個患者的風(fēng)險(xiǎn)評分(risk score):(1.2573×MYD88)+(-0.1165×CCL19)+(0.1020 ×TNFRSF1A)+(0.0581 ×TLR3)+(0.3917 ×CCR5)+(-0.0110 ×TLR7)+(1.3521 ×FCGR2A)+(1.2823 ×IL18)+(0.1340 ×CD44)+(-0.2169 ×ITGAM)+(0.0312 ×CLEC7A)+(0.1311 ×CD80)+(0.1553×CD40LG)+(-1.099×CYBB)+(0.1760×PTPRC)+(0.0346 ×TLR1)+(0.1268 ×PDCD1)+(-0.6524×C3AR1)+(-0.0112× CD163)+(0.3862×ITGAX)+(-0.3563 ×LILRB2)+(-0.1905 ×ICAM1)+(1.1956 ×CD274)+(-0.2380 ×CCL2)+(-0.1926 ×CCR1)+(0.1894 ×IL10)+(-1.8321 ×CXCL12)+(0.3136×VCAM1)+(-1.3497×SPI1)+(0.2727 ×IL1A)+(-0.3267×CXCR4)。將患者按照人數(shù)平均分為高風(fēng)險(xiǎn)評分組和低風(fēng)險(xiǎn)評分組。生存分析結(jié)果表明,高風(fēng)險(xiǎn)評分與LGG 患者的不良預(yù)后相關(guān),見圖4D。

    此外,進(jìn)行時(shí)間依賴性ROC 分析,以評估CCL2相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)評分模型的區(qū)分能力。結(jié)果顯示,1、3 和5 年生存率的AUC(ROC 曲線下面積)值分別為0.900、0.890 和0.860,說明該模型具有較好的預(yù)后區(qū)分能力,見圖4E。

    圖4 基于LGG 中CCL2 相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)評分模型

    2.5 風(fēng)險(xiǎn)評分相關(guān)的nomogram 構(gòu)建 使用R 軟件包rms,整合生存時(shí)間、生存狀態(tài)和4 個特征(risk score、age、sex 和tumor grade)的數(shù)據(jù),利用Cox 方法建立了nomogram,評估這些特征在LGG 樣本中的預(yù)后顯著性,見圖5A。nomogram 的1、3 和5 年生存率的AUC 值分別為0.930、0.910 和0.888,顯示該模型具有較好的預(yù)后區(qū)分能力見圖5B。

    圖5 Nomogram 的構(gòu)建及其ROC 曲線

    3 討論

    CCL2 是趨化因子家族中研究最多的成員之一,并且已被證明是治療各種疾病的潛在干預(yù)點(diǎn)[4]。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CCL2 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中扮演著重要角色,其在腫瘤發(fā)展和進(jìn)展中的一個重要的作用是它與腫瘤微環(huán)境中的各種正常宿主細(xì)胞的相互作用。CCL2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤脈管系統(tǒng)的發(fā)育[20],除了將巨噬細(xì)胞募集到各種癌癥的腫瘤微環(huán)境中,還能夠招募各種免疫細(xì)胞(如髓源性抑制細(xì)胞MDSCs 等)形成免疫抑制微環(huán)境,使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視并支持腫瘤細(xì)胞增殖[10]。CCL2 在腫瘤微環(huán)境中對癌癥生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。例如在三陰性炎性乳腺癌中,CCL2 過表達(dá)并通過激活Src 和Erk1/2 信號通路調(diào)節(jié)蛋白水解活性,從而導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。另有研究顯示[22],CCL2 在單核細(xì)胞誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞侵襲中充當(dāng)介質(zhì),同時(shí)增加NF-κB 活性,二者都參與介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的侵襲。一項(xiàng)對處于不同階段的前列腺癌患者的研究顯示,血清CCL2升高與骨轉(zhuǎn)移有關(guān),這表明使用血清CCL2 作為預(yù)后生物標(biāo)志物的可能性。另有研究報(bào)道[23],CCL2 在人類肝癌中過表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后有關(guān)。

    以上研究提示,腫瘤中異常表達(dá)的CCL2 可作為預(yù)后、診斷和靶向治療的分子標(biāo)志物。本研究利用生物信息學(xué)分析,重點(diǎn)關(guān)注CCL2 在LGG 中的表達(dá)及潛在功能分析,結(jié)果顯示CCL2 在LGG 組織中的表達(dá)高于正常組織;生存分析結(jié)果顯示,CCL2 的高表達(dá)患者的生存時(shí)間低于CCL2 低表達(dá)患者,表明高表達(dá)的CCL2 是LGG 患者的不良預(yù)后因素。同時(shí)進(jìn)一步分析了CCL2 的共表達(dá)基因,獲得1333 個共表達(dá)關(guān)系基因,并且在通路和功能分析的結(jié)果中顯示,CCL2 的共表達(dá)基因主要富集在免疫信號通路,表明CCL2 主要參與LGG 進(jìn)展中的免疫相關(guān)途徑。此外,為了確定與CCL2 相關(guān)基因的蛋白互作關(guān)系,從1333 個基因中篩選得到55 個相關(guān)基因,在經(jīng)過建模分析后,又從中獲得了31 個非零系數(shù)的基因作為LGG 預(yù)后分子標(biāo)記物。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分模型將LGG 患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組,同時(shí)生存分析結(jié)果表明,高風(fēng)險(xiǎn)評分與LGG 患者的不良預(yù)后呈現(xiàn)相關(guān)性。

    隨著生命科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅猛發(fā)展,生物信息分析越來越多地被用于篩選與腫瘤預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物。綜上所述,CCL2 高表達(dá)與LGG 預(yù)后不良密切相關(guān),是評估LGG 預(yù)后的有效指標(biāo),本研究成功構(gòu)建用于評估LGG 患者預(yù)后的CCL2 相關(guān)基因預(yù)后模型。

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